Flux de travail d’imagerie et d’analyse à haut débit pour l’évaluation des phénotypes et des états de prolifération des cellules cutanées dans des échantillons de tissus

Summary

La combinaison de l’IBEX (Iterative-Bleaching-Extends-Multiplexity) et d’un test commercial de marquage nucléotidique (Click-iT EdU) permet la détection et la catégorisation de types de cellules en division dans des processus hautement dynamiques dans des coupes de tissus murins congelés fixes. De plus, un nouveau pipeline de traitement d’images open source permet l’acquisition et l’analyse d’images à haut débit.

Abstract

Les lésions cutanées déclenchent une cascade régénérative complexe qui engage différents types de cellules. Parmi celles-ci, les cellules gliales périphériques jouent un rôle essentiel pour assurer le succès du processus de réparation. Cependant, notre compréhension de ces processus reste incomplète en raison des limites des technologies actuelles. Par conséquent, la méthode IBEX (Iterative-Bleaching-Extends-Multixity) a été utilisée pour caractériser les changements de la composition cellulaire de la peau à l’aide d’anticorps dirigés contre les protéines exprimées par les principaux types de cellules et structures impliquées dans la régénération des tissus. Il est important de noter que les anticorps dirigés contre les marqueurs de prolifération cellulaire sous-estiment souvent le nombre de cellules en division dans la peau. Pour pallier cette limitation, la chimie Click-iT EdU a été combinée à la méthode IBEX, permettant une caractérisation détaillée des types de cellules en prolifération. À l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif entièrement automatisé, un flux de travail à haut débit a été développé pour l’imagerie itérative d’échantillons sectionnés en plaques à 24 puits. Au-delà de l’extension de la méthode IBEX pour évaluer les états cellulaires in situ avec Click-iT EdU, un nouveau pipeline de traitement d’images open source a également été introduit pour effectuer la correction, l’assemblage et l’enregistrement d’images, et peut être utilisé par des chercheurs sans expérience approfondie de la programmation. En outre, une documentation détaillée sur le traitement et la visualisation des données d’imagerie hautement multiplexées (à l’aide de logiciels d’analyse d’images conventionnels, y compris Fiji et QuPath) est également fournie. En résumé, ce protocole met en évidence la polyvalence du protocole IBEX et démontre son adaptation à une plate-forme d’imagerie conventionnelle établie. Notamment, la combinaison d’IBEX avec le marquage Click-iT EdU permet la détection et la catégorisation des types de cellules en division active dans les tissus intacts et au cours de processus hautement dynamiques à résolution spatiale.

Introduction

La peau est le plus grand organe du corps humain et la barrière primordiale pour protéger le corps de l’environnement extérieur¹. Par conséquent, il est exposé à une pléthore de défis externes qui compromettent sa fonction barrière. Par conséquent, la peau a développé des mécanismes complexes pour restaurer l’intégrité et la fonctionnalité des tissus après des dommages. La cicatrisation des plaies cutanées se déroule en trois étapes qui se chevauchent : l’inflammation, la prolifération et la maturation/remodelage. Ces trois étapes impliquent plusieurs types de cellules différentes, telles que les fibroblastes dermiques et les cellules immunitaires, qui agissent ensemble pour restaurer les propriétés biologiques initiales du tissu cutané lésé ^1,2,3.

La peau est un organe densément innervé, et il est connu que l’innervation nerveuse est cruciale pour^{un processus de} réparation réussi. Outre la signalisation axonale ^4,7,8, la glie périphérique, qui enveloppe normalement les axones, participe à la régénération tissulaire réussie ^9,10,11. Cependant, le rôle des types de cellules sous-représentés, tels que les cellules gliales périphériques, reste mal compris dans les processus dynamiques tels que la régénération des tissus cutanés. Pour mieux déterminer la fonction de ces cellules, il est essentiel d’analyser le microenvironnement cellulaire et les types de cellules voisines avec lesquelles elles peuvent interagir au cours du processus de régénération. De plus, la prolifération cellulaire étant une étape clé de la régénération des tissus, il est important de détecter et de classer avec précision les types de cellules proliférantes tout au long du processus de réparation.

Des méthodes d’imagerie optique multiplexées à haut contenu, telles qu’IBEX¹², ont été développées pour caractériser la composition cellulaire, visualiser et quantifier les interactions cellule-cellule, et disséquer les modèles microenvironnementaux dans les tissus complexes à une résolution spatiale. Alors que d’autres méthodes de multiplexage nécessitent des instruments spécialisés et des réactifs exclusifs, l’un des avantages particuliers d’IBEX est qu’il peut être établi à des coûts relativement faibles en utilisant des anticorps, des réactifs et des microscopes disponibles dans le commerce et accessibles dans un environnement de recherche standard. Alors que les anticorps anti-Ki-67, souvent utilisés dans les panels IBEX, marquent de manière fiable les types de cellules proliférantes dans de nombreux tissus^13,14, le nombre de cellules Ki-67-positives (Ki-67+) s’est avéré sous-estimé par rapport à d’autres méthodologies dans des coupes de tissus congelés fixes de plaies cutanées aiguës de murins. Par conséquent, nous avons combiné la chimie Click-iT EdU avec IBEX et avons constaté que le nombre de cellules EdU⁺ représente plus précisément le nombre total de cellules proliférantes obtenues par d’autres méthodologies.

De plus, en utilisant un microscope confocal à disque rotatif entièrement automatisé, un flux de travail à haut débit a été établi pour l’imagerie itérative de coupes de tissus placées dans une plaque à 24 puits. Les images résultantes sont ensuite traitées en combinant plusieurs outils Python open source dans un nouveau pipeline de traitement d’images qui corrige les images pour un éclairage inégal, effectue l’assemblage des tuiles individuelles et, finalement, le recalage des images. Dans le détail, la bibliothèque BaSiCPy¹⁵ a été utilisée pour la correction de l’éclairage, la bibliothèque m2stitch pour l’assemblage des images et la corrélation croisée de phase pour l’enregistrement du cycle. Les images enregistrées sont enregistrées au format OME-TIFF et peuvent ensuite être chargées dans des logiciels d’analyse d’images conventionnels, tels que Fiji¹⁷ et QuPath¹⁸, où les images sont ensuite traitées, et la catégorisation des types de cellules et d’autres mesures, telles que les calculs d’intensité et de distance, peuvent être effectuées. Dans l’ensemble, le présent protocole nous a permis d’effectuer une caractérisation détaillée et très efficace des principaux types de cellules de la peau en régénération, avec un accent particulier sur le microenvironnement cellulaire entourant la population de cellules gliales périphériques.

Protocol

L’élevage, l’hébergement et l’expérimentation des animaux ont été menés selon les directives de l’office vétérinaire du canton de Zurich, en Suisse.

1. Plaies cutanées de pleine épaisseur (jour 0)

1. Induire des souris âgées de 8 à 10 semaines avec 5 % d’isoflurane dans 70 % d’O₂ et le maintenir avec 2,5 % d’isoflurane.
2. Rasez la peau du dos et nettoyez-la soigneusement.
3. Désinfectez avant l’opération à l’aide d’un savon antibactérien et d’une solution d’EtOH à 70 %.
4. Appliquer une analgésie préopératoire par injection sous-cutanée de buprénorphine (30 μg∙mg^∙kg−1).
5. Générer quatre plaies excisionnelles circulaires de pleine épaisseur de 5 mm de diamètre sur la peau du bas du dos de chaque animal, deux de chaque côté, à 1 cm de la ligne médiane de l’animal et à environ 2 cm l’une de l’autre¹⁹.
6. Effectuer une analgésie postopératoire avec un traitement de 3 jours à la buprénorphine par l’eau de boisson (9 μg/mL avec 2 % de saccharose).
7. Laissez les plaies cicatriser sans pansement.
8. Prélever les plaies à des moments définis pour l’examen histologique et l’analyse par cytométrie en flux.
9. Pour le protocole IBEX, disséquez et fixez les tissus cutanés avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 °C pendant la nuit. Utilisez une capsule de biopsie disponible dans le commerce pour éviter l’enroulement des échantillons pendant la fixation. Cryoprotégez les tissus fixés à 4 % de PFA dans du saccharose à 30 % dans du PBS pendant la nuit à 4 °C. Transférez les tissus dans un mélange 1:1 de 30 % de saccharose avec du composé O.C.T pendant 2 h à RT et enfin incorporez-les dans O.C.T avant de les congeler dans de l’isopentane.

2. Préparation de l’échantillon (jour 1)

1. Enduire la plaque à 24 puits de 200 μL de gélatine d’alun de chrome pendant 15 min sur un agitateur à bascule. Ensuite, retirez complètement la gélatine et séchez les puits enrobés pendant 60 min dans un four à 40 °C. Enduire le double des puits nécessaires en secours. Ajouter 2 mL de PBS par puits.
   REMARQUE : Assurez-vous que le revêtement est complètement sec avant de placer le tissu. Les puits peuvent également être enduits la veille et séchés pendant la nuit à RT. Une fois enrobés, ne conservez pas les puits enrobés au réfrigérateur ou au congélateur, et pour de meilleurs résultats, utilisez la plaque enduite à 24 puits dans un délai de 1 à 2 jours.
2. Coupez le tissu incrusté dans l’O.C.T à une épaisseur de 15 à 30 μm au niveau du cryostat et transférez-le rapidement dans un puits enrobé contenant 2 mL de PBS.
   REMARQUE : Le tissu peut être transféré à l’aide d’une spatule métallique ou d’une pince.
3. Retirez délicatement le PBS à l’aide d’une pipette de 1 ml, en visant à maintenir la section de tissu centrée dans le puits. Pour ce faire efficacement, aspirez lentement le PBS des bords du puits, en ajustant la position de la pipette au besoin pour éviter que le tissu ne se déplace.
   REMARQUE : Un placement précis du tissu est essentiel pour le succès du protocole. Une fois que le tissu adhère à la surface enduite, il ne peut pas être repositionné.
4. Faites sécher les sections de tissu pendant 1 h dans un four à 37 °C.

3. Blocage tissulaire, réaction EdU Click-iT et immunomarquage des anticorps, IBEX cycle 1 (jour 1)

1. Réhydrater avec 1 mL de PBS pendant 5 min.
2. Perméabiliser le tissu avec 500 μL de Triton à 0,5 % dans du PBS pendant 30 min à RT.
3. Lavez brièvement le mouchoir 2 fois avec du PBS.
4. Effectuez la réaction Click-iT, selon les instructions du fabricant, pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Gardez les échantillons à l’abri de la lumière.
5. Lavez brièvement le mouchoir 2 fois avec du PBS.
6. Bloquez le tissu pendant 1 h à température ambiante (RT) à l’aide d’un tampon de blocage.
   REMARQUE : Ici, 10 % de sérum d’âne dans PBS a été utilisé pour cette expérience, mais cela peut être ajusté si nécessaire ; Tout tampon bloquant compatible avec les protocoles d’immunomarquage standard convient.
7. Appliquer les anticorps primaires (dilués dans un tampon bloquant ; voir le tableau des matières) pour le 1er cycle pendant la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Le blocage et l’immunomarquage peuvent également être effectués pendant ~1 h à l’aide d’un micro-ondes non chauffant, comme décrit dans Radtke et ^al.12. Cependant, pour les plaies cutanées, le meilleur rapport signal/bruit est obtenu lorsque les anticorps primaires sont incubés pendant la nuit. Les coupes de tissus immunomarqués peuvent être stockées dans le PBS pendant plusieurs jours avant l’imagerie. L’imagerie est recommandée le lendemain pour une qualité de signal optimale.

4. Immunomarquage des anticorps secondaires et contre-coloration nucléaire (jour 2)

1. Lavez les puits avec 3 x 1 mL de PBS.
2. Incuber la section de tissu avec la coloration secondaire des anticorps anti-lapin (1:300) dans une solution bloquante, avec la contre-coloration nucléaire Hoechst 1:1 000, pendant 1 h à RT dans l’obscurité.
3. Laver 3 x 5 min avec 1 mL de PBS à RT.
4. Laissez ~500 μL de PBS dans chaque puits et amenez la plaque au microscope.
   REMARQUE : Il peut s’agir d’un point d’arrêt : les échantillons sont stables pendant plusieurs jours à 4 °C, mais le rapport signal/bruit est le meilleur lorsqu’il est imagé dans les 24 heures suivant l’immunomarquage.

5. Configuration du microscope et imagerie du premier cycle IBEX (Jour 2)

1. Connectez-vous au microscope et chargez le logiciel, puis connectez-vous au profil utilisateur.
2. Entrez dans la configuration d’acquisition (ouverte via Projection | Configuration de l’acquisition) pour la configuration du protocole et l’acquisition d’images.
3. Utilisez le bouton d’éjection pour charger la plaque dans le microscope.
4. Nettoyez le fond de la plaque à 24 puits avec de l’éthanol à 70 % juste avant de placer la plaque dans le microscope. Cliquez sur le bouton Charger la plaque pour charger la plaque dans le microscope.
5. Sélectionnez le grossissement et le mode d’acquisition souhaités sous Objectif et appareil photo. Comme mode d’acquisition , sélectionnez le mode confocal à fente de 51 μm .
   REMARQUE : Ici, un objectif à immersion dans l’eau 20x avec une ouverture numérique de 0,95, et un disque rotatif avec des trous d’épingle de 50 μm, espacés de 250 μm ont été utilisés pour l’expérience.
6. Sous l’onglet Plaque , sélectionnez le modèle de plaque utilisé.
7. Allez à l’onglet Planches/Sites à visiter. Sous les options du site, cliquez sur Nombre fixe de sites. Choisissez le nombre de colonnes et de rangées de sorte qu’à peu près tout le puits soit couvert. Cliquez sur Sites de chevauchement 10 %.
   REMARQUE : Ce bouton doit être activé pour assurer la couture des carreaux individuels.
8. Sélectionnez uniquement le premier puits rempli pour l’acquisition en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le puits correspondant sur la carte du puits. Les puits sélectionnés sont verts et les puits désélectionnés sont gris.
9. Déplacez la platine à l’endroit où le tissu devrait se trouver en cliquant avec le bouton gauche sur le premier puits rempli de la carte des plaques et sur un site près du centre de la carte. Recherchez une couleur plus foncée du puits et du site indiquant la position actuelle.
10. Allez dans l’onglet Acquisition . Sélectionnez les options Activer la mise au point laser et Acquérir la série Z.
11. Allez dans l’onglet Acquisition/Autofocus . Pour la mise au point automatique de puits à puits, sélectionnez l’option Mise au point sur la plaque et le fond du puits , et pour la mise au point automatique du site, sélectionnez l’option Tous les sites .
12. Allez dans l’onglet Longueurs d’onde et choisissez le nombre de colorants à imager dans le cycle actuel. Recherchez le nombre correspondant de nouveaux onglets qui s’ouvrent sous l’onglet Longueurs d’onde .
13. Allez dans le premier onglet de longueur d’onde. Sous Éclairage, sélectionnez les paramètres de filtre les mieux adaptés au fluorophore d’intérêt (par exemple, choisissez DAPI si Hoechst a été utilisé).
14. Choisissez Laser avec décalage z pour le positionnement z et cliquez sur le bouton Calculer le décalage pour définir la hauteur d’imagerie correcte. Une série d’images sera acquise à différentes positions z. Choisissez celui où l’échantillon est le mieux mis au point.
    REMARQUE : Assurez-vous que la position de la scène est réglée sur un endroit avec des tissus. Si aucun tissu n’est visible à cette position, sélectionnez un autre site et réessayez (voir étape 4.9).
15. Appuyez sur le bouton Focus et attendez qu’une image nette du tissu s’affiche.
16. Pour Puissance d’éclairage, choisissez 50 %. Entrez 2000 pour l’intensité maximale cible et appuyez sur Exposition automatique pour ajuster automatiquement le temps d’exposition.
    REMARQUE : Pour accélérer l’acquisition, la puissance du laser peut être augmentée, ce qui devrait réduire le temps d’exposition. Cependant, cela peut conduire à plus de photo-blanchiment, ce qui conduira à des artefacts d’image où les tuiles individuelles se chevauchent.
17. Pour Série Z, choisissez Série Z et Image de projection 2D, et pour Correction de l’ombrage, choisissez Ombrage FL uniquement.
18. Répétez les étapes 5.13 à 5.17 pour les autres longueurs d’onde, mais au lieu de Laser avec décalage z, choisissez décalage Z à partir de W1 et choisissez 0.
19. Allez dans l’onglet Série Z . Entrez la taille de pas souhaitée (pour l’objectif 20x, utilisez une taille de pas de 0,5 μm).
    REMARQUE : La vitesse d’acquisition peut être augmentée en utilisant une taille de pas de 2 à 3 fois la valeur recommandée.
20. Cliquez sur le bouton Focus et attendez qu’une flèche étiquetée position actuelle apparaisse.
21. Cliquez sur Démarrer en direct et attendez qu’une nouvelle fenêtre avec des images en direct apparaisse. Faites glisser la flèche de position actuelle jusqu’à ce que le bas du tissu soit atteint et cliquez sur le bouton Définir B . Faites glisser la flèche de position actuelle jusqu’à ce que le haut du tissu soit atteint et cliquez sur le bouton Définir T. Cliquez sur F2 : Arrêter.
    REMARQUE : On peut choisir la longueur d’onde utilisée pour l’imagerie en direct sous Longueur d’onde active.
22. Sélectionnez les sites à acquérir ; Tout d’abord, assurez-vous que l’étape se trouve au premier puits en faisant un clic gauche dessus et en appuyant à nouveau sur Start Live . Allez à différentes positions à l’intérieur du puits en faisant un clic gauche sur différents sites dans le plan du site. Trouvez la bordure du tissu et marquez tous les sites contenant du tissu pour l’acquisition en cliquant avec le bouton droit de la souris. Les sites sélectionnés seront verts et les sites désélectionnés grisés.
    REMARQUE : Pour l’instant, ne faites cela que pour le premier puits et assurez-vous que seul le premier puits est sélectionné pour l’acquisition.
23. Allez dans l’onglet Exécuter . Pour le nom de la plaque, nommez-le « Cycle{i}_Well{w}_{description} » ; Remplacez {i}, {w} et {description} par les valeurs/description correspondantes.
24. Cliquez sur Enregistrer le protocole et enregistrez-le, en incluant à nouveau « Cycle{i}_Well{w} » dans le nom.
25. Configurez les régions d’acquisition pour tous les autres puits. Pour cela, répétez les étapes 5.22 à 5.24.
    REMARQUE : Pour chaque puits à acquérir, un fichier de protocole individuel doit être enregistré. Assurez-vous que le puits approprié est activé avant de dessiner le nouveau retour sur investissement. Le résultat doit être un protocole enregistré par puits à acquérir. Ceci est nécessaire car les tissus ont des formes différentes d’un puits à l’autre. Dans le cas où le retour sur investissement et la pile z sont identiques entre les puits, la répétition des étapes 5.22-5.24 peut être ignorée, et les étapes 5.26-5.29 peuvent également être ignorées. Dans ce cas, il suffit de sélectionner tous les puits à imager (voir l’étape 5.22), d’aller dans l’onglet Exécuter et d’appuyer sur Acquérir la plaque.
26. Cliquez sur Contrôle | Revue | Démarrez l’enregistrement , puis contrôlez immédiatement | Revue | Arrêtez l’enregistrement. Enregistrez le journal créé et ouvrez-le à nouveau via Contrôle | Revue | Modifier le journal.
27. Dans le panneau de gauche, recherchez et double-cliquez sur Acquisition de plaques - Charger le protocole à partir d’un fichier et sur Acquisition de plaques pour ajouter ces étapes au journal ; Recherchez-les dans le panneau de droite. Double-cliquez sur l’acquisition de plaque - Charger le protocole à partir d’un fichier et choisissez le protocole enregistré pour le premier puits (voir étape 5.24).
28. Répétez l’étape 5.27 pour chaque puits à acquérir, en chargeant toujours le protocole correspondant.
29. Cliquez sur Enregistrer et enfin sur Exécuter le journal pour lancer l’acquisition (il faut environ 3 h pour acquérir 180 tuiles avec une pile z de 15 μm).

6. Blanchiment au fluorophore (jour 2)

1. Environ 30 minutes avant la fin du journal, préparez le réactif de blanchiment. Dissoudre 10 mg de borohydrure de lithium dans 10 mL de ddH₂O et passer à travers un filtre de 0,22 μm. Laisser poser 10 min en attendant que des bulles se forment. Pour assurer un blanchiment efficace, utilisez le réactif de blanchiment dans les 4 heures suivant la préparation.
   ATTENTION : Travaillez sous une hotte chimique lors de la manipulation du borohydrure de lithium, car il peut réagir avec l’air et peut produire de l’hydrogène gazeux inflammable.
2. Blanchir les fluorophores avec 1 mL de 1 mg/mL de borohydrure de lithium pendant 15 min tout en étant exposé à un éclairage ambiant standard. Recherchez de petites bulles sur le tissu pendant la procédure de blanchiment.
   REMARQUE : Lorsque vous travaillez sous une hotte chimique, assurez-vous que l’éclairage ne s’éteint pas automatiquement pendant la procédure de blanchiment.
3. Répétez le blanchiment avec 1 mL de 1 mg/mL de borohydrure de lithium (préparé à partir de la même solution) pendant 15 min.
4. Lavez le puits pendant 3 x 5 min avec 1 mL de PBS.
   REMARQUE : Ne raccourcissez pas les temps de lavage, car une élimination incomplète du réactif de blanchiment pourrait endommager le prochain panel d’anticorps.

7. Cycles IBEX (Jour 2)

1. Appliquez les anticorps primaires pour le prochain cycle d’immunomarquage (étape 3.7) et incubez à 4 °C pendant la nuit. Répétez les étapes 4.4 à 5.4.
   REMARQUE : Les étapes 4.2 et 4.3 ne sont pas répétées car un anticorps de lapin non couplé n’est utilisé que dans le premier cycle IBEX. Cependant, les anticorps non couplés élevés chez des espèces moins courantes telles que le poulet ou le cobaye peuvent également être utilisés dans les cycles ultérieurs, car leur anticorps secondaire ne réagit pas de manière croisée avec les anticorps primaires couplés. Les détails exacts des anticorps utilisés dans chaque cycle se trouvent dans le tableau des matériaux.
2. Sur le microscope, chargez les paramètres de protocole du cycle IBEX précédent pour le puits correspondant en cliquant sur charger le protocole, enregistré sur le PC local sous le nom Cycle{i}_Well{w} (étape 5.24). Les paramètres du protocole comprendront le retour sur investissement (tuiles sélectionnées à acquérir), le grossissement, les paramètres de mise au point automatique et tous les paramètres d’acquisition supplémentaires enregistrés du cycle IBEX précédent (étapes 5.5 à 5.25).
3. Sélectionnez les onglets de longueur d’onde et ajustez l’exposition et la puissance d’éclairage pour le nouveau panel d’anticorps (étapes 5.12 à 5.18). Assurez-vous d’imager un marqueur (généralement DAPI ou Hoechst) tout au long de tous les cycles pour aligner les cycles par la suite.
   REMARQUE : Comme indiqué dans Radtke et ^al.18, les protéines fluorescentes couramment utilisées, telles que la GFP et la tdTomato, ne sont pas sensibles au blanchiment du borohydrure de lithium. Lorsque vous travaillez avec des tissus contenant des protéines fluorescentes endogènes telles que tdTomato, la longueur d’onde correspondante peut être omise de l’acquisition après le cycle 1, si elle n’est pas nécessaire pour le recalage d’images, ce qui accélérera l’imagerie. Les longueurs d’onde peuvent être supprimées dans l’onglet Longueur d’onde globale en réduisant le nombre de canaux d’acquisition. De plus, une augmentation constante de l’autofluorescence tissulaire n’a pas été observée au cours des cycles d’imagerie ; Cependant, cela est susceptible de varier en fonction du type de tissu¹⁸.
4. Vérifiez si les paramètres z-Stack sont toujours raisonnables et ajustez-les en conséquence (étapes 5.19-5.21).
   REMARQUE : Assurez-vous que la taille du pas de la pile z est la même pour tous les cycles.
5. Mettez à jour le nom de la plaque dans l’onglet Exécution et enregistrez à nouveau le protocole.
6. Répétez les étapes 7.2 à 7.5 pour tous les puits à acquérir.
   REMARQUE : Il est recommandé de noter le réglage d’exposition pour toutes les longueurs d’onde utilisées dans le premier puits et d’utiliser le même réglage dans tous les puits suivants.
7. Modifiez le journal, sélectionnez les nouveaux fichiers de protocole et enregistrez le journal pour ce cycle.
8. Exécutez le journal.
9. Répétez les étapes 6.1 à 6.4 pour blanchir les fluorophores.
10. Répétez les étapes 7.1 à 7.9 jusqu’à ce que le degré d’immunomarquage souhaité ait été atteint.

8. Traitement d’image (jour 2)

1. Après avoir finalisé l’acquisition d’images des cycles IBEX, exportez les données d’image :
   1. Sélection Dépistage | Utilitaires de données de plaque | Exporter des images.
   2. Cliquez sur Sélectionner une ou plusieurs plaques et choisissez toutes les plaques acquises pour chaque cycle et chaque puits.
   3. Choisissez Tous les plans Z, sélectionnez un répertoire de sortie et appuyez sur OK pour exporter les données.
      REMARQUE : Les données seront exportées sous forme de fichiers tiff individuels pour chaque tuile et plan. Pour combiner toutes les tuiles et tous les cycles, les étapes de traitement suivantes ont été effectuées.
2. Organisez les données exportées dans des dossiers selon le schéma suivant : assurez-vous que chaque cycle est un dossier, chacun contenant à nouveau un dossier pour chaque puits. Nommez comme suit : « \cycle{i}\{well}\*_Plate_* », où {i} et {well} sont le cycle et le puits correspondants, et * est n’importe quel caractère. Par exemple : « \cycle1\A01\some_name_Plate_8654 »
   REMARQUE : Une dénomination et une structure de dossiers correctes sont requises pour les étapes de traitement suivantes.
3. Installez les paquets python nécessaires : utilisez Miniforge pour gérer l’environnement Python. Voir https://github.com/conda-forge/miniforge pour les instructions d’installation.
   REMARQUE : Le code des étapes de traitement est fourni sous la forme de Jupyter Notebooks. Ils se trouvent à https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove ou sous forme de fichiers supplémentaires (Dossier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2, Dossier supplémentaire 3, Dossier supplémentaire 4 et Dossier supplémentaire 5).
4. Lorsque vous téléchargez le code depuis Github, téléchargez tous les fichiers en cliquant sur Code | Téléchargez le fichier ZIP et suivez les instructions d’installation dans le fichier README.md.
5. Démarrez Jupyter-Lab (Fichier supplémentaire 2) :
   1. Activez l’environnement conda installé en entrant conda activate zmb-ibex-jove dans un terminal.
   2. Dans le terminal, passez au répertoire téléchargé en entrant, par exemple, cd C :\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Démarrez Jupyter-Lab en entrant jupyter-lab dans le terminal. Une fenêtre de navigateur s’ouvrira avec jupyter-lab.
6. Calculer la correction de l’éclairage :
   1. Dans l’onglet de gauche, accédez au bloc-notes « examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb » et ouvrez-le en double-cliquant dessus . Ce cahier calculera les images de correction de l’éclairage, à l’aide de la bibliothèque BaSiCPy (Fichier supplémentaire 3).
   2. Remplacez les base_dir et save_dir par les chemins corrects, l’emplacement des données et l’emplacement des images de correction de l’éclairage.
   3. Pour exécuter le code dans le bloc-notes, sélectionnez chaque cellule et appuyez sur Maj+Entrée pour l’exécuter. Exécutez le bloc-notes de haut en bas.
7. Effectuez des coutures pour chaque cycle individuel (Fichier supplémentaire 4) :
   1. Sur l’onglet de gauche, accédez au bloc-notes suivant et ouvrez-le : « 02_stitching_MD.ipynb ». Dans ce carnet, pour chaque cycle, les tuiles individuelles sont chargées, corrigées de l’éclairage et assemblées, ce qui donne un fichier image par puits et par cycle. Utilisez la bibliothèque m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) pour la couture.
   2. Remplacez les entrées de la première cellule par les chemins d’accès aux fichiers corrects. Exécutez à nouveau le bloc-notes de haut en bas.
8. Effectuer le recalage d’images entre les cycles (Fichier supplémentaire 5) :
   1. Sur l’onglet de gauche, accédez au bloc-notes suivant et ouvrez-le : « 03_registration_pcc.ipynb ». Dans ce notebook, les cycles individuels sont alignés les uns avec les autres à l’aide uniquement de transformations translationnelles, qui sont calculées à l’aide de l’algorithme de corrélation croisée de phase de la bibliothèque d’images scikit (https://scikit-image.org/) en libre accès.
   2. Remplacez les entrées de la première cellule par les chemins d’accès aux fichiers corrects. Choisissez un cycle de référence et un canal de référence à utiliser (généralement DAPI). Exécutez à nouveau le bloc-notes de haut en bas.
      REMARQUE : Il suffit d’exécuter un seul des chapitres « Option 1 : Charger et enregistrer tous les canaux ensemble » et « Option 2 : Charger et enregistrer les canaux en tant que fichiers individuels ». Le premier chapitre créera un gros fichier, contenant tous les canaux de tous les cycles. Le deuxième chapitre créera un fichier individuel pour chaque canal. La deuxième option nécessitera moins de mémoire pour être traitée.

9. Analyse de l’image (jour 2)

1. Téléchargez et ouvrez Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   REMARQUE : Les images résultantes seront des images multiplans et multicanaux, qui pourront être analysées comme des images 3D. Ici, un exemple de flux de travail d’analyse est présenté pour les données 2D uniquement, pour lesquelles une projection d’intensité maximale est d’abord calculée.
2. Ouvrez le fichier dans Fidji en le faisant glisser sur la fenêtre Fidji.
3. Calculez la projection d’intensité maximale en sélectionnant Image | Piles | Z Project..., choisissez Intensité maximale et appuyez sur OK. Réenregistrez l’image via Fichier | Enregistrer sous | OME-TIFF".
4. Pour analyser les cellules, utilisez le logiciel open source QuPath ; Téléchargez-le et installez-le à partir de https://qupath.github.io/.
5. Ouvrez QuPath et créez un nouveau projet en faisant glisser un dossier vide sur la fenêtre.
6. Importez tous les fichiers dans le projet en les faisant glisser dans la fenêtre QuPath et en appuyant sur Importer avec les paramètres standard.
7. Double-cliquez sur une image dans le panneau de gauche pour l’ouvrir. Spécifiez-le comme Fluorescence lorsque vous y êtes invité.
8. Ouvrez la fenêtre Luminosité/Contraste en appuyant sur Maj+C.
   REMARQUE : Ici, on peut sélectionner les canaux affichés et ajuster la luminosité et le contraste. On peut également changer les noms et les couleurs des canaux en double-cliquant sur les noms.
9. Sélectionnez Outils | Polygone et annotez la région du tissu. Recherchez une nouvelle annotation sous l’onglet Annotations . Affectez-la à une classe spécifique en sélectionnant l’annotation, en sélectionnant une classe (par exemple, Autre) et en appuyant sur Set class.
10. Détecter les cellules : Aller à Analyser | Détection de cellules | Détection de cellules.
    1. Choisissez une filière nucléaire.
    2. Laissez la plupart des paramètres tels quels, mais ajustez le seuil en survolant un noyau avec la souris et en notant l’intensité affichée dans le coin inférieur droit. Passez la souris sur une région d’arrière-plan et notez à nouveau l’intensité. Choisissez une valeur à mi-chemin entre l’arrière-plan et le premier plan comme seuil.
    3. Cliquez sur Exécuter.
11. Inspecter les cellules et les mesures :
12. En double-cliquant sur une cellule ou en la sélectionnant dans l’onglet Hiérarchie , inspectez ses mesures dans le panneau inférieur gauche. Différentes mesures de forme et d’intensité doivent être ajoutées pour la cellule, le noyau et le cytoplasme.
13. Classer les cellules :
    1. Pour classer les cellules détectées en fonction de l’intensité dans un canal, allez dans Classifier | Classification d’objets | Créez un classificateur de mesure unique.
    2. Sélectionnez le canal souhaité sous Filtre de canal et une mesure appropriée sous Mesure (par exemple, Cellule : Moyenne du canal).
    3. Ajustez le seuil en passant à nouveau la souris sur une cellule positive et sur une cellule négative, puis en choisissant une valeur entre les deux.
    4. Sélectionnez, par exemple, Positif pour Au-dessus du seuil et Négatif pour En dessous du seuil. Vérifiez le résultat en vérifiant l’aperçu en direct.
    5. Appuyez sur Appliquer pour classer les cellules.
14. Mesurer la distance par rapport à des objets annotés (p. ex., faisceaux nerveux) :
    1. Sélectionnez Outils | Outil pinceau .
    2. Dessinez sur les régions d’intérêt (par exemple, les faisceaux nerveux).
    3. Allez dans l’onglet Annotations . Sélectionnez toutes les nouvelles annotations, sélectionnez une classe correspondante et appuyez sur Définir la classe.
       REMARQUE : On peut créer une nouvelle classe en cliquant avec le bouton droit de la souris dans la fenêtre de la classe et en sélectionnant Ajouter/Supprimer | Ajouter de la classe.
    4. Aller à Analyser l’analyse spatiale | Distance signée par rapport aux annotations 2D et appuyez sur Oui lorsque vous y êtes invité.
    5. Ajoutez une nouvelle mesure à chaque cellule, en indiquant la distance jusqu’à l’annotation la plus proche d’une classe donnée.
15. Mesures à l’exportation :
    1. Aller à la mesure | Affichez les mesures de détection et attendez qu’une liste de toutes les mesures de toutes les détections s’affiche.
    2. Exportez le tableau en tant que .txt via le bouton Enregistrer .
    3. Importez les données dans le logiciel de traitement des données de votre choix pour une analyse plus approfondie.

Results

Cette méthode permet une détection adéquate des types de cellules proliférantes en combinant la chimie EdU Click-iT avec IBEX dans des sections de peau murine congelée fixe. La détection des types cellulaires proliférants a été comparée à l’aide de différentes méthodologies, en particulier le marquage des types cellulaires proliférants avec l’anticorps Ki-67 et la détection de la prolifération cellulaire à l’aide de l’approche chimique EdU Click-iT (Figure 1)...

Discussion

La prolifération cellulaire est l’une des quatre principales étapes de la réparation de la peau, et la transition entre la phase inflammatoire et la phase proliférative est essentielle à la réussite du processus de réparation²⁰. Une réponse immunitaire bien régulée est essentielle, car une inflammation prolongée peut entraîner des plaies chroniques, un problème de santé mondial important ^1,21. La proliféra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps et réactifs & nbsp ;	SOURCE	IDENTIFICATEUR	Commentaires
< fort>Anticorps
CD31 Alexa Fluor 647 (Cycle 2)  ;	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Cycle 2)  ;	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Cycle 1) & nbsp ;	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Poulet Ki-67 (CK)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt) & nbsp ;	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilament H & M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Cycle 3)  ;	BioLegend  ;	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Cycle 1)  ;	Technologie de signalisation cellulaire	Cat#8238  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Cycle 3)  ;	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 anti-lapin d’âne	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
Réactifs  ;
Plaque inférieure en verre Cellvis à 24 puits	Cellvis  ;	P24-1.5H-N
Gélatine à l’alun chromé	Approvisionnement des nouveaux arrivants	Cat#1033A
Kit  ; Click-iT EdU	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533 ; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Lithium Borohydrure, 95 %	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Tissu-Tek Composé O.C.T Sakura	Biosystèmes Suisse	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Lames de microscope Superfrost Plus Adhérences   ;	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich & nbsp ;	Cat#T8787
Équipement
Brosse à cheveux & nbsp ;	Faust AG	Cat#9172051 et 9172050
Lames microtomes   ;	Biosystèmes Suisse	Cat#207500011
Microscope	Dispositifs moléculaires, ImageXpress Confocal HT.ai
Four & nbsp ;	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
Vibrateur à bascule	Edmund Bü ; hler GmbH	Cat#32310015