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Article de méthode

Détection de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques par analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase dans les selles

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DOI :

10.3791/67710

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16 mai 2025

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1Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Medical Technology School, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole utilise un échantillonnage non invasif des selles combiné à une réaction en chaîne quantitative par polymérase pour offrir une méthode de diagnostic pratique et rapide de l’infection à Helicobacter pylori et de sa résistance à la clarithromycine et aux quinolones.

Résumé

Helicobacter pylori (H. pylori) est largement répandu dans le monde entier, avec environ 50 % de la population mondiale ayant des antécédents d’infection à H. pylori . En Chine, le taux d’infection varie de 40 % à 70 %. H. pylori est principalement associé à des maladies gastro-intestinales telles que la gastrite chronique, les ulcères gastriques et les ulcères duodénaux. À l’heure actuelle, le traitement clinique de l’infection à H. pylori implique une trithérapie ou une quadruple thérapie. Cependant, l’utilisation intensive d’antibiotiques a conduit au développement d’une résistance aux antibiotiques chez H. pylori. Par conséquent, la détection de H. pylori et de sa résistance aux antibiotiques est cruciale pour guider le traitement clinique.

Les méthodes de diagnostic de H. pylori comprennent le test respiratoire à l’urée (UBT), le test antigénique, le test d’anticorps sérologiques, l’endoscopie, le test rapide de l’uréase (RUT) et la culture bactérienne. Bien que les trois premières méthodes soient non invasives, elles ne permettent pas la récupération bactérienne et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisées pour les tests de résistance. Ces trois dernières méthodes sont invasives, coûteuses, nécessitent une expertise technique élevée et peuvent causer des dommages aux patients.

Par conséquent, une méthode rapide et non invasive de détection simultanée de l’infection à H. pylori et de la résistance aux antibiotiques est de la plus haute importance clinique pour l’éradication efficace de H. pylori. Cet article vise à introduire un protocole spécifique qui combine la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) avec la technologie de sonde fluorescente TaqMan pour détecter rapidement l’infection à H. pylori et la résistance aux antibiotiques. Cette méthode offre un moyen pratique, rapide et non invasif de diagnostiquer l’infection et la résistance à H. pylori , contrairement à la culture bactérienne traditionnelle et à d’autres techniques. La qPCR est utilisée pour identifier l’infection et détecter les mutations dans les gènes de l’ARNr 23S et du gyrA , qui sont liés à la résistance à la clarithromycine et aux quinolones, respectivement. Par rapport aux techniques de culture conventionnelles, cette approche offre une méthode non invasive, rentable et rapide pour détecter l’infection à Helicobacter pylori et déterminer sa résistance aux antibiotiques.

Introduction

Helicobacter pylori est une bactérie à Gram négatif, en forme de spirale, qui peut infecter de manière persistante l’épithélium gastrique humain1. En 1994, l’Organisation mondiale de la santé a classé H. pylori comme cancérogène du groupe 1 pour le cancer gastrique, avec ~3 % des personnes infectées développant finalement la maladie2. Une revue systématique récemment publiée a indiqué qu’une tendance générale à l’augmentation du taux de résistance aux antibiotiques de H. pylori a été observée au cours de la dernière décennie, qui a atteint des niveaux alarmants dans le monde entier, en particulier la résistance à la clarithromycine3. En Chine, les dernières données d’enquête ont montré que la prévalence globale de H. pylori parmi les Chinois urbains est de 27,08 % ; les taux de résistance à la clarithromycine et à la lévofloxacine étaient de 50,83 % et 47,17 %4, ce qui est supérieur à celui des États-Unis (lévofloxacine 37,6 %, clarithromycine 31,5 %)5et de l’Europe (lévofloxacine 15,8 % et clarithromycine 21,4 %)6. Par conséquent, un diagnostic et un traitement précoces et précis sont essentiels. Cependant, la résistance croissante aux antibiotiques de H. pylori réduit considérablement l’efficacité du traitement, soulignant le besoin urgent de poursuivre la recherche sur son diagnostic et son traitement.

Les méthodes de diagnostic de H. pylori sont classées en techniques invasives et non invasives7. Les méthodes invasives comprennent l’examen histopathologique, le test rapide d’uréase (RUT) et la culture bactérienne8. L’examen histopathologique repose sur le traitement et l’observation microscopique d’échantillons de biopsie, avec une précision limitée par la préparation histologique et l’expertise en pathologie9. RUT détecte H. pylori grâce à l’activité de l’uréase, qui hydrolyse l’urée pour produire de l’ammoniac, ce qui entraîne un décalage alcalin du réactif, indiquant ainsi la présence de la bactérie9. C’est simple et rentable. La culture bactérienne, considérée comme l’étalon-or, a souvent un taux de réussite inférieur à 50 % en raison des caractéristiques physiologiques uniques de H. pylori10.

Les méthodes non invasives comprennent le test respiratoire à l’urée 13C/14C (UBT), le diagnostic sérologique et le test d’antigène dans les selles (SAT)11. Le test respiratoire fonctionne sur un principe similaire à celui du RUT, détectant le CO2 marqué isotopiquement dans l’air expiré pour confirmer l’infection12. Le diagnostic sérologique détecte des anticorps, qui peuvent persister après l’éradication bactérienne, ce qui rend difficile l’évaluation de l’efficacité du traitement13. L’analyse des antigènes dans les selles détecte les antigènes spécifiques de H. pylori dans les échantillons fécaux, ce qui constitue une méthode fiable et non invasive avec un taux plus faible de faux positifs et une bonne précision pour diagnostiquer les infections actives14.

Chaque méthode de diagnostic a ses avantages et ses limites15. Outre la culture bactérienne, d’autres méthodes ont du mal à détecter la résistance aux antibiotiques, tandis que la culture est entravée par de faibles taux de réussite16. Récemment, les méthodes de diagnostic moléculaire telles que la PCR quantitative en temps réel (qPCR) ont été largement appliquées à la détection microbienne17. La qPCR peut détecter avec précision H. pylori et analyser les mutations des gènes de résistance, offrant ainsi une vue plus complète de l’infection18.

Les sondes fluorescentes sont conçues pour se lier spécifiquement à une séquence cible de l’ADN pendant le processus de qPCR. Ces sondes sont généralement marquées avec un colorant fluorescent, qui émet un signal lorsque la sonde se lie à sa cible et est clivée par la polymérase lors de l’amplification. Cela permet une mesure en temps réel du processus de PCR. Les sondes fluorescentes sont connues pour leur grande spécificité en raison de la conception unique de la sonde, qui garantit que seule la séquence d’ADN cible est détectée, réduisant ainsi les risques de liaison non spécifique et améliorant la spécificité du test. Cela rend la technologie des sondes fluorescentes particulièrement utile pour détecter des cibles de faible abondance, telles que l’ADN d’Helicobacter pylori dans des échantillons de selles. Bien que le SYBR Green soit un colorant de liaison à l’ADN couramment utilisé en PCR, il peut se lier à n’importe quel ADN double brin, ce qui peut entraîner une amplification non spécifique et des faux positifs.

La culture d’Helicobacter pylori à partir d’échantillons cliniques ne fournit pas directement de données sur la résistance aux antibiotiques. En revanche, la qPCR basée sur une sonde fluorescente est plus rapide, plus pratique et peut être adaptée pour la détection simultanée de H. pylori et des marqueurs de résistance aux antibiotiques. Cette méthode permet non seulement des résultats plus rapides que les méthodes de culture traditionnelles, mais aussi la détection simultanée des gènes de résistance aux antibiotiques, ce qui améliore considérablement l’efficacité et la commodité de la détection. Cette méthode offre un moyen pratique, rapide et non invasif de diagnostiquer l’infection et la résistance à H. pylori , contrairement à la culture bactérienne traditionnelle et à d’autres techniques.

Deux questions cruciales doivent être prises en compte pour la résistance aux antibiotiques de H. pylori : i) la cohérence du génotype et du phénotype, ii) la multirésistance aux médicaments. Une étude multicentrique à grande échelle menée en Chine a révélé que les profils de double résistance à la clarithromycine et à la lévofloxacine étaient de 26,1 %. Les phénotypes et génotypes de H pylori résistants à la clarithromycine et à la lévofloxacine ont montré une concordance satisfaisante (coefficient kappa = 0,810 et 0,782, respectivement)19. Par conséquent, il est possible d’utiliser la méthode qPCR pour détecter l’infection à H. pylori et la résistance aux médicaments. Les méthodes de test d’antigène dans les selles (SAT) et de qPCR sont de plus en plus utilisées en raison de la commodité de l’échantillonnage. La sensibilité, la spécificité et la précision des méthodes de détection de H. pylori sont les suivantes : qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > culture20. Toutes les méthodes non invasives conviennent au dépistage primaire. Étant donné que la qPCR peut également détecter les gènes de résistance aux médicaments, la qPCR et la culture seront plus appropriées pour guider le traitement.

D’autres approches innovantes, telles que les algorithmes d’intelligence artificielle (IA) combinés à des images endoscopiques21, à la microfluidique numérique22 et à la RPA-CRISPR/Cas12a23, montrent théoriquement une bonne efficacité diagnostique et des perspectives d’application prometteuses. Cependant, la qPCR est actuellement la technique de biologie moléculaire la plus sophistiquée avec le potentiel de fournir une solution supérieure pour le diagnostic et le traitement des infections à H. pylori .

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Protocole

Cette étude respecte les directives éthiques établies par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire provincial du Guangdong, Université médicale du Sud, Guangzhou, Chine (n° d’approbation : KY2024-445-01). Des informations détaillées concernant les matériaux utilisés dans cette recherche (réactifs, produits chimiques, équipements et logiciels) se trouvent dans la table des matériaux.

1. Sélection des participants

  1. Choisissez des participants âgés de 18 à 60 ans.
  2. Choisissez des participants susceptibles de subir un dépistage de l’infection à Helicobacter pylori , tels que des patients présentant des symptômes tels que la gastrite, des ulcères gastroduodénaux ou la dyspepsie, ainsi que des personnes asymptomatiques.
  3. Excluez de l’étude les patients qui ont utilisé des antibiotiques, des agents contenant du bismuth (tels que des gélules de citrate de bismuth de potassium, des gélules de pectine de bismuth colloïdal ou des comprimés composés de bismuth et d’aluminium) ou des médicaments antimicrobiens chinois au cours du dernier mois, ou ceux qui ont utilisé des inhibiteurs de la pompe à protons ou des antagonistes des récepteurs H2 (tels que l’oméprazole, le pantoprazole, le rabéprazole, la cimétidine ou la nizatidine) au cours des 2 dernières semaines. Exclure également les femmes pendant leur période menstruelle de l’étude.

2. Prélèvement d’échantillons fécaux

REMARQUE : Fournissez la section 2 comme instructions aux participants.

  1. Confirmez que l’emballage extérieur de la trousse d’échantillonnage n’est pas endommagé et qu’il respecte la date d’expiration. Retirez les matériaux du kit.
  2. Placez un papier de collecte fécale blanc dans la cuvette des toilettes et déféquez (pour éviter la contamination par l’urine).
  3. À l’aide d’une spatule, prélever une portion de matières fécales de la taille d’un fève (~5 g) et la transférer dans le récipient d’échantillon.
  4. Placez la spatule d’échantillonnage, ainsi que l’échantillon fécal, dans le tube de prélèvement, en veillant à ce que le niveau de liquide monte près de la ligne d’échantillonnage indiquée sur le tube.
  5. Serrez fermement le capuchon du tube. Retournez le tube plusieurs fois pour assurer un mélange complet de l’échantillon avec la solution de préservation.
  6. Conserver l’échantillon sous réfrigération jusqu’à la livraison au laboratoire clinique pour l’identification suivante de H. pylori et l’évaluation des profils de résistance aux antibiotiques par qPCR.

3. Extraction des acides nucléiques

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour éviter toute contamination.

  1. Retournez le tube de conservation de l’échantillon et mélangez soigneusement. Transvaser 1,0 mL de la solution fécale de l’échantillon dans un tube de microcentrifugation.
  2. Après avoir mélangé les tubes de centrifugation, placez-les dans un bain métallique à 80 °C pendant 10 min, avec un mélange intermittent pendant 30 s à la cinquième minute. Une fois que les tubes ont refroidi à température ambiante, centrifuger à 10 000 × g pendant 5 min et recueillir le surnageant pour un traitement ultérieur.
  3. Retournez la plaque à 96 puits plusieurs fois pour remettre les billes magnétiques en suspension. Retirez délicatement le joint en papier d’aluminium, en prenant soin d’éviter de secouer pour éviter les déversements.
  4. Ajouter 200 μL de l’échantillon préparé (de l’étape 3.2) dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant le tampon de lyse, en veillant à ce que chaque puits corresponde à un seul échantillon. Placez la plaque à 96 puits dans le compartiment d’échantillon désigné de l’instrument d’extraction d’acide nucléique pour l’extraction automatisée.
  5. Conservez les échantillons restants et les échantillons d’acides nucléiques extraits à -20 °C pour une conservation à long terme et une utilisation future.

4. qPCR : Détection des acides nucléiques d’Helicobacter pylori et des mutations de résistance à la clarithromycine et aux quinolones

  1. Prenez les réactifs dans la zone de stockage des réactifs et décongelez-les à température ambiante.
    REMARQUE : Ce kit a été utilisé pour la détection qualitative de l’acide nucléique de H. pylori , y compris les mutations du gène de l’ARNr 23S (A2143G, A2143C, A2144G) et du gène gyrA (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). Les amorces, les sondes, l’enzyme Taq, l’enzyme UNG et les dNTP étaient disponibles dans le kit. Les gènes cibles de H. pylori et de la β-actine humaine ont été inclus dans le contrôle de qualité positif. Le gèneβ-actine humaine a été choisi comme contrôle de qualité interne.
  2. En fonction du nombre d’échantillons à tester, utilisez N + 2 copies du réactif lyophilisé, où N représente le nombre d’échantillons à tester et 2 représente les CQ négatifs et positifs.
  3. Centrifugez brièvement pour vous assurer que la poudre lyophilisée se dépose au fond des tubes. Ouvrez le couvercle du réactif lyophilisé (en prenant soin d’éviter tout déversement de la poudre) et ajoutez 25 μL par puits des acides nucléiques extraits des échantillons à tester, ainsi que des témoins positifs et négatifs. Fermez bien les tubes.
  4. Vortex les réactifs PCR pendant 8 à 10 s, puis centrifugez brièvement pendant 3 à 5 s pour éviter la formation de bulles.
  5. Placez la plaque qPCR à 96 puits sur la machine qPCR. Réglez le programme de cyclage comme suit : incubez d’abord le mélange réactionnel (contenant des amorces, des sondes, de la polymérase Taq, de l’enzyme UNG, des dNTP, etc.) à 42 °C et 95 °C (les deux étapes d’un cycle) pendant 2 min ; ensuite, cycle 10x avec 10 s à 95 °C et 45 s à 65 °C ; enfin, cycle 35x avec 10 s à 95 °C et 45 s à 58 °C pour la dénaturation, le recuit et l’extension.
  6. Réglez les paramètres de détection du signal de fluorescence comme suit : marquage par fluorescence ROX des gènes conservés de H. pylori ; Marquage fluorescent FAM des gènes de résistance à la clarithromycine de H. pylori  ; Marquage par fluorescence HEX des gènes de résistance aux quinolones de H. pylori ; et le marquage fluorescent CY5 du gène humain de la β-actine ont été utilisés comme contrôle interne du kit. Collectez des données à 58 °C. Une fois la réaction terminée, assurez-vous que les données sont sauvegardées pour une analyse future.
  7. Analysez les données à l’aide d’un logiciel spécifique à la qPCR, car l’instrument sélectionne automatiquement le seuil de référence. Fixer tous les critères de diagnostic, y compris la présence d’une infection ou d’une résistance à Helicobacter pylori , à une valeur CT ≤30 ; confirmer qu’ils présentent une courbe caractéristique en forme de S.

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Résultats

Application de la qPCR pour la détection de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques dans des échantillons fécaux
Nous avons conçu des amorces et des sondes basées sur des mutations ponctuelles dans les gènes conservés d’Helicobacter pylori, ainsi que dans le gène de l’ARNr 23S et le gène gyrA . Ces amorces et sondes ont été marquées avec différents colorants fluorescents, puis...

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Discussion

Ces dernières années, les méthodes de détection moléculaire ont été largement appliquées dans le domaine de la microbiologie, modifiant considérablement la prise en charge clinique de plusieurs maladies infectieuses. Ces méthodes fonctionnent au niveau génétique, permettant non seulement de confirmer la présence bactérienne, mais aussi de déterminer le typage génétique et les tests de résistance aux antibiotiques. La PCR quantitative par fluorescence en temps réel (qPCR) est de plus en p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation de recherche pour les talents avancés de l’hôpital populaire de la province du Guangdong [Subvention No. KY012023293]. Ce travail a été soutenu par Jiangsu Mole Bioscience Co. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BSC-1500IIA2-XBIOBASESEDAEnceinte de sécurité Biosécurité
Tube jetable de collecte et de stockage des matières fécalesMoleCollecter des échantillons fécaux
E-CentrifugeuseWEALTECCentrifuger le liquide résiduel de la paroi du tube
Helicobacter pylori Kit de détection des mutations de résistance aux acides nucléiques, clarithromycine et quinolonesMoleDétection de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques ; réactif de H. pylori lyophilisé (contenant des amorces, des sondes, de la polymérase Taq, de l’enzyme UNG, des dNTP, etc.), un contrôle positif pour H. pylori (contenant Helicobacter pylori et les gènes cibles de la &bêta-actine humaine) et un contrôle négatif pour H. pylori (contenant des gènes cibles de la &bêta-actine humaine)
Mole 96M extracteur automatisé d’acide nucléiqueMolePour l’extraction
l’ADNPourextraire l’acide nucléique, contient un tampon de lyse (sel de guanidine, tris hydroxyméthyl aminométhane, Tween-20, chlorure de sodium), un tampon de lavage 1 (chlorure de sodium), un tampon de lavage 2 (tris hydroxyméthylaminométhane, Tween-20), un tampon de lavage 3 (billes magnétiques, Tween-20), un tampon de lavage 4 (eau sans nucléase) et un tampon d’élution (tris hydroxyméthylaminométhane), ainsi qu’un support magnétique
SLAN Système d’analyse PCR médicale entièrement automatiqueHONGSHIAnalyse de données
SLAN-96S Machine de PCR en temps réelHONGSHIAmplification quantitative par PCR
Congélateurs à ultra-basse température (DW-YL450)MELINGSEDA20172220091-20 ° ; C pour le stockage des réactifs
Vortex-5Kylin-bellPour le mélange des réactifs
20143222263 de fluorescente

Références

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