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Article de méthode

Collection d’exosomes libérés naturellement à partir de tissus tumoraux

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DOI :

10.3791/67739

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10 juin 2025

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1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fait la démonstration d’une nouvelle méthode d’extraction d’exosomes des tissus tumoraux en les libérant naturellement et en les collectant de manière répétée afin de fournir une base expérimentale pour l’étude de la fonction des exosomes dans le développement tumoral.

Résumé

En tant que vésicules sécrétées par les cellules, les exosomes renferment et transfèrent divers acides nucléiques, protéines et lipides, et participent à la communication entre les différentes cellules. Les exosomes dans le microenvironnement tumoral jouent un rôle important dans les caractéristiques biologiques des cellules tumorales et peuvent fortement influencer les états d’autres cellules. Par conséquent, pour étudier davantage les fonctions spécifiques des exosomes dans le développement des tumeurs, il est sans aucun doute nécessaire d’extraire et d’isoler les exosomes des tissus tumoraux. L’extraction directe d’exosomes du tissu tumoral réduit le besoin de culture cellulaire in vitro , et les exosomes du tissu tumoral peuvent être plus similaires à ceux à l’état naturel. Par conséquent, le maintien de l’état naturel des exosomes dans le tissu tumoral est la clé du processus d’extraction. La digestion enzymatique est souvent associée à l’ultracentrifugation pour extraire les exosomes des tissus tumoraux. Ici, nous proposons une nouvelle méthode pour extraire des exosomes du tissu tumoral. Nous avons utilisé un milieu sans sérum pour incuber de petits morceaux de tissu tumoral sur une table vibrante, collecté et extrait à plusieurs reprises des exosomes naturellement libérés du tissu tumoral, et identifié la structure, la concentration et les caractéristiques des exosomes extraits, fournissant une nouvelle méthode pour les chercheurs étudiant la fonction des exosomes dans le développement tumoral.

Introduction

Les exosomes sont un sous-type de vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules, dont la taille varie généralement de 30 nm à 200 nm 1,2. Ils participent à la communication intercellulaire et délivrent diverses molécules de signalisation, notamment des acides nucléiques (par exemple, l’acide désoxyribonucléique (ADN), l’ARN messager (ARNm), l’acide microribonucléique (miARN), l’ARN long non codant (lncRNA), l’ARN circulaire (circRNA)), les protéines et les lipides 1,3,4,5, aux cellules réceptrices pour influencer leurs fonctions physiologiques 6,7. Initialement identifiés dans les réticulocytesde mouton 8, les exosomes ont depuis été identifiés dans divers fluides corporels, notamment le sang, la salive, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, l’ascite, le liquide amniotique et le lait maternel 9,10,11,12,13,14,15,16. De plus, les exosomes peuvent être sécrétés par de nombreux types de cellules, notamment les lymphocytes, les macrophages, les mastocytes, les cellules adipeuses et les cellules tumorales17. Grâce à leur large distribution, les exosomes jouent un rôle essentiel dans divers processus pathologiques, en particulier le cancer, et dans divers processus physiologiques, notamment le développement embryonnaire, la réparation et la régénération des tissus et la régulation immunitaire 18,19,20.

Au cours des dernières années, il a été démontré que les exosomes favorisent l’apparition de tumeurs, l’invasion, les métastases, la résistance à la chimiothérapie et l’immunité anti- ou pro-tumorale 20,21,22. Les exosomes dérivés du cancer peuvent activer l’expression génique dans les récepteurs ou les cellules cancéreuses voisines pour modifier leurs phénotypes biologiques, et les cellules cancéreuses peuvent interagir avec les cellules stromales dans le microenvironnement tumoral pour favoriser la prolifération, l’invasion et l’angiogenèse des cellules cancéreuses 23,24,25. Les exosomes libérés par les cellules tumorales peuvent les aider à excréter des médicaments toxiques, et les exosomes dérivés des cellules stromales peuvent favoriser la formation de cellules cancéreuses20. Les exosomes dérivés du cancer sont impliqués dans divers stades des métastases des cellules cancéreuses, y compris l’invasion des tissus voisins, le transfert par le système circulatoire et la propagation dans des organes distants20. Enfin, les exosomes remplissent à la fois des fonctions d’immunoactivation et d’immunosuppression dans le cancer, en fonction des ligands, des protéines et des miARN qu’ils transportent20. En raison des fonctions importantes des exosomes dérivés du tissu tumoral, ils présentent une valeur d’application potentielle dans le diagnostic précoce, le traitement précis et le suivi pronostique des tumeurs21,22.

Étant donné l’importance des exosomes dérivés du tissu tumoral, de nombreux chercheurs ont tenté de les extraire pour étudier davantage leurs propriétés et leurs fonctions. L’extraction directe d’exosomes à partir de tissus tumoraux réduit non seulement le besoin de culture cellulaire in vitro, mais ressemble également davantage à l’état naturel des exosomes. Par conséquent, le maintien de l’état naturel des exosomes dans le tissu tumoral est la clé du processus d’extraction. Les propriétés physiques des exosomes sont à la base des méthodes d’extraction courantes, et les changements dans les composants des exosomes causés par la stimulation pendant le processus d’extraction sont rarement pris en compte. En fait, la qualité des exosomes est fortement affectée par différentes procédures d’extraction d’exosomes26,27. Actuellement, les tissus tumoraux sont digérés par des enzymes et soumis à des méthodes telles que la centrifugation à gradient de densité, l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration, la chromatographie d’exclusion stérique (SEC), la précipitation de polymères, la chromatographie d’immunoaffinité et les méthodes microfluidiques, avant la séparation 2,21,28,29 . Ici, nous proposons une méthode d’extraction d’exosomes à partir de tissu tumoral. Nous avons utilisé un milieu sans sérum pour cultiver de petits blocs de tissu tumoral dans un agitateur, puis nous avons collecté et extrait des exosomes naturellement libérés par le tissu tumoral et identifié la concentration et les caractéristiques des exosomes extraits, fournissant des matériaux de base et des preuves expérimentales pour étudier la fonction des exosomes dans le développement tumoral.

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Protocole

Toutes les expériences liées aux exosomes du tissu tumoral ont été menées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Cette étude a été approuvée et menée selon les directives du Comité d’éthique de l’hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (20220301101). Quatre semaines après l’inoculation avec des cellules SGC-7901, une souris nue (BALB/c, mâle, 8 semaines, 26 g) a été euthanasiée par luxation cervicale.

1. Acquisition de tissu tumoral

  1. Faire tremper dans de l’alcool à 75 % pendant 5 min.
  2. Déplacez-vous vers une table d’opération stérile, utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour ouvrir la peau externe de la tumeur ectopique.
  3. Décollez le tissu tumoral ectopique, puis coupez et pesez pour obtenir deux morceaux de poids égal.
    REMARQUE : Un morceau de tissu tumoral est utilisé pour l’extraction d’exosomes dans le cadre de ce protocole, et un autre morceau de tissu tumoral de poids égal est utilisé pour l’extraction d’exosomes par digestion enzymatique30.

2. Préconditionnement du tissu tumoral

REMARQUE : Effectuez ces étapes sur de la glace et dans un environnement stérile.

  1. Pipeter 10 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) prérefroidie (0,01 M) pour laver le tissu tumoral afin d’éliminer le sang et la graisse de surface.
  2. Coupez le tissu tumoral (~400 mm3) en morceaux de 1 à 2 mm à l’aide de ciseaux ophtalmiques dans 20 ml de PBS avec 2 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm. Transférer le mélange ci-dessus dans un tube conique de 50 ml.

3. Libération d’exosomes

  1. Centrifuger le tube à partir de l’étape 1.2 à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 20 mL de milieu α minimum essentiel (α-MEM). Incuber à 37 °C à 100 tr/min pendant 1 h dans un agitateur à température constante.
  3. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
  4. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec 10 mL de milieu α-MEM. Incuber à 37 °C à 100 tr/min pendant 6 h dans un agitateur à température constante.
    REMARQUE : Soyez doux avec toutes les étapes. Une courte incubation et un lavage avec un milieu α-MEM suffisent à éliminer les composants intracellulaires qui fuient en raison de la coupe, y compris les vésicules intracellulaires et les organites.
  5. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min, 4 °C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube.
  6. Remettez en suspension le tissu tumoral avec 10 ml de milieu α-MEM.
  7. Répétez l’incubation à partir de l’étape 2.4 suivie de l’étape 2.5.
  8. Mélangez les surnageants moyens collectés aux étapes 2.5 et 2.7.
    REMARQUE : Soyez doux avec toutes les étapes. Deux incubations de 6 h ont induit la libération naturelle d’exosomes à partir des morceaux de tissu tumoral.

4. Ultracentrifugation

  1. Filtrer le surnageant à travers un filtre microporeux de 0,45 μm.
  2. Centrifuger le surnageant à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les grosses vésicules.
  3. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez à 120 000 × g pendant 90 min à 4 °C pour recueillir les exosomes.
  4. Laver le précipité d’exosomes avec du PBS (0,01 M) et centrifuger à nouveau à 140 000 × g pendant 60 min à 4 °C.
  5. Mettre en suspension les exosomes précipités dans du PBS (0,01 M) pour une utilisation immédiate ou un stockage à -80 °C.
    REMARQUE : Soyez doux avec toutes les étapes. Effectuez chaque étape avec la force centrifuge la plus faible possible et le temps de centrifugation le plus court.

5. Présentation des résultats de l’identification des exosomes

  1. Identifier la morphologie des exosomes du tissu tumoral par microscopie électronique à transmission (TEM)30.
  2. Déterminez la taille et la concentration des exosomes du tissu tumoral grâce à l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)30.
  3. Identifier les marqueurs protéiques exosomaux CD9 et CD63 par Western blot (WB)30.
    REMARQUE : Lignes directrices récentes pour la recherche sur les exosomes, y compris l’utilisation de CD63, CD9, comme critères pour les marqueurs d’exosomes31.

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Résultats

La TEM a révélé que les exosomes dérivés du tissu tumoral via cette méthode avaient des structures typiques en forme de coupe (Figure 1A), et il n’y avait pas de différence significative entre la forme des exosomes extraits par cette méthode et par digestion enzymatique (Figure 1B). Les résultats de la NTA ont révélé que le diamètre moyen de l’exosome était de 172,8 nm, ce qui se situait dans la gamme de 30 à 200 nm et correspondait à la taille des exosomes ; la...

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Discussion

Dans cette méthode, des exosomes dérivés de tissus tumoraux ont été extraits des tissus cancéreux gastriques ectopiques de souris nues, et les étapes clés étaient la libération, l’exsudation, la séparation et la purification des exosomes. Diverses méthodes de séparation des exosomes ont été conçues et vérifiées en fonction des propriétés physiques et de la composition des exosomes 2,21,28,29, chacune présentant des avantages et des inconvénients, mais ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme de soutien à la science et à la technologie de la province du Sichuan (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
&alpha ;-MEMHyCloneSH30265.01B
Anticorps anti-CD63Biossbsm-43117M
Anticorps anti-CD9Biossbs-2489R
Tube à centrifugerThermo339650
Agitateur à température constanteThermoMAXQ4450
Pipette stérile jetable-10 mLJET
EDTABiosharpBS107
Pipette électriqueThermo9501
Centrifugeuse horizontale à température contrôléeThermoSorvall ST1R plus
Analyseur de suivi des nanoparticulesMalvinNanoSight Pro
Ciseaux ophtalmiquesJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Acide phosphotungstique  ;   ;Sigma455970-10G
Ciseaux chirurgicauxJinzhongJ21010
Anticorps secondaireBiossBs-0295GChèvre Anti-Lapin IgG H& L/FITC
Microscope électronique à transmissionNikonPlan Apo WF
Tube ultracentrifugeBeckman355618
GSP01001

Références

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