Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

Le néocortex fait référence à l’enveloppe externe des hémisphères cérébraux et est une structure unique aux mammifères. Le néocortex représente le siège des fonctions cognitives supérieures 1,2,3,4,5. Au cours du développement, les cellules souches neurales et les cellules progénitrices donnent naissance à des neurones dans un processus appelé neurogenèse. Les études fonctionnelles portant sur le développement du néocortex humain fournissent la base pour élucider les mécanismes sous-jacents à la régulation des cellules souches neurales humaines, aux pathologies neuronales et à l’évolution du cerveau humain ^2,6,7.

Historiquement, les études sur le développement du cerveau humain reposaient sur des approches histologiques descriptives utilisant des tissus post-mortem, les systèmes de culture tissulaire flottant plus récents permettant des investigations fonctionnelles avec des tissus fœtaux humains ^8,9. De plus, il a été démontré que le tissu cérébral fœtal humain avait la capacité de s’auto-organiser en organoïdes en expansion à long terme¹⁰. La recherche sur les tissus fœtaux a fourni des informations importantes sur le développement humain^11,12, mais la disponibilité limitée des tissus et les considérations éthiques limitent son application généralisée pour les études mécanistes du développement du cerveau humain. Au cours de la dernière décennie, des protocoles ont été développés qui permettent de générer des organoïdes neuronaux tridimensionnels à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), y compris les PSC induites humaines (hiPSC)^13,14.

Les organoïdes cérébraux présentent des caractéristiques importantes du cerveau en développement, telles que la formation de structures semblables à celles des ventricules, la polarité apicobasale, la cytoarchitecture corticale, la migration nucléaire interkinétique pendant la division de la glie radiale et la migration neuronale. Il est important de noter que ces nouveaux modèles d’organoïdes humains récapitulent les caractéristiques du cerveau humain en développement qui ne sont pas bien modélisées chez la souris, y compris les principaux types de progéniteurs neuronaux pertinents sur le plan de l’évolution, en particulier la glie radiale basale (ou glie radiale externe)^7,14,15. Plusieurs limites des protocoles précoces d’organoïdes cérébraux - telles que des problèmes d’hétérogénéité des organoïdes, un apport limité en nutriments au noyau interne et une identité régionale variée - ont été abordées dans les progrès récents du protocole et d’autres améliorations peuvent être attendues dans les années à venir 15,16,17,18,19. Les organoïdes cérébraux et corticaux humains sont rapidement devenus des modèles clés pour étudier le développement cortical humain²⁰, les troubles neurologiques 21,22,23,24 et l’évolution cérébrale 25,26,27,28,29, et pour effectuer des approches de dépistage à grande échelle 30,31,32.

Pour les manipulations génétiques aiguës, deux méthodes ont été principalement utilisées dans des modèles animaux de développement du néocortex : l’administration virale par infection des cellules cibles³³ et l’électroporation in utero ou in vitro ^34,35. L’injection d’ADN - et, plus récemment, des complexes de ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR/Cas9³⁶ - dans les ventricules latéraux, suivie d’une électroporation, offre l’avantage que des régions spécifiques du cerveau peuvent être ciblées en fonction de l’orientation des électrodes d’électroporation. L’électroporation implique de brèves impulsions électriques qui augmentent temporairement la perméabilité de la membrane cellulaire, permettant l’introduction d’ADN et d’autres molécules chargées dans les cellules. L’électroporation in utero a été réalisée pour la première fois chez la souris³⁷, où elle est rapidement devenue une méthodologie largement appliquée pour la neurobiologie du développement. La méthode a ensuite été également appliquée à d’autres espèces, telles que le rat^38,39 et le furet 40,41,42, une espèce gyrencéphale utilisée pour étudier l’expansion du néocortex et le pliage cortical 3,43,44,45.

L’électroporation est également devenue une méthode importante dans la recherche sur les organoïdes du cerveau humain⁴⁶. Dans les organoïdes cérébraux, l’électroporation a été appliquée pour visualiser la morphologie cellulaire et les axones neuronaux^14,47, pour délivrer des réactifs d’inactivation génique 22,48,49 et pour étudier la fonction des gènes par surexpression⁵⁰. La méthode n’est pas limitée aux modèles humains, mais a également été appliquée pour la modification génétique des organoïdes cérébraux de primates^50,51. De plus, l’électroporation d’organoïdes corticaux générés dans un bioréacteur de spinning Spin Ω a été décrite⁵².

Dans ce protocole, nous décrivons l’électroporation d’organoïdes corticaux humains coupés¹⁵ pour l’étude de la fonction des gènes dans le développement cortical. Les organoïdes spécifiques à une région cérébrale augmentent la reproductibilité et la cohérence, ce qui est essentiel au succès de l’analyse quantitative, par exemple dans la modélisation des maladies. Dans le protocole d’organoïde cortical humain tranché¹⁵, de puissants indices de structuration sont appliqués lors de la différenciation des iPSC pour obtenir une population homogène de progéniteurs du cerveau antérieur dorsal, qui est suivie de l’application de milieux de culture qui favorisent la croissance tissulaire avec moins de signaux instructifs ^53,54. Il a été démontré que le tranchage des organoïdes corticaux réduit la mort cellulaire résultant de la disponibilité réduite des nutriments et de l’oxygène dans le noyau de l’organoïde¹⁵. De plus, le tranchage favorise le développement de structures semblables à des ventricules contenant une glie radiale basale abondante, avec une neurogenèse soutenue conduisant à la formation d’une région élargie en forme de plaque corticale¹⁵. Le découpage répété dans ce protocole rend également ces organoïdes corticaux particulièrement adaptés à l’électroporation, car les lumières du ventricule peuvent être facilement identifiées et ciblées par injection. L’électroporation d’organoïdes corticaux tranchés a été appliquée pour étudier les régions régulatrices des gènes et l’évolution corticale^26,55.

Au cours de la procédure d’électroporation, le mélange d’injection est délivré à la lumière des structures de type ventricule. Lors de l’application d’un champ électrique pulsé, le mélange est absorbé par la glie radiale apicale qui tapisse le ventricule. Au fur et à mesure que la glie radiale apicale se divise et donne naissance à des cellules de type⁴ plus engagées, les agents électroporés sont transmis aux cellules progénitrices basales et aux neurones. La descendance électroporée est distribuée dans la zone ventriculaire (VZ) et la zone sous-ventriculaire (SVZ) après 3 jours et s’étend sur la majeure partie de la paroi corticale, y compris la région semblable à la plaque corticale (CP), 7 jours après l’électroporation au cours des stades neurogènes moyens^26,55.

Ici, nous décrivons la perturbation génique médiée par CRISPR/Cas9⁵⁶ par électroporation dans des organoïdes corticaux humains tranchés²⁶. En outre, la méthode d’électroporation peut également être appliquée pour la surexpression de gènes, la visualisation de la morphologie cellulaire et des processus cellulaires par l’expression de protéines fluorescentes, l’administration de banques de plasmides pour les tests MPRA (Massive Parallel Reporter Assays), l’administration d’outils d’édition de l’épigénome et le marquage de cellules pour l’imagerie en direct.

Toutes les expériences impliquant des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) ont été réalisées conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et approuvées par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Dresde (IRB00001473 ; IORG0001076 ; numéro d’approbation éthique SR-EK-456092021).

1. Conception d’ARN guides pour l’inactivation aiguë du gène médiée par CRISPR/Cas9

1. Concevoir une paire d’ARN guides (ARNg) ciblant le même exon avec une distance idéale de 7 à 11 pb (en évitant les multiples de 3 pb) entre les motifs adjacents protospacer (PAMs) pour augmenter la probabilité de perturbation des protéines à l’aide d’un logiciel ou d’outils en ligne.
   REMARQUE : Idéalement, les exons qui codent pour des domaines fonctionnels devraient être ciblés. Alternativement, les premiers exons du transcrit peuvent être choisis (Figure 1A). Sélectionnez les ARN guides en fonction du score d’activité (proche de 1)⁵⁷ et du score de spécificité (proche de 100 %)⁵⁸.

2. Culture de cellules souches pluripotentes induites humaines

1. Pour générer des organoïdes corticaux humains et valider la fonction de l’ARNg, utilisez la lignée hiPSC CRTDi004-A⁵⁹ qui est dérivée d’un donneur sain.
2. Cultivez les CSPi comme décrit précédemment⁶⁰ sur des plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice membranaire basale dans un milieu de cellules souches dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂). Les CSP induites doivent être passées à 80 % de confluence à l’aide d’une enzyme de dissociation unicellulaire avec supplémentation en inhibiteur de la voie ROCK (1:1 000) au cours des premières 24 heures.
   REMARQUE : D’autres lignées iPSC peuvent être utilisées pour la génération d’organoïdes et la validation de l’ARNg.

3. Extraction de l’ADN génomique à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites

1. Utilisez 2 puits de 80 % à 90 % d’hiPSC confluents d’une plaque à 6 puits pour l’extraction de l’ADN génomique. Dissociez les cellules de la plaque avec une enzyme pour former une suspension unicellulaire. Prélever les cellules dans 1 mL de milieu de cellules souches (volume total), puis tourner pendant 10 min à 600 x g et retirer le surnageant.
2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 250 μL de tampon de lyse (50 mM de TrisHCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 0,5 % de SDS, 5 mM d’EDTA dans H₂O) et 12,5 μL de protéinase K (10 mg/mL de stock). Incuber pendant 2 h à 55 °C et 250 tr/min.
3. Mélanger 100 μL de 5 mM de NaCl. Faites tourner pendant 10 min à 18 000 x g à 4 °C et transférez le surnageant dans de nouveaux tubes de réaction de 1,5 mL.
4. Ajouter 250 μL d’isopropanol, retourner les tubes plusieurs fois et faire tourner pendant 15 min à 18 000 x g à 4 °C.
5. Retirez le surnageant, lavez-le avec 500 μL d’EtOH (qualité biologie moléculaire), retournez-les et faites-les tourner pendant 10 min à 18 000 x g à 4 °C.
6. Enfin, retirez complètement le surnageant en le pipetant soigneusement et en appuyant sur les tubes de réaction ouverts sur des serviettes en papier.
7. Laissez sécher le granulé à l’air libre pendant 10 min à RT, puis dissolvez le granulé dans 100 μL d’eau sans nucléase pendant 30 min à 37 °C.
8. Mesurez la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectromètre. L’ADN génomique isolé est stable à -20 °C pendant plusieurs mois.

4. Vérification de la reconnaissance de la matrice par ARNg (in vitro)

REMARQUE : Comme première approche pour valider la reconnaissance réussie de la matrice par les ARNg, effectuez une réaction Cas9 in vitro où l’ADN double brin est clivé en deux fragments qui peuvent être distingués par électrophorèse sur gel d’agarose 40,61,62.

1. Pour générer la matrice, il faut effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec un mélange maître de PCR haute fidélité et des amorces de 10 μM sur de l’ADN génomique isolé de hiPSC (section 3) en utilisant les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, 40 cycles [98 °C, 10 s ; 60 °C, 30 s ; 72 °C, 1 min] et allongement final à 72 °C pendant 5 min.
   1. Ajustez la température de recuit en fonction des amorces PCR. Assurez-vous que l’amplicon a une taille de 800 pb à 1,5 kb avec une localisation asymétrique des sites de liaison de l’ARNg.
   2. Résoudre le produit PCR par électrophorèse sur gel sur un gel d’agarose à 1,5 %, couper la bande correspondante du gel et extraire l’ADN²⁶.
   3. Mesurez la concentration d’ADN du produit PCR extrait à l’aide d’un spectromètre.
2. Assemblez l’ARNg fonctionnel en combinant 10 μM d’ARN CRISPR (ARNcr, séquence personnalisée, stock de 100 μM) et 10 μM d’ARNg tracr (stock de 100 μM) dans un tampon duplex sans nucléase (volume total de 5 μL). Incuber le mélange pendant 5 min à 95 °C, puis le laisser refroidir à température ambiante (RT).
3. Créez le complexe ribonucléoprotéique (RNP) en combinant 10 μM de l’ARNg de l’étape 4.2 et 1 μM de l’enzyme Cas9 (de Streptococcus pyogenes, stock de 62 μM) dans du PBS pendant 15 min à RT (volume total de 25 μL).
4. Pour effectuer la réaction de digestion in vitro , mélanger 1 μM du complexe RNP (de l’étape 4.3) avec une matrice d’ADN de 0,1 μM (produit PCR de l’étape 4.1) et 1 tampon de réaction de nucléase Cas9 (contenant 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl₂, 1 mM EDTA ; pH 6,5 ; peut être stocké dans des aliquotes à -20 °C).
   1. Remplissez jusqu’à un volume final de 10 μL avec de l’eau sans nucléases.
   2. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h.
   3. Ajouter 2 mg/mL de protéinase K et incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 56 °C pour libérer le substrat d’ADN de l’enzyme Cas9. Conservez le mélange réactionnel digéré à 4 °C ou -20 °C jusqu’à l’analyse finale.
      REMARQUE : L’utilisation d’un rapport molaire de 10:1 de substrat Cas9-RNP :DNA est recommandée pour obtenir la meilleure efficacité de clivage. Diluer le produit PCR dans de l’eau exempte de nucléases à la concentration requise, si nécessaire. En tant que contrôle négatif, un mélange réactionnel dépourvu de l’ARNg ou de l’enzyme Cas9 peut être emporté.
5. Visualisez les produits clivés par électrophorèse sur gel d’agarose sur un gel d’agarose à 2 %.
   REMARQUE : Idéalement, deux bandes de tailles différentes devraient être visibles et la bande matrice devrait avoir disparu ou être fortement réduite pour des ARNg efficaces (Figure 1B).

5. Vérification de la fonction de l’ARNg dans les cellules souches pluripotentes induites humaines

REMARQUE : Il est recommandé de tester l’efficacité des ARNg ciblant la même lignée cellulaire à partir de laquelle les organoïdes corticaux seront générés²⁶. Pour cela, les complexes RNP contenant les ARNg pertinents sont co-transfectés avec un plasmide d’expression GFP dans des hiPSC, les cellules sont cultivées pendant 3 jours, et l’ADN génomique est ensuite isolé pour l’analyse de séquençage. Pour chaque test d’ARNg, environ 200 000 cellules sont nécessaires. Les cellules ne doivent pas être confluentes à plus de 70 % à 80 % et doivent avoir été passées au moins deux fois après la décongélation. Il est important d’emporter avec eux un contrôle négatif (gLACZ)^36,63 et une condition fictive (solution de nucléofection sans RNP).

1. Modifier le milieu de la hiPSC pour inclure l’inhibiteur de ROCK (1:1 000) 2 h avant l’expérience afin d’augmenter la viabilité des cellules dans une hotte de culture cellulaire.
2. Enduire le nombre approprié de puits d’une plaque à 6 puits avec une matrice de membrane basale.
3. Démarrez l’unité nucléofectrice (« unité X » pour les bandelettes de 16 puits) et sélectionnez le programme « Cellules ES, H9 » préprogrammé (impulsion CB150). Sélectionnez le nombre approprié de puits de la bande.
4. Préparez les complexes RNP en combinant 24 μM d’ARNcr et 24 μM d’ARNrc dans un tampon duplex.
   1. Incuber à 95 °C pendant 5 min, puis laisser refroidir à RT, comme décrit à l’étape 4.2.
   2. Pendant ce temps, diluez l’enzyme Cas9 à 8 μM dans du PBS.
   3. Combinez 3 μL d’ARNg et 3 μL de Cas9, et incubez 15 min à RT pour assembler le RNP.
      REMARQUE : Un rapport molaire de 3:1 gRNA :Cas9 donne une efficacité de clivage optimale. Pour tester les ARNg par paire, préparez chaque RNP séparément et combinez 1,5 μL de chaque RNP à la fin.
5. Pendant l’incubation RNP de 15 min, préparez la hiPSC pour la nucléofection sous une hotte de culture cellulaire.
   1. Remplacer l’enrobage de la membrane basale par 1,5 mL de milieu de cellules souches complété par un inhibiteur de ROCK (1:1 000) et 1 fois pénicilline/streptomycine par puits.
   2. Préparez la solution de nucléofection sous forme de mélange maître sur de la glace en suivant les instructions du fabricant.
   3. Détachez les hiPSC de la plaque pour former une suspension unicellulaire (comme décrit dans la section 2) et comptez les cellules avec une coloration au bleu de trypan dans une chambre de comptage Neubauer.
   4. Granulez 200 000 cellules vivantes par paire d’ARNg à 600 x g pendant 5 min.
6. Dans le capot de culture cellulaire, sur de la glace, ajoutez 3 μL de RNP à 20 μL de solution de nucléofection plus 0,2 μg/μL de plasmide pCAG-GFP.
7. Remettre les cellules granulées en suspension dans les 23 μL du mélange de nucléofection final et les transférer dans 1 puits d’une bande de nucléofection de 16 puits sur de la glace.
8. Une fois que toutes les conditions sont dans la bandelette, placez-la dans l’unité de nucléofecteur X à l’extérieur de la hotte et appuyez sur le bouton Start pour lancer la nucléofection.
9. Par la suite, transportez la bandelette de nucléofection sous le capot de culture cellulaire et transférez les cellules nucléofectées dans la plaque à 6 puits préparée en rinçant les puits de la bande avec un peu de milieu de la plaque.
10. Cultivez le hiPSC pendant 3 jours, en changeant de milieu contenant 1 fois par jour de pénicilline/streptomycine. Après 24 heures, l’inhibiteur de ROCK n’est plus nécessaire.
11. Vérifiez la présence d’un signal GFP à l’aide d’un microscope fluorescent conventionnel (Figure 1C).
    1. Le jour 3, triez et collectez les cellules GFP positives par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
    2. Préparez le tampon de tri avec 2 % de FBS dans du PBS et maintenez-le à 4 °C.
    3. Refroidissez une centrifugeuse de table à 4 °C. Préparez des tubes de réaction de 1,5 mL avec un tampon de tri de 50 μL contenant un inhibiteur de ROCK (1:1 000) pour le prélèvement de cellules après FACS sur de la glace et des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL avec des bouchons de crépine sur de la glace.
    4. Fabriquer des suspensions unicellulaires des cellules nucléofectées.
    5. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de cellules souches contenant un inhibiteur de ROCK (1:1 000) par échantillon et centrifuger à 600 x g pendant 5 min.
    6. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de tri avec inhibiteur de ROCK (1:1 000), puis ajouter 0,4 μL de DAPI (2 ng/μL) pour identifier les cellules vivantes par FACS.
    7. Pipetez la solution cellulaire à travers le capuchon de la crépine des tubes à fond rond refroidis pour éliminer tout amas de cellules résiduels.
       REMARQUE : Le DAPI peut compromettre la viabilité cellulaire au fil du temps, il est donc préférable d’ajouter du frais à chaque échantillon avant le tri.
    8. Triez 10 000 cellules vivantes positives à la GFP (DAPI négative) dans les tubes de réaction de 1,5 mL préalablement préparés avec 50 μL de tampon de tri contenant un inhibiteur de ROCK (sur glace).
12. Après FACS, extrayez directement l’ADN génomique des cellules triées.
    1. Faites tourner les cellules collectées et triées dans le tampon de tri à 600 x g pendant 10 min.
    2. Retirer le surnageant et prélever la pastille cellulaire dans 250 μL de tampon de lyse plus 12,5 μL de protéinase K par échantillon.
    3. Continuez comme décrit à la section 3.
    4. Enfin, dissolvez la pastille d’ADN dans 50 μL d’eau exempte de nucléases.
13. Effectuez une PCR pour générer un modèle pour le séquençage de Sanger, comme décrit à l’étape 4.1. Comme contrôle, utilisez l’ADN de la condition gLACZ et les amorces ciblant le gène d’intérêt (mêmes amorces que celles utilisées dans la section 4). Extrayez les bandes appropriées de l’électrophorèse sur gel d’agarose, purifiez-la sur une colonne et envoyez-la pour le séquençage de Sanger.
14. Aligner les résultats du séquençage de Sanger à l’aide d’un alignement global par paires.
    REMARQUE : Le ciblage réussi peut être identifié par des signaux superposés ou des séquences incomplètes résultant d’insertions/délétions aléatoires autour du site de liaison de l’ARNg (Figure 1D).

6. Génération d’organoïdes corticaux humains tranchés

REMARQUE : Les organoïdes corticaux humains (hCO) sont générés selon la méthode des organoïdes néocorticaux tranchés (SNO), comme décrit précédemment en détail^15,60.

1. Détachez de petites colonies de hiPSC de 1 puits d’une plaque de 6 puits avec 1 mg/mL de collagénase en les incubant pendant 30 à 40 minutes à 37 °C dans un incubateur. Pendant ce temps, enduire une nouvelle plaque à 6 puits avec la matrice de membrane basale.
   1. Arrêtez l’enzyme avec 1 mL de milieu de cellules souches et prélevez les colonies avec une pointe à large calibre dans 5 mL de milieu de cellules souches dans un tube conique de 15 mL.
      REMARQUE : Toutes les étapes mentionnant « pointes de pipette à perce large » peuvent également être effectuées avec des pointes coupées à une ouverture d’au moins 2 mm de diamètre.
   2. Une fois que les colonies se sont installées au fond, retirez l’ancien milieu et remplacez-le par un milieu de cellules souches frais.
   3. À l’aide d’une pointe à large calibre, répartissez uniformément les colonies sur la plaque de 6 puits enduite avec 1,5 mL de milieu de cellules souches par puits.
   4. Cultivez le hiPSC pendant 2 à 3 jours dans des conditions standard.
2. Une fois que les colonies de hiPSC ont atteint environ 1,5 mm de diamètre, détacher de nouveau toutes les colonies avec 1 mg/mL de collagénase en les incubant jusqu’à 1 h à 37 °C.
   1. Arrêtez l’enzyme avec 6 mL de milieu 1¹⁵ et prélevez les colonies détachées dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’embouts à large calibre.
   2. Une fois que les colonies se sont installées, retirez l’ancien milieu et lavez-le avec 5 ml de milieu pour le cerveau antérieur 1.
   3. Enfin, transférez les colonies dans une plaque à 6 puits à fixation ultra-basse contenant 3 ml de milieu de cerveau antérieur 1 par puits avec des pointes à large diamètre et laissez-les former des corps embryoïdes (EB). Cette étape indique le jour 0 du protocole organoïde cortical humain. À partir de là, suivez le protocole tel que publié¹⁵.
3. Le jour 7, intégrer les EB dans une matrice membranaire basale, avec environ 20 EB par « biscuit » et cultiver pendant 1 semaine dans un milieu de cerveau antérieur 2 ^{à 15}. Au jour 14, libérez mécaniquement les organoïdes de la matrice et poursuivez la culture dans des plaques d’attache ultra-basses à 6 puits dans le milieu du cerveau antérieur 3^{à 15} sur un agitateur orbital à 120 tr/min.
4. À partir du 35e jour, 1 % de matrice membranaire basale v/v est complété par le milieu.
5. À la semaine 6, incorporer les organoïdes dans de l’agarose à bas point de fusion à 3 % et couper sur un vibratome en tranches de 500 μm d’épaisseur (figures 2A, B), ce qui favorise l’apport d’oxygène et de nutriments dans l’ensemble des organoïdes. Si nécessaire, répétez le tranchage des organoïdes toutes les 4 semaines.
6. À partir du jour 70, culture d’organoïdes dans le milieu du cerveau antérieur 4¹⁵.

7. Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés

REMARQUE : Les organoïdes corticaux humains peuvent être injectés et électroporés dès que des structures ressemblant à des ventricules sont visibles, à partir de la semaine 2. Pour les organoïdes à un stade plus avancé (semaine 5 et plus), l’électroporation est plus efficace et la viabilité des cellules est meilleure lorsque la procédure est effectuée 2 jours après le tranchage des organoïdes^26,55. Après le tranchage, les structures ressemblant à des ventricules sont faciles à identifier, ce qui facilite la procédure d’injection (Figure 2C, D). De plus, les structures de type ventricule restent partiellement ouvertes pendant un certain temps après le tranchage, ce qui permet à l’excès de solution d’injection de s’échapper, ce qui protège l’intégrité de la ceinture de jonction adhérente tapissant les ventricules. Le calendrier de tranchage peut être décalé pour correspondre à la chronologie expérimentale. Le tranchage doit être répété toutes les 3-4 semaines pour les cultures à long terme.

1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté pour les injections sur un extracteur microcapillaire avec les réglages suivants : P 500, chaleur 600, traction 30, vitesse 40, temps 1. Rangez les capillaires dans une grande boîte de Pétri à l’aide de ruban adhésif pour la fixation.
2. Le jour de l’électroporation, préparez fraîchement le complexe RNP CRISPRR/Cas9 comme décrit à l’étape 5.4 avec une concentration finale de 24 μM RNP. La co-électroporation du plasmide pCAG-GFP de 0,1 μg/μL (ou de tout autre rapporteur fluorescent) permet l’identification des cellules électroporées. De plus, ajoutez 0,1 % de solution Fast Green dans l’eau au mélange d’injection final, ce qui permet de confirmer la bonne distribution du mélange.
   REMARQUE : Faire des mélanges séparés pour chaque gène d’intérêt et le témoin gLACZ .
3. Préchauffer la solution de Tyrode (un paquet de sel de Tyrode, 1 g de NaHCO₃, 13 mL de 1 M HEPES pH 7,25 dans 1 L de dH₂O) à 37 °C. Conservez le reste de la solution de Tyrode à 4 °C pendant plusieurs mois.
4. Sélectionnez l’hCO avec des structures ventriculaires bien développées (Figure 2E) et jetez tous les organoïdes qui ne présentent pas de structures ventriculaires (Figure 2F). Transférez jusqu’à 10 organoïdes dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant la solution de Tyrode et conservez les hCOs restants dans l’incubateur.
5. Remplissez un microcapillaire en verre avec 10 μL de solution d’injection à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur et ouvrez le capillaire en pinçant l’extrémité fine à l’aide d’une pince à épiler. Vérifiez si le capillaire est ouvert en libérant un peu de mélange d’injection dans la solution de Tyrode. Effectuez les injections avec un micro-injecteur en continu avec déclenchement contrôlé via une pédale de commande.
6. Insérez le capillaire au centre des structures ressemblant à des ventricules (Figure 2C) et injectez 0,2 à 0,5 μL du mélange en appuyant sur l’interrupteur au pied.
   REMARQUE : Jusqu’à 5 ventricules peuvent être injectés par hCO, avec un total de 7 à 8 hCO traités par répétition. Idéalement, les ventricules orientés vers l’extérieur du hCO doivent être ciblés, car ils sont généralement les mieux développés (Figure 2G, H).
7. Utilisez des pinces fines pour pousser l’organoïde contre afin de restreindre les mouvements. Ne saisissez pas réellement les organoïdes (Figure 2C).
8. Après l’injection, à l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, transférer 1 à 2 organoïdes dans une chambre d’électroporation contenant la solution de Tyrode (Figure 2C, D).
9. Orientez les organoïdes injectés vers les électrodes de manière à ce que les cellules gliales radiales apicales situées dans les régions ressemblant à des ventricules faisant face à l’extérieur de l’organoïde soient ciblées.
10. Fixez les câbles à la chambre d’électroporation avec le côté injecté de l’organoïde face au pôle positif (anode ; Figure 2D).
11. Appuyez sur le bouton Pulse de l’électroporateur pour électropoler avec cinq impulsions de 38 V pendant 50 ms chacune à des intervalles de 1 s.
    REMARQUE : Les paramètres d’électroporation peuvent dépendre de l’électroporateur disponible et peuvent avoir besoin d’être optimisés.
12. Répétez les étapes d’injection et d’électroporation jusqu’à ce que le nombre souhaité d’organoïdes soit traité.
13. Prélever les organoïdes électroporés dans un milieu à RT jusqu’à ce que tous les échantillons pour la même condition aient été traités. Assurez-vous qu’ils ne sont pas à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 30 minutes au total.
14. Par la suite, retournez les hCO électroporés dans le milieu de culture approprié et cultivez-les sans agiter pendant les premières 24 heures.
    REMARQUE : Après 2 à 3 jours, le signal GFP doit être visible dans les hCO électroporés sous un stéréoscope fluorescent (Figure 2H). Le moment de l’analyse après l’électroporation doit être choisi en fonction de la question biologique à laquelle il faut répondre. Après 3 à 7 jours, les cellules positives à la GFP sont localisées dans les zones VZ, SVZ et CP^15,60.

8. Fixation et cryosectionnement d’organoïdes corticaux humains électroporés

1. Fixer les organoïdes électroporés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 30 min à RT dans un tube de réaction de 2 mL.
   ATTENTION : Le PFA est toxique et cancérigène. Effectuez toutes les étapes impliquant du PFA sous une hotte. L’utilisation de gants en nitrile et de lunettes de sécurité est fortement recommandée.
2. Laver une fois dans du PBS pendant 5 minutes et conserver dans du saccharose à 30 % filtré stérilement dans du PBS à 4 °C jusqu’à ce que le tissu soit complètement saturé de saccharose.
3. Intégrez des organoïdes fixés dans un milieu d’enrobage pour des échantillons de tissus congelés plus 15 % de saccharose dans du PBS en blocs de glace sèche.
4. Préparez des coupes de 20 à 30 μm dans un cryostat et collectez le tissu sur des lames adhésives^26,64.
   REMARQUE : Le protocole peut être interrompu soit une fois que les organoïdes fixés sont dans du saccharose (stable à 4 °C pendant plusieurs mois), soit incorporé dans un milieu d’enrobage (les blocs congelés peuvent être conservés dans des sacs hermétiques à -20 °C pendant plusieurs mois à plusieurs années).

9. Analyse immunohistochimique d’organoïdes corticaux humains électroporés

1. Pour l’analyse immunohistochimique^26,64, effectuer le prélèvement de l’antigène dans un tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium, 0,05 % de polysorbate 20 po dH₂O, pH 6,0) pendant 1 h à 70 °C au bain-marie.
2. Lavez une fois dans du PBS pendant 5 min, puis séchez brièvement les lames et encerclez les sections avec un stylo à cire.
3. Tremper avec 0,1 M de glycine dans du PBS (pH 7,4) pendant 30 min à RT, puis le laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
4. Couvrir les sections dans un tampon bloquant (10 % de sérum de cheval, 0,1 % d’octoxinol 9 dans du PBS) et incuber pendant 30 minutes à RT.
5. Préparez les anticorps primaires dans un tampon bloquant et incubez sur des sections pendant une nuit à 4 °C.
6. Le lendemain, laver trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, incuber avec des anticorps secondaires et du DAPI dans un tampon bloquant pendant 1 h à RT, et laver à nouveau trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
7. Montez les lames dans le support de montage et prenez l’image à l’aide d’un microscope fluorescent (Figure 3).
   REMARQUE : Il est recommandé d’inclure un anticorps contre le fluorophore utilisé dans le mélange d’injection pour identifier les cellules ciblées, car le signal natif est souvent éteint après la fixation. Les anticorps et les colorants utilisés pour la coloration par immunofluorescence, tels qu’ils sont représentés à la figure 3, sont énumérés dans le tableau 1.

10. Vérification de l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9 au niveau de la protéine

1. Pour vérifier l’inactivation au niveau de la protéine, effectuez une immunohistochimie de la protéine cible sur les organoïdes électroporés (Figure 3I).
2. Imagez à la fois le témoin gLACZ et les organoïdes ciblés en utilisant les mêmes paramètres pour permettre la comparaison de l’intensité de fluorescence (Figure 3I, J). Faites-le d’une manière spécifique à la zone pour comparer l’effet sur les différents types de cellules du néocortex en développement. Comptez les cellules dans ImageJ/Fiji (plugin Cell Counter) ou en segmentant à l’aide du plugin StarDist ⁶⁵.

L’ablation génique médiée par CRISPR/Cas9 nécessite la conception d’ARNg. Généralement, le ciblage de l’un des premiers exons d’un gène d’intérêt avec une paire d’ARNg espacés de 7 à 11 pb (en évitant les multiples de 3 pb) fonctionne bien (Figure 1A). Comme premier test, l’efficacité de la reconnaissance de la matrice par les ARNg peut être interrogée in vitro à l’aide d’une matrice PCR 26,40,62. Un ciblage efficace et une coupe médiée par Cas9 sont visibles dans la réduction de l’ADN matrice et l’apparition de produits d’ADN clivés sur un gel d’agarose (Figure 1B). D’autres tests d’ARNg peuvent être effectués dans la lignée iPSC utilisée pour la génération d’organoïdes corticaux. Cela nécessite la nucléofection des iPSC, qui peuvent être visualisées par une expression rapporteuse fluorescente réussie (Figure 1C). L’efficacité du ciblage du locus d’intérêt peut être vérifiée par le séquençage de Sanger, ce qui aboutit à un chromatogramme qui se termine brusquement ou se superpose autour du site de ciblage (Figure 1D), résultant d’un spectre d’indels provenant de la réparation de cassures double brin par jonction d’extrémité non homologue66. Les tests d’efficacité de l’ARN Guide in vitro et dans les cellules iPSC aident à sélectionner des paires d’ARNg efficaces pour l’ablation de gènes dans les organoïdes corticaux.

Avant l’électroporation, les organoïdes corticaux sont tranchés, ce qui permet d’identifier les lumières du ventricule pour l’injection du mélange d’électroporation (Figure 2A-C). Les organoïdes injectés sont ensuite transférés dans la chambre d’électroporation (Figure 2D). Pour l’électroporation, il faut utiliser des organoïdes corticaux avec des structures ventriculaires bien développées (Figure 2E), tandis que les organoïdes corticaux dépourvus de structures visibles doivent être écartés (Figure 2F). Le mélange d’électroporation contient un colorant qui permet de visualiser les ventricules injectés pendant la procédure (Figure 2G). Après 1 à 3 jours de culture, les ventricules ciblés avec succès sont visibles par le signal GFP natif sous un microscope fluorescent (Figure 2H).

Pour une analyse histologique approfondie, l’immunohistochimie des cryosections peut être réalisée. Idéalement, plusieurs ventricules ciblés sont présents dans un organoïde cortical électroporé (Figure 3A,B). Les électroporations les plus optimales ciblent les structures semblables à celles d’un ventricule dans la région externe de l’organoïde faisant face à l’extérieur (Figure 3C), car ce sont généralement les ventricules les plus élargis. Dans certains cas, l’électroporation peut entraîner une mort cellulaire excessive (Figure 3D,E), par exemple, lorsque les concentrations de plasmides sont trop élevées ou que les paramètres d’électroporation ne sont pas optimaux. Les électroporations orientées vers l’intérieur de l’organoïde (Figure 3F) impliquent souvent des régions moins étendues des structures de type ventricule par rapport à l’extérieur. D’après notre expérience, il est utile de concentrer l’analyse quantitative sur des régions définies de l’organoïde pour réduire la variabilité. Parfois, l’électroporation peut provoquer une perturbation de la surface apicale (Figure 3G), par exemple, lorsque le volume d’injection est trop élevé, provoquant une rupture des ventricules, ou lorsque les impulsions électriques sont trop fortes, entraînant une délamination cellulaire. Enfin, lorsque deux ventricules adjacents sont ciblés (Figure 3H), il peut devenir difficile d’attribuer les limites des zones corticales et l’origine des cellules ciblées.

L’immunohistochimie peut être utilisée pour vérifier le succès de l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9 au niveau de la protéine dans les cellules d’intérêt (Figure 3I), illustré ici par le ciblage de la protéine PCGF467 du Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). L’intensité du signal peut être analysée dans des cellules GFP positives dans des conditions de contrôle par rapport aux conditions expérimentales (Figure 3J). Alternativement, si aucun anticorps approprié n’est disponible, les cellules ciblées peuvent être isolées par FACS à partir d’organoïdes corticaux60 et analysées plus en détail par Sanger ou Next Generation Sequencing36. De plus, la réduction des niveaux de protéines peut également être analysée à l’aide du Western blot.

Figure 1 : Conception et validation de l’ARN guide pour l’inactivation aiguë du gène médiée par CRISPR/Cas9. (A) Illustration schématique de la stratégie de conception de l’ARN guide (ARNg), avec deux ARNg ciblant un exon d’un gène d’intérêt. Les flèches noires indiquent les amorces PCR pour la préparation des matrices utilisées pour la validation de l’ARNg. (B) Validation de l’efficacité de l’ARNg in vitro. Les matrices amplifiées par PCR ont été digérées avec des complexes RNP. Lors d’un clivage réussi, deux bandes de tailles différentes sont visibles après l’électrophorèse sur gel (à gauche), tandis que le modèle reste non coupé pour les ARNg à faible efficacité (à droite). (C) Image en fond clair (à gauche), fluorescence GFP (au milieu) et images fusionnées (à droite) de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) 3 jours après la nucléofection avec le complexe RNP et un plasmide GFP. Barres d’échelle : 350 μm. (D) Validation de l’efficacité de l’ARNg dans les hiPSC par séquençage de Sanger de l’ADN amplifié à partir de cellules GFP positives. Lors du clivage réussi de l’ADN double brin, les pistes de séquençage montrent des signaux superposés à partir du site cible de l’ARNg (en haut, KO1). En cas d’échec du ciblage, la trace de séquence d’ADN reste inchangée (en bas, KO2) par rapport au contrôle LACZ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés. (A) Illustration schématique montrant le flux de travail pour l’électroporation d’organoïdes corticaux humains (hCO). Tout d’abord, les hCOs sont coupés en tranches de 500 μm d’épaisseur. Deux jours plus tard, le mélange RNP contenant un plasmide d’expression de GFP et Fast Green est injecté dans les lumières de structures de type ventricule, préférentiellement dans la région externe des hCO. Pour l’électroporation, les hCO sont placés dans la chambre d’électroporation. Après plusieurs jours de culture, un signal GFP peut être détecté dans les zones électroporées. (B) Images de coupe vibratome de hCOs. Les organoïdes sont noyés dans 3 % d’agarose à bas point de fusion dans un milieu en bloc (à gauche). Le bloc est coupé en tranches de 500 m d’épaisseur (au milieu). Les organoïdes tranchés sont transférés dans la boîte de culture à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage (à droite). (C) Images montrant l’injection du mélange contenant le RNP, le pCAG-GFP et 0,1 % de Fast Green dans les structures ventriculaires des organoïdes. Les organoïdes sont immergés dans la solution de Tyrode et le mince capillaire de verre est inséré dans la lumière du centre des structures en forme de ventricule (à gauche). Les pinces sont utilisées pour stabiliser les organoïdes (gauche et milieu). Les ventricules à l’extérieur des organoïdes sont ciblés (au milieu). Les organoïdes injectés sont transférés dans la chambre d’électroporation, ou plus tard dans la boîte de culture, avec des pointes de pipette à large diamètre (à droite). (D) Images de la chambre d’électroporation, qui est composée d’une boîte de Pétri en verre et de deux lames métalliques collées au verre. Les lames métalliques servent d’électrodes et contiennent des trous pour fixer les câbles à connecter à l’électroporateur. La face injectée du hCO, visible à travers une ombre verte, doit faire face à l’anode (pôle positif, câble rouge) (à droite). (E) Images représentatives des hCOs montrant des structures bien développées ressemblant à des ventricules. L’anneau plus clair représente la zone ventriculaire. Le cercle plus foncé au centre de la structure en forme de ventricule représente la lumière et doit être ciblé pour l’injection. (F) Des images représentatives d’hCOs dépourvues de structures ventriculaires bien développées, que nous recommandons de ne pas inclure pour d’autres expériences. (G) Images représentatives des hCO après injection du mélange d’électroporation, dans lesquelles les zones ciblées sont visibles en vert rapide (flèches orange). (H) Image représentative de hCO montrant le signal GFP natif 24 h après l’électroporation. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse immunohistochimique d’organoïdes corticaux humains tranchés électroporés. (A) Schéma représentant un organoïde cortical humain électroporé (hCO) avec un signal fluorescent vert. (B) Coloration DAPI (gris) et immunofluorescence pour GFP (vert) d’un hCO cryosectionné avec plusieurs ventricules électroporés, 7 jours après l’électroporation. (C-H) Exemples d’images de différents résultats d’électroporation, colorés pour la GFP (vert) et les noyaux (DAPI, gris). (C) Une électroporation optimale avec des noyaux intacts (voir encadré 1, D), une structure ventricule non interrompue et des cellules électroporées dans la zone orientée vers l’extérieur de l’organoïde, qui est généralement la plus dilatée. (E) Exemple de hCO présentant une mort cellulaire massive dans la zone électroporée (voir aussi encadré 2, D), caractérisée par de petits noyaux denses en DAPI et déformés. (F) Une électroporation réussie dirigée vers l’intérieur de l’organoïde, qui est souvent plus difficile à interpréter en raison des zones ressemblant à des plaques corticales qui fusionnent avec les ventricules adjacents. (G) Structures ventriculaires perturbées au centre de la zone électroporée (flèche orange). (H) Un exemple de hCO contenant plusieurs ventricules plus petits qui sont partiellement fusionnés et, par conséquent, difficiles à quantifier. (I) Coloration DAPI (gris) et immunofluorescence pour GFP (vert) et PCGF4 (magenta) 7 jours après électroporation d’un complexe RNP ciblant LACZ (gLACZ KO, à gauche) ou PCGF4 (gPCGF4 KO, droite) pour l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9. Les cellules encerclées mettent en évidence l’intensité réduite de PCGF4, indiquant une ablation génique réussie. Un signal uniforme peut être vu dans la commande LACZ (à gauche). (J) Le graphique montre l’intensité quantifiée de PCGF4 après immunofluorescence dans les cellules positives à la GFP pour le contrôle (gLACZ KO) et la KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) par rapport à l’expression médiane de PCGF4 dans la condition gLACZ. Chaque point représente une cellule. Données provenant de 3-4 organoïdes de deux lots différents (gris et noir) de la même lignée hiPSC. p < 0,0001, test de Mann-Whitney. Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal (B, C) ou fluorescent (E-I) à balayage laser. Les images représentent des projections d’intensité maximale de piles z de 10 à 15 m d’épaisseur. Les lignes pointillées blanches indiquent la surface apicale faisant face à la lumière du ventricule et les surfaces externes des hCO. Les lignes pointillées orange indiquent la bordure VZ/SVZ dans les ventricules fusionnés. Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des anticorps et colorants et de leur dilution utilisés pour la coloration par immunofluorescence.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.