Article de méthode

Reprogrammation d’un modèle de macrophages dérivés de monocytes humains pour des essais in vitro

DOI :

10.3791/67651

⸱

18 avril 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les monocytes et les macrophages sont des cellules immunitaires très plastiques et reprogrammables cruciales pour la santé et la maladie. Ils détectent et répondent à un large éventail de stimuli en adoptant des programmes de différenciation et des phénotypes spécifiques. Nous avons normalisé un modèle in vitro pour étudier la polarisation et la reprogrammation des macrophages, ce qui constitue un outil précieux pour la recherche.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules de la lignée monocyte-macrophage sont multifonctionnelles et se trouvent dans presque tous les tissus du corps. Ils coordonnent les phases d’initiation et de résolution de l’immunité innée et adaptative, affectant de manière significative l’immunité protectrice et les lésions pathologiques à médiation immunitaire. Alors que les macrophages résidents des tissus sont des acteurs clés dans le maintien de l’homéostasie à l’état d’équilibre, de grandes quantités de monocytes sont recrutées dans le sang périphérique dans les tissus à la suite de lésions ou d’agressions inflammatoires. Les macrophages dérivés de monocytes (M-DM) peuvent se différencier en de nombreux sous-types dynamiques, et leurs phénotypes et fonctions dépendent de l’environnement tissulaire local.

Pour comparer différents stimuli ou conditions environnementales lors de la différenciation et de la polarisation du M-DM, nous avons normalisé un modèle in vitro de M-DM humain non polarisé M0 et de certains macrophages cardinaux polarisés par cytokines, M1 dérivé de l’IFNγ/LPS, M2a dérivé de l’IL-4 et M2c dérivé de l’IL-10 ou de la dexaméthasone, afin d’analyser la reprogrammation biaisée du M-DM par cytométrie en flux et PCR en temps réel. Nous avons constaté que CD64, CD206, CD163, CD14 et MERTK peuvent clairement discriminer M0 non polarisé et M1, M2a et M2c polarisés par cytométrie en flux. De plus, nous avons défini IRF1 et CXCL10 comme des gènes spécifiques pour les transcrits M1-, IRF4-, CCL22-et TGM2 classiques dérivés de l’IFNγ/LPS pour les transcrits M2a dérivés de l’IL-4, et le gène MERTK pour le M2c dérivé de la dexaméthasone. Pour résumer, notre protocole M-DM standardisé pourrait donner la carte cardinale in vitro pour analyser la différenciation et la polarisation du M-DM humain sous divers stimuli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les macrophages, identifiés pour la première fois par Metchnikoff pour leur capacité phagocytaire, sont des cellules anciennes fondamentales à la vie des métazoaires. Omniprésents chez les mammifères adultes, ils présentent une remarquable diversité anatomique et fonctionnelle. En tant que partie intégrante du système phagocytaire mononucléaire, aux côtés des cellules dendritiques et des monocytes, les macrophages jouent un rôle crucial dans divers processus biologiques, du développement et de l’homéostasie aux réponses immunitaires contre les agents pathogènes1,2. Les macrophages résidents, spécialisés pour leur microenvironnement tissulaire, agissent comme des sentinelles, surveillant la santé des tissus et répondant aux changements physiologiques et aux menaces externes. Leur plasticité limitée est considérée comme une adaptation évolutive pour maintenir l’homéostasie tissulaire. En revanche, les monocytes recrutés sont plus flexibles et peuvent se différencier en divers phénotypes de macrophages pendant l’inflammation. Cette double influence de l’inflammation et de la niche tissulaire façonne la diversité fonctionnelle des macrophages 3. Ainsi, selon le milieu tissulaire local, les macrophages dérivés des monocytes (M-DM) peuvent se différencier en de nombreux sous-types. Les métabolites locaux, les facteurs de croissance, les cytokines et l’interaction cellule-cellule4,5,6 décrivent leurs phénotypes et fonctions. De plus, les macrophages sont des producteurs clés de facteurs qui atténuent l’inflammation et favorisent la revascularisation et la réparation des tissus7,8.

Étant donné qu’au moins trois armes principales contrôlent la polarisation (extrinsèque, intrinsèque et conditions environnementales tissulaires), la polarisation des macrophages doit être considérée comme multidimensionnelle2. Les principaux obstacles et pièges dans la description de la différenciation et de la polarisation des macrophages sont les conditions expérimentales hétérogènes dans la littérature et l’absence de consensus sur la définition des termes des macrophages dans les expériences in vitro et in vivo9. Néanmoins, une certaine unification des normes expérimentales a commencé pour divers scénarios expérimentaux.

Pour mieux comprendre le champ des macrophages humains, nous avons besoin de modèles in vitro standardisés et bien définis de M-DM pour la liaison, la différenciation, la polarisation, le phénotype et la reprogrammation, ainsi que des fonctions spécifiques. Notre objectif était d’établir un modèle in vitro standardisé de M-DM humain non polarisé, de M0 et de macrophages polarisés par cytokine pour étudier la reprogrammation biaisée du M-DM par cytométrie en flux et PCR en temps réel. Bien que la polarisation des macrophages soit un processus dynamique en raison de leur grande plasticité et de leur capacité à intégrer plusieurs signaux de leur environnement, nous avons caractérisé ici le M-DM non polarisé (M0) et certains états de polarisation in vitro, comme le pro-inflammatoire classique, communément reconnu également comme M1, induit avec l’IFNγ et le LPS. De même, les macrophages M2 de réparation tissulaire et de régulation peuvent être définis comme M2a lorsqu’ils sont induits par l’IL-4 et M2c lorsqu’ils sont stimulés par la dexaméthasone ou l’IL-10. Ces états polarisants capturent un instantané du large spectre du milieu M-DM dans le temps et l’espace, mais nous donnent quelques points cardinaux pour définir la carte analytique où localiser les conditions d’essai.

Malgré la combinaison complexe et dynamique de marqueurs de surface et de programmes transcriptionnels, lors de l’analyse in vitro du M-DM, nous avons défini que CD64, CD206, CD163, CD14 et MERTK peuvent séparer l’état M0 non polarisé, du M1 induit par l’IFNγ/LPS, du M2a induit par l’IL-4 et de l’IL-10 ou de la dexaméthasone induits par cytométrie en flux. De plus, l’expression des gènes IRF1 et CXCL10 a été définie comme spécifique de M1 induit par l’IFNγ/LPS ; transcrits spécifiques d’IRF4, de CCL22 et de TGM2 pour M2a dérivé de l’IL-4 ; et MERTK pour M2c dérivé de la dexaméthasone, fixant des points cardinaux supplémentaires pour comparer la reprogrammation asymétrique du M-DM confronté à différents stimuli ou même co-cultivé avec d’autres types de cellules.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les donneurs de sang volontaires sains ont fourni un consentement éclairé écrit, et l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnelle de l’Académie nationale de médecine (IMEX-CONICET-ANM) Argentine. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

REMARQUE : Les PBMC sont isolés à partir de 40 mL de sang périphérique anticoagulé avec du citrate de sodium à 3,8 % et à l’aide de la centrifugation à gradient de densité Ficoll-Hypaque (1077). Ce protocole est réalisé dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité BSL2.

  1. Transférez l’échantillon de sang périphérique anticoagulé reçu dans des tubes appropriés de 15 ml ou 50 ml pour la centrifugation.
  2. Centrifuger des échantillons de sang à 200 × g pendant 15 min (accélération : 4 décélération : 2, lorsque le maximum est de 5) à température ambiante pour obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) sur le dessus et une fraction cellulaire, y compris les globules rouges et blancs en dessous. Voir Figure 1.
  3. Transférez la fraction supérieure (PRP) dans des tubes de 15 mL (si le plasma est stocké), et centrifugez à 600 × g pendant 10 min (accélération et décélération maximales) pour obtenir la fraction plasmatique finale sans plaquettes. Stockez le plasma à -20 °C.
  4. Diluer la fraction cellulaire obtenue lors de la première centrifugation, de 2x (minimum) à 3x (maximum) à l’aide d’une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (1x PBS) préchauffée à température ambiante. Homogénéisez-le doucement et utilisez cette fraction diluée pour la centrifugation à gradient de densité Ficoll-Hypaque.
  5. Transvaser 15 mL de Ficoll-Hypaque dans un tube stérile de 50 mL. Ensuite, ajoutez soigneusement et lentement 30 ml de sang dilué sur le Ficoll, en évitant de mélanger les phases. Si vous travaillez avec 10 ml ou moins de sang dilué, transférez 4 ml de Ficoll-Hypaque dans un tube de 15 ml, puis ajoutez les 10 ml d’échantillon de sang dilué.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour obtenir la fraction mononucléaire.
  6. Centrifuger le tube contenant le Ficoll plus le sang dilué à 600 × g pendant 25 min (accélération : 1 ; Décélération : 0) à température ambiante.
  7. Retirer une partie de la couche supérieure jaune à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 3 ml. Ensuite, prélever soigneusement l’interface (fraction mononucléaire « annulaire ») formée entre la couche supérieure jaune et la couche de Ficoll à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Cet « anneau » contient les cellules mononucléées (PBMC) d’intérêt.
    REMARQUE : Une partie de la phase plasma restante peut être collectée, mais assurez-vous d’éviter la phase Ficoll, car elle pourrait être toxique pour les PBMC.
  8. Transférez les PBMC collectés dans un nouveau tube de 15 mL contenant au moins 3 mL de PBS stérile 1x. Ensuite, complétez avec le volume correspondant de 1x PBS stérile à 12-15 ml. Centrifuger les PBMC à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 min.
  9. Jetez le surnageant et lavez à nouveau les PBMC. Remettez la pastille en suspension en ajoutant 1 mL de PBS stérile, puis complétez à 12-14 mL avec du 1x PBS stérile supplémentaire. Centrifuger les tubes à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 min.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de PBMC dans 1 PBS stérile contenant 2 % de sérum de veau fœtal inactivé (1 PBS-2 % de FBS) et porter le volume à 10 mL. Utilisez un compteur automatique de cellules ou comptez les cellules, en préparant une suspension cellulaire 1:5 diluée dans du froid stérile 1x PBS puis (1:2) dans du Trypan Blue pour obtenir une dilution finale de 1:10. Utilisez un microscope optique pour compter.
  11. Faites tourner la suspension PBMC à 300 × g pendant 5 min à 8-10 °C. Remettre les cellules en suspension dans le volume souhaité de 1x PBS-2 % FBS stérile et froid pour obtenir une concentration finale de 108 cellules/mL. Laissez ces cellules à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.
    REMARQUE : Si les PBMC collectés ne sont pas utilisés le même jour, il est recommandé de les congeler dans un flacon cryogénique à 10à 8 cellules/mL dans un milieu de congélation approprié (90 % de FBS contenant 10 % de diméthylsulfoxyde de méthyle, DMSO). Conserver à -80 °C dans un récipient en polyéthylène glycol pendant la nuit pour permettre aux cellules de geler lentement, minimisant ainsi les dommages cellulaires. Le lendemain, transférez les cellules dans une boîte de stockage et laissez-les à -80 °C pendant quelques jours ou transférez-les dans un réservoir d’azote liquide pour une longue période de stockage.

2. Tri des monocytes CD14+ à l’aide de billes magnétiques

REMARQUE : La quantité de monocytes CD14 trouvée dans les PBMC de donneurs sains est variable en fonction de l’âge et du sexe. Lorsqu’il est disponible, utilisez un compteur de cellules pour obtenir le pourcentage de monocytes dans chaque échantillon, puis calculez le nombre de PBMC nécessaires pour trier les monocytes CD14 requis. Si aucun compteur de cellules n’est disponible, 10 % des monocytes par échantillon PBMC pourraient être considérés comme une approche large4,6,7,10,11,12,13.

Les monocytes CD14+ sont isolés à l’aide d’un kit de sélection CD14 positif humain5. Nous avons normalisé le protocole d’isolement en utilisant 1 à 2 × 107 PBMC dans 100 μL de réaction ; Utilisez ce rapport pour les nombres plus élevés. Le volume de réaction minimum suggéré est de 100 μL, même avec un nombre de cellules inférieur à 1 × 10 7 PBMC.

  1. Préparez une suspension cellulaire PBMC à une concentration de 1-2 × 10 8 cellules/mL dans 1 tampon PBS-2 % FBS contenant 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (1 tampon PBS-2 % FBS-1 mM EDTA) et transférez la quantité souhaitée de PBMC dans un tube en polystyrène à fond rond de 5 ml.
  2. Ajouter 10 μL de cocktail Positive Selection pour 100 μL de suspension cellulaire, bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 15 min.
  3. Ajouter 10 μL de nanoparticules magnétiques par 100 μL de suspension cellulaire, pipeter vigoureusement de haut en bas plus de 5 fois pour suspendre uniformément les nanoparticules magnétiques, et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE : Le vortex n’est pas recommandé.
  4. Ajoutez 1 tampon EDTA PBS-2 % FBS-1 mM pour porter le volume total de la suspension cellulaire à 2,5 mL. Pipetez doucement les cellules du tube de haut en bas 2 à 3 fois. Insérez le tube dans le trieur à aimants et mettez-le à l’écart pendant 5 min.
  5. Prenez l’aimant et retournez-le ainsi que le tube en un mouvement continu, en éliminant la fraction surnageante. Les cellules marquées magnétiquement resteront à l’intérieur du tube. Laissez l’aimant et le tube inversés pendant 2-3 s, puis tournez-les verticalement vers le haut.
    REMARQUE : Laissez les gouttes suspendues de la bouche du tube ; Ne les secouez pas et ne les épongez pas.
  6. Retirez le tube de l’aimant et ajoutez à nouveau 2,5 ml de 1 tampon EDTA PBS-2 % FBS-1 mM dans le tube. Pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas 2 à 3 fois pour la mélanger. Réinsérez le tube dans l’aimant et mettez-le à l’écart pendant 5 min.
  7. En un mouvement continu, inversez à la fois l’aimant et le tube, en éliminant la fraction surnageante. Retirez le tube de l’aimant et remettez les cellules en suspension dans une quantité appropriée de 1x tampon PBS-2 % FBS (sans EDTA). Les cellules sélectionnées positivement sont maintenant prêtes à l’emploi.
    REMARQUE : Un total de deux séparations de 5 minutes sont nécessaires dans l’aimant.
  8. Laver les cellules CD14 triées à l’aide d’un tampon PBS-2 % FBS, en portant la suspension cellulaire à 12-14 mL pour diluer tout EDTA restant, puis centrifuger à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 min.
  9. Jetez le surnageant et répétez le lavage en remettant en suspension la pastille cellulaire avec 1 ml de tampon PBS-2 % FBS d’abord, puis en augmentant le volume à 12-14 ml. Centrifuger les tubes à 600 × g (accélération et décélération maximales) pendant 10 min.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension les monocytes CD14 sélectionnés positifs dans 2 mL de 1 tampon PBS-2 % FBS. Utilisez le compteur automatique de cellules ou comptez les cellules en diluant la suspension cellulaire (1:5) dans du froid stérile 1x PBS puis (1:2) dans du Trypan Blue à l’aide d’un microscope optique. Laisser les cellules sur de la glace jusqu’à la préparation de la culture.
    REMARQUE : La pureté cellulaire peut être testée par cytométrie en flux, en prélevant 50 μL de la suspension cellulaire et en la colorant pour les cellules CD14+ (clone HCD14). Une pureté supérieure à 90 % est recommandée.
  11. Pour la culture, faire tourner la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min à 8-10 °C. Remettre la pastille en suspension à une concentration de 10 à6 cellules/mL à l’aide de RPMI 1640 complété par 10 % de FBS inactivé et 1 % de pénicilline-streptomycine (RPMI-10 % FBS-1 % P/S).
    REMARQUE : Il est essentiel d’utiliser un FBS de haute qualité, à faible teneur en endotoxines et inactivé par la chaleur. Maintenir toujours sur de la glace pour éviter l’adhérence des monocytes à la paroi en plastique avant le placage.

3. Différenciation et polarisation des macrophages dérivés des monocytes (M-DM)

REMARQUE : La culture M-DM est réalisée en encroûtant 2,5 × 105 monocytes CD14+ dans des plaques à 48 puits contenant 500 μL de RPMI-10 % FBS-1 % P/S et cultivées dans un incubateur humidifié à 37 °C avec du CO2 (5 %) pendant 7 jours. Choisissez des plaques traitées pour améliorer l’adhérence des monocytes à la plaque.

  1. Définir toutes les conditions expérimentales à exécuter, y compris les puits pour le M-DM basal (M0), l’inflammatoire M1, la réparation tissulaire M2a, le M2c régulateur, et les conditions de test souhaitées.
  2. Pipeter 250 μL de la suspension cellulaire préparée à l’étape 2.11 pour ensemencer 2,5 × 105 monocytes CD14+ dans chaque puits.
  3. Ajouter 250 μL de RPMI-10 % FBS-1 % P/S plus 50 ng/mL de M-CSF dans chaque puits pour compléter les 500 μL de volume total.
  4. Incuber la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 4 jours pour permettre la première étape de différenciation des macrophages.
    REMARQUE : Vérifiez périodiquement la différenciation de la culture cellulaire pour voir si des changements morphologiques se sont produits comme prévu ou s’il existe des cellules non attachées indésirables.
  5. Remplacer la moitié du milieu de culture (250 μL de RPMI-10 % FBS-1 % P/S) le jour 4 de la culture M-DM. Ajouter des cytokines ou des réactifs pour les conditions polarisantes et les cultiver pendant 3 jours (le critère d’évaluation est le jour 7) : LPS (1 ng/mL) plus IFNγ (50 ng/mL) pour M1, IL-4 (40 ng/mL) pour M2a, IL-10 (50 ng/mL) ou dexaméthasone (0,1 μM) pour M2c.
  6. Récoltez les M-MS le jour 7 pour effectuer une caractérisation phénotypique, collectez-les pour l’expression de l’ARNm comme indiqué dans les deux étapes suivantes, ou effectuez un test fonctionnel.

4. Caractérisation phénotypique de surface dans le M-DM polarisé par cytométrie en flux

  1. Jeter le volume total du milieu de culture (500 μL d’une plaque de 48 puits) et ajouter 200 μL de 1 tampon EDTA PBS-2 % FBS-1 mM pour la récolte cellulaire. Incuber pendant 20 min sur de la glace, puis ajouter 200 μL de 1x PBS-2 % FBS pour diluer le tampon EDTA. Prélevez le M-DM en le pipetant de haut en bas dans des microtubes de 1,5 ml. Lavez une fois ces cellules récoltées avec 1x PBS-2 % FBS et centrifugez à 800 × g pendant 3 min.
  2. Remettre en suspension la pastille de M-DM avec 200 μL de 1x PBS-5 % FBS et les transférer dans une microplaque à fond rond à 96 puits pour les bloquer à température ambiante pendant 15 min. Centrifuger les cellules à 800 × g pendant 3 min.
  3. Préparez la combinaison appropriée d’anticorps directement conjugués dans 1x PBS-2 % FBS. Teindre chaque puits ou condition (1x) avec 50 μL du panel d’anticorps et incuber à 4 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
    REMARQUE : Ici, le panel d’anticorps était composé de CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 et MERTK-biotine plus Streptavidin-PE. La concentration mesurée d’anticorps est indiquée dans le tableau 1.
  4. Laver le M-DM taché en ajoutant 150 μL de 1x PBS et centrifuger à 800 × g pendant 3 min.
  5. Pour mesurer la viabilité cellulaire, ajoutez 100 μL du colorant de viabilité fixable Zombie Violet (1:1 000 dans 1x PBS) et incubez à 4 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
  6. Laver les cellules colorées en ajoutant 100 μL de 1x PBS et centrifuger à 800 × g pendant 3 min. Répéter la procédure de lavage en utilisant 200 μL de 1x PBS.
  7. Fixez en remettant en suspension la pastille de M-DM avec 100 μL de réactif fixateur (du kit de fixation/perméabilisation) et en les incubant pendant 20 min sur de la glace et dans l’obscurité.
    REMARQUE : Pour obtenir une fixation appropriée, il est essentiel d’homogénéiser correctement la pastille de cellule.
  8. Lavez le M-DM en ajoutant 100 μL de 1x PBS-2 % FBS et centrifugez-le à 800 × g pendant 3 min. Répétez la procédure de lavage en utilisant 200 μL de 1x PBS-2 % FBS.
  9. Remettez en suspension la pastille de M-DM dans 200 μL de 1x PBS et faites passer les cellules colorées dans le cytomètre en flux.

5. Profil de programme génique pour discriminer la polarisation M-DM par qPCR

REMARQUE : Au jour 7 de la culture, 2,5 × 105 M-MS peuvent être récoltés à l’aide du réactif d’extraction d’ARN pour l’isolement d’ARN total de haute qualité. L’isolement de l’ARN peut également être effectué à l’aide de méthodes alternatives, telles que l’extraction d’ARN sur colonne et un kit d’élution.

  1. Jeter le volume total du milieu de culture et le M-DM lysé en ajoutant directement 350 μL du réactif d’extraction. Homogénéisez et transférez cette suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 mL exempt de RNase/DNase et poursuivez l’isolement de l’ARN.
    REMARQUE : Si l’isolement de l’ARN n’est pas effectué le même jour, l’échantillon de l’étape 5.1 peut être stocké à 4 °C pendant la nuit ou à -20 °C pendant un an maximum.
  2. Pour permettre une dissociation complète du complexe de nucléoprotéines, incuber les échantillons homogénéisés de l’étape 5.1 pendant 5 min à 25 °C
  3. Ajouter 70 μL de chloroforme à chaque échantillon. Fermez solidement chaque tube pour éviter les fuites et mélangez soigneusement le contenu en secouant le tube. Incuber les échantillons pendant 2 à 3 minutes, puis centrifuger les échantillons à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Cette étape séparera complètement les phases en une phase inférieure phénol-chloroforme, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore.
    REMARQUE : Le volume de chloroforme est basé sur un rapport de 0,2 mL de chloroforme pour 1 mL de réactif d’extraction utilisé pendant l’étape de lyse.
  4. Transférez la phase aqueuse contenant l’ARN dans un nouveau microtube de 1,5 mL sans RNase-/DNase.
    REMARQUE : Laissez derrière vous un petit volume lors de la prise de la phase aqueuse pour éviter de transférer l’une des couches interphasiques ou organiques.
  5. Ajouter 175 μL d’isopropanol à chaque échantillon pour précipiter l’ARN. Incuber pendant 10 min à 4 °C ou toute la nuit à -20 °C.
    REMARQUE : Le volume d’isopropanol est basé sur un rapport de 0,5 mL d’isopropanol par mL de réactif d’extraction initial.
  6. Centrifuger les échantillons à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille blanche semblable à un gel d’ARN total précipitera au fond du tube. Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette.
  7. Laver l’ARN en remettant en suspension la pastille blanche semblable à un gel dans 350 μL d’éthanol à 75 % (1 mL pour 1 mL de réactif d’extraction (v/v) utilisé pour la lyse).
    REMARQUE : L’ARN peut être stocké dans de l’éthanol à 75 % jusqu’à 1 an à -20 °C ou jusqu’à 1 semaine à 4 °C.
  8. Agiter brièvement la pastille remise en suspension et centrifuger à 7 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette. Faites sécher à l’air libre ou sous vide la pastille d’ARN pendant 5 à 10 min
    REMARQUE : Pour solubiliser l’ARN, évitez de trop sécher la pastille d’ARN.
  9. Remettez le granulé en suspension dans 20 à 30 μL d’eau exempte de RNase en le pipetant de haut en bas. Incuber dans un bain-marie ou un bloc chauffant réglé à 55-60 °C pendant 10-15 min. Procédez à la mesure de la concentration d’ARN et stockez-le à -70 °C.
  10. Effectuez la transcription inverse (copie de l’ADNc) en utilisant 100 à 500 ng d’ARN (minimal et maximal, respectivement) dans 20 μL de volume de réaction à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
  11. Exécutez les réactions PCR en temps réel en utilisant 1 μL d’ADNc (5-25 ng).
    1. Préparez le mélange réactionnel pour chaque tube (1x) en utilisant 5 μL de mélange vert SYBR (2x), 0,2 μL de chaque amorce (avant et arrière) et 3,6 μL d’eau sans nucléases. Mettez à l’échelle tous les composants en fonction du nombre d’échantillons. Mélangez soigneusement le mélange réactionnel et distribuez 9 μL dans chaque tube qPCR et enfin 1 μL d’ADNc pour atteindre le volume total final de 10 μL.
    2. Programmez le protocole de cyclage thermique sur un instrument de PCR en temps réel comme suit : 2-3 min à 98 °C (1x) ; 5-15 s à 98 °C plus 15-30 s à 60 °C (35-40x) ; enfin incluez l'analyse de la courbe de fusion (65-95 °C) avec un incrément de 0,5 °C à 2-5 s/pas ou utilisez le réglage par défaut de l'instrument.
      REMARQUE : Cette réaction a été normalisée à l’aide de l’enrobé universel SYBR Green. Les amorces recommandées pour l’analyse de la polarisation M-DM sont énumérées dans le Tableau 2.
  12. Normaliser les résultats en utilisant comme gène de référence le facteur d’élongation de traduction eucaryote 1 alpha 1 (EEF1A1), et vérifier la spécificité des produits amplifiés grâce à l’analyse des courbes de dissociation.
    REMARQUE : L’analyse de la courbe de dissociation permet de confirmer la présence d’un seul produit d’amplification qPCR dans la réaction.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sur la base de nos travaux de caractérisation des macrophages depuis plusieurs années, nous avons mis en place une combinaison précise de marqueurs qui distingue clairement les différents sous-ensembles de M-DM in vitro. Les marqueurs phénotypiques ont été sélectionnés sur la base de la littérature et d’un large dépistage préalable que nous avions précédemment effectué 9,14,15,16,...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La différenciation, l’activation et la polarisation des macrophages sont devenues un élément central de l’immunologie, de l’homéostasie tissulaire, de la pathogenèse des maladies et de la résolution de l’inflammation. De plus, l’image émergente selon laquelle les macrophages tissulaires peuvent être dérivés de monocytes circulants dans des conditions d’homéostasie perturbée souligne la nécessité de modèles M-DM précis caractérisés par des phénotypes définis, des programmes transcriptionnels et des voies d’activation.

...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par l’Agence nationale pour la promotion de la science et de la technologie (ANPCyT-FONCYT) par le biais des subventions PICT 2018-3070 et 2021-I-A-00807 à l’E.A.C.S. et PICT 2021-I-A-00716 à l’A.E.E., et par le Conseil national de la recherche scientifique et technique (CONICET) par le biais de la subvention PIP 2022-0763 et par l’Université de Buenos Aires par le biais du Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 pour A.E.E., E.A.C.S. et A.E.E. sont enquêteurs de carrière au CONICET.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris Alexa Fluor 488 anti-humain  ; CD206 Clone d’anticorps 15-2BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 321113 ; RRID :AB_571874
Clone d’anticorps CD64 anti-humain de souris APC 10.1BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 305013 ; RRID :AB_1595539
APC/Cy7 rat anti-souris/humain CD11b Clone d’anticorps M1/70BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 101226 ; RRID :AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USACat# 554714kit de fixation/perméabilisation
Biotine anti-humain MERTK Clone d’anticorps 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 367616 ; RRID : AB_2721500
Équipement CFX-Connect  ;Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis
Kit de sélection CD14 positif pour l’homme ; Cocktail EasySep Sélection Positive ; Nanoparticules magnétiques EasySep ; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadaCat# 18058
FACS Canto cytometer  ;Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, États-Unis.
Sérum fœtal bovin, qualifié, Nouvelle-ZélandeGibco&commerce ;   ; Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA États-Unis  ;		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID :SCR_008520
GraphPad Prism  ;   ;GraphPad Software Inc.RRID :SCR_002798
kit de synthèse d’ADNc iScript, comprend un mélange de réaction de transcription inverse 5x, une transcriptase inverse iScript, de l’eau sans nucléaseBio-Rad, Hercules, CA, États-UnisCat# 1708891
Cytomètre spatial CyFlow Partec  ;Sysmex Partec, Allemagne
PE StreptavidinBioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 405203
souris PE/Cy7 Clone d’anticorps CD14 humain HCD14BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 325618 ; RRID :AB_830691
Souris PerCP/Cy5.5 Clone d’anticorps anti-humain CD163 GHI/61BioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 333607 ; RRID :AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco&trade ;   ; Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA États-Unis  ;		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, il contient des anticorps Sso7d fusió ; n polymérase, dNTPs, MgCl2, SYBR Green I Dye, exhausteurs, stabilisants et un mélange de colorants de référence passifs (y compris ROX et fluorescéine).Bio-Rad, Hercules, CA, États-UnisCat# 1725271
Réactif TriZolThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, États-Unis  ;		Cat#  ; 15596026réactif d’extraction d’ARN
Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend, San Diego, CA, États-Unis.Cat# 423113

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

Articles connexes