Profilage des O-glycanes de mucine perméthylée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la libération d’O-glycanes à partir des mucines, ainsi que le dessalage, la perméthylation et l’analyse ultérieurs à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Résumé

La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) est un outil puissant pour le profilage des glycanes à mucine qui offre une sensibilité et un débit élevés. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’analyse des glycanes liés à l’O à partir des mucines à l’aide de MALDI-TOF MS, englobant la libération de glycanes, le dessalage, la perméthylation et l’acquisition et l’analyse de données. Cette étude montre que le dessalage basé sur la chromatographie échangeuse d’ions permet une meilleure récupération des glycanes plus gros et une meilleure qualité des spectres produits par rapport à l’extraction en phase solide par carbone graphitisé poreux (PGC). De plus, ces travaux suggèrent qu’un temps de réaction de perméthylation plus long que celui actuellement utilisé pourrait être nécessaire pour une modification efficace des structures sialylées. Nous démontrons également l’importance et la nécessité des données de fragmentation et de la connaissance préalable des voies de biosynthèse des O-glycanes pour l’identification précise de la composition et de la structure des glycanes et discutons des avantages et des limites inhérents que présente MALDI-TOF dans l’analyse des O-glycanes de mucine.

Introduction

Les mucines sont de grandes glycoprotéines qui constituent la plupart des composants structurels du mucus. Ils sont produits par des cellules épithéliales spécialisées appelées cellules caliciformes et subissent une O-glycosylation étendue avant d’être sécrétés à la surface de la muqueuse. La glycosylation des mucines a lieu dans l’appareil de Golgi, où une famille de glycosyltransférases spécialisées, les polypeptides-N-acétylgalactosamine transférases (ppGalNAc-T) initie le processus en attachant un résidu GalNAc à une sérine (Ser) ou à une thréonine (Thr)¹. Ensuite, un arsenal de glycosyltransférases étend les structures glycanes en ajoutant des résidus de galactose (Gal), de N-acétylglucosamine (GlcNAc), de GalNAc, d’acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et de fucose (Fuc), tandis que d’autres enzymes modifiant les glucides peuvent effectuer des réactions telles que la sulfatation des glycanes¹. Les glycanes qui décorent le squelette protéique de la mucine se trouvent principalement en grappes dans les régions protéiques riches en résidus Ser et Thr, car les groupes hydroxyles sur la chaîne latérale de ces résidus servent de sites d’O-glycosylation. Cette glycosylation dense donne aux mucines l’apparence d’un « pinceau à bouteille » et est responsable de leurs propriétés physiques, telles que la capacité de retenir de grandes quantités d’eau, leur capacité de formation de gel et leur viscoélasticité élevée ^2,3. En raison de ces propriétés, les mucines assurent la lubrification, protègent l’épithélium de la déshydratation et des blessures physiques, et forment une barrière physique entre l’épithélium et son microenvironnement ^4,5. Les glycanes de mucine peuvent également servir de sites de liaison et de source de carbone pour les bactéries commensales ou pathogènes ^6,7,8. L’organisation et la composition du mucus jouent un rôle déterminant dans la protection de l’épithélium en gardant les microbes à proximité, mais loin de la surface de l’épithélium. Les glycanes mucin participent également à la communication et à l’adhésion entre cellules⁹.

Les glycanes de mucine jouent un rôle central dans le maintien de l’homéostasie de la muqueuse, et les profils de glycosylation aberrants de la mucine sont associés à une altération de la fonction barrière, à une altération de la composition du microbiote, à une augmentation des métastases tumorales, aux maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) et à d’autres maladies 10,11,12. Par conséquent, l’étude de la glycosylation de la mucine est importante pour comprendre le rôle du mucus et des mucines dans la santé humaine et peut conduire à de nouvelles approches de gestion ou de traitement des maladies.

Les techniques basées sur la spectrométrie de masse sont parmi les options les plus populaires pour étudier les glycanes de mucine. MALDI-TOF MS est une technique d’ionisation douce qui permet d’analyser de grandes biomolécules non volatiles telles que les glycanes et les glycoprotéines¹³. Cette approche offre une sensibilité élevée et une large gamme de masses, permettant la détection et l’identification de mélanges de glycanes faiblement abondants et diversifiés. De plus, les modèles de fragmentation obtenus à partir d’expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) peuvent fournir des informations structurelles précieuses sur la composition et la séquence¹³ des glycanes.

En règle générale, l’analyse des glycanes liés à l’O à partir des mucines par MALDI-TOF MS implique un flux de travail en plusieurs étapes, où les O-glycanes sont d’abord libérés chimiquement à partir du squelette protéique à l’aide de méthodes telles que l’élimination β réductrice, puis dessalés pour éliminer les sels de la libération chimique et dérivatisés pour améliorer l’ionisation et la détection. Les glycanes purifiés et dérivatisés sont ensuite cocristallisés avec une matrice MALDI appropriée sur une plaque cible MALDI et des spectres de masse sont acquis qui fournissent des informations sur les masses des ions glycanes intacts. Ensuite, les glycanes sont fragmentés dans des expériences MS/MS pour fournir des informations sur la structure des glycanes¹⁴. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour libérer, dessaler et perméthyler les glycanes et les analyser par MALDI-TOF MS.

Protocole

REMARQUE : reportez-vous à la figure 1 pour une représentation schématique du flux de travail.

Figure 1 : Représentation schématique du flux de travail expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Libération de glycanes

1. Préparation du tampon de β-élimination
   REMARQUE : Il doit être préparé frais avant chaque utilisation.
   1. Pesez une pastille d’hydroxyde de sodium (NaOH) et dissolvez-la dans une quantité appropriée de H₂O dans un tube de 50 mL pour obtenir une solution à 0,1 M.
   2. Dans un tube de 5 ml, dissoudre 189 mg de borohydrure de sodium (NaBH₄) dans 5 mL de la solution alcaline préparée ci-dessus à l’étape 1.1.1.
      ATTENTION : Le NaOH est corrosif et le NaBH₄ est corrosif, toxique, inflammable et présente un danger pour la santé. Les deux produits chimiques doivent être manipulés sous une sorbonne à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié. Ne dissolvez pas le NaBH₄ directement dans H₂O, car il se décompose et libère de l’hydrogène qui peut s’auto-enflammer.
2. Mise en place de la réaction de β-élimination
   1. Dans un flacon en verre de 4 mL, dissoudre jusqu’à 100 μg de mucines purifiées dans 250 μL de H₂O.
      REMARQUE : Certaines mucines peuvent ne pas se dissoudre complètement et former plutôt une suspension de très petites particules.
   2. Ajoutez 250 μL de tampon d’élimination de β et fermez hermétiquement le flacon à l’aide d’un bouchon doublé de PTFE. Incuber la réaction à 45 ^°C pendant 16 h.
3. Arrêter la réaction
   1. Dans une bouteille en verre de 100 ml, ajouter 5 ml d’acide acétique glacial à 95 ml de H₂O (concentration de 5 % (v/v)).
      REMARQUE : Il peut être conservé à température ambiante et réutilisé.  ATTENTION : L’acide acétique est inflammable et corrosif et doit être utilisé dans une sorbonne avec l’équipement de protection individuelle nécessaire.
   2. Sur de la glace, ajouter 1 mL de la solution d’acide acétique à 5 % à chaque réaction (étape 1.2.3) au compte-gouttes. À ce stade, recherchez l’effervescence due à la libération d’hydrogène provenant de l’excès de NaBH₄. Si l’effervescence ne s’est pas arrêtée après l’ajout de 1 mL d’acide acétique à 5 %, répétez cette étape.
      REMARQUE : S’il n’y a pas d’effervescence lors de l’ajout d’acide acétique à 5 %, la réaction d’élimination β peut être incomplète ou infructueuse.
4. Dessalage des échantillons
   1. Dans une bouteille en verre de 100 ml, préparer une suspension dense de résine échangeuse de cations, forme H⁺ , 200-400 mesh dans de l’acide acétique à 5 % (v/v).
   2. Branchez une pipette en verre avec une petite quantité de laine de verre. Ajoutez 1,5 ml de la suspension de résine sur la pipette en verre par le haut et laissez-la se déposer et s’égoutter. Cela rendra la colonne de dessalage.
   3. Lavez la résine avec 2 ml d’acide acétique à 5 %. Jetez le flux continu.
   4. Ajouter l’échantillon de mucine dans la colonne de dessalage. Recueillir le flux continu dans un tube de 5 mL.
   5. Rincer les flacons d’échantillon avec 1 mL d’acide acétique à 5 % et les charger dans la colonne de dessalage. Récupérez le flux dans le même tube.
   6. Lavez la colonne 2 fois avec 1 mL d’acide acétique à 5 %. Récupérez le flux dans le même tube.
   7. À l’aide d’un évaporateur centrifuge, l’acide acétique et la concentration des échantillons (5 mbar, 30 ^°C, 2 h).
   8. Congelez les échantillons à -80 ^°C et séchez-les toute la nuit sur un lyophilisateur.
      REMARQUE : Alternativement, l’évaporation centrifuge peut continuer à sécher, mais cela rendra la dissolution des échantillons plus difficile.
   9. Dans une bouteille en verre de 100 ml, ajouter 5 ml d’acide acétique à 95 ml de méthanol (concentration de 5 % (v/v)).
      ATTENTION : Le méthanol est inflammable et toxique. Il doit être utilisé dans une sorbonne avec l’équipement de protection individuelle nécessaire.
   10. Dissoudre les échantillons dans 0,5 mL d’acide acétique méthanolique et sécher les échantillons sous un courant d’azote. Répétez cette étape 3 à 5 fois. Conservez les échantillons séchés à 4 ^°C.
5. Perméthylation des glycanes
   1. Dans un flacon en verre de 8 ml, mélanger une solution de NaOH à 50 % (0,2 ml) avec 0,4 ml de méthanol et bien agiter. Un précipité blanc se formera qui se dissoudra rapidement à nouveau.
   2. À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez 4 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) et agitez abondamment.
   3. Centrifugez la solution pendant 2 min à 2 000 × g. Cela formera un gel au bas du tube, une phase liquide au milieu, et des sels accumulés en haut.
   4. Décanter soigneusement le surnageant et les sels, sans déranger le gel.
   5. Répétez les étapes 1.5.2 à 1.5.4 5 fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sels. Si les sels adhèrent aux parois du tube, faites tourner doucement le tube pour mettre les sels en suspension, sans perturber le gel au fond, ou retirez-les à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
   6. Une fois qu’il n’y a plus de sels, remettre le gel en suspension dans 4 mL de DMSO anhydre. Cette suspension est la base de perméthylation.
      REMARQUE : Cette quantité de base de perméthylation est suffisante pour ~25 échantillons. Les quantités peuvent être ajustées en conséquence.
   7. Aux échantillons séchés, ajouter 100 μL de DMSO anhydre et 150 μL de base de perméthylation. À l’aide d’une pipette en verre, ajoutez 80 μL d’iodométhane le plus rapidement possible, afin d’éviter l’absorption d’humidité de l’environnement.
      ATTENTION : L’iodométhane est toxique et présente un danger pour la santé et l’environnement. Il doit être utilisé dans une sorbonne avec l’équipement de protection individuelle nécessaire.
   8. Incuber les réactions de perméthylation pendant 30 minutes à température ambiante en secouant vigoureusement.
   9. Ajouter 0,5 mL de H₂O pour terminer la réaction. Les échantillons deviendront troubles.
      REMARQUE : Si les échantillons ne deviennent pas troubles, il est possible que la réaction de perméthylation ait été incomplète.
   10. Rincez les échantillons avec de l’azote jusqu’à ce qu’ils deviennent clairs.
   11. Chargez les échantillons sur une plaque d’extraction hydrophile-lipophile équilibrée (HLB) à 96 puits (60 mg) ou des cartouches HLB. Appliquez une pression positive pour pousser les échantillons à travers la phase solide à un débit de ~1 mL/min. Si vous utilisez des cartouches HLB, utilisez une tétine en caoutchouc ou un collecteur à vide pour appliquer une pression sur les échantillons. Jetez le flux continu.
   12. Lavez les puits avec 2 x 1 mL de H₂O. Appliquez une pression positive et jetez le coulet.
   13. Éluer les glycanes de la plaque HLB à l’aide de 1 mL de méthanol. Appliquez la pression uniquement jusqu’à ce que le méthanol commence à sortir de la plaque. Ensuite, le débit gravitaire est suffisant pour donner le débit requis. Récupérez le flux continu.
   14. Répétez l’étape d’élution une fois de plus.
   15. Sécher les échantillons à l’aide d’un évaporateur centrifuge
   16. Dans un flacon en verre de 4 ml, préparer le tampon TA50 en mélangeant 1 ml d’acétonitrile, 998 μL de H₂O et 2 μL d’acide trifluoroacétique.
       ATTENTION : L’acétonitrile est inflammable et l’acide trifluoroacétique est corrosif. Les deux doivent être utilisés dans une sorbonne, à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.
   17. Dans un tube de microcentrifugation, préparer la solution matricielle en dissolvant 10 mg de super-DHB [mélange 9:1 (p/p) d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque et d’acide 2-hydroxy-5-méthoxybenzoïque] dans 1 mL de TA50.
   18. Dissoudre les échantillons séchés dans 10 μL de TA50.
   19. Mélangez 1 μL de l’échantillon avec 1 μL de la solution matricielle, placez-le sur une plaque cible MALDI en acier et laissez-le sécher.

2. Analyse MALDI TOF des échantillons

1. Configuration pour l’acquisition des données parent-ion
   1. Tirez 1 000 coups de laser à 50 % d’intensité.
      REMARQUE : Ceux-ci peuvent varier en fonction des paramètres globaux de l’instrument et peuvent être ajustés selon les besoins.
   2. Sous l’onglet Support laser , réglez le paramètre de marche aléatoire sur l’échantillon complet.
   3. Sous l’onglet Détection , définissez la plage de masse sur 500 - 3 000 ; Augmentez cette plage si de forts pics sont observés à 2 500-3 000 m/z. Réglez le gain du détecteur sur 20x.
      REMARQUE : Le gain peut varier en fonction des paramètres globaux de l’instrument et peut être ajusté si nécessaire.
   4. Sous l’onglet Spectromètre , réglez la polarité sur positive et la suppression de la matrice sur Déviation, 300 Da.
   5. Cliquez sur Démarrer | une fois l’acquisition des données terminée, Enregistrer sous pour enregistrer les données dans un répertoire approprié.
2. Ouverture des spectres parents pour acquérir des spectres de fragmentation
   1. Après avoir cliqué avec le bouton droit de la souris sur les spectres, sélectionnez Rechercher la liste de masse.
   2. Dans la liste générée, sélectionnez les ions pertinents pour la fragmentation et cliquez sur ajouter à la liste MS/MS après avoir cliqué avec le bouton droit de la souris sur les pics sélectionnés.
   3. Cliquez à nouveau avec le bouton droit de la souris sur la liste de masse et sélectionnez la liste MS/MS.
   4. Cliquez sur Envoyer à flexControl.
   5. Sur flexControl, chargez la méthode LIFT et accédez à l’onglet LIFT .
   6. Sélectionnez chaque pic chargé un par un et acquérez les ions parent et fragment en basculant entre les modes parent et fragments. Ajustez l’intensité du laser et le nombre de tirs selon vos besoins. Cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les données après la fragmentation de chaque ion parent.
   7. Exportez les spectres au format '.ascII'.
      REMARQUE : Il peut être importé ultérieurement dans Glycoworkbench pour une analyse plus approfondie.
3. Analyse des données à l’aide de glycoworkbench
   1. Dans Glycoworkbench, chargez le fichier .ascII exporté du spectre de masse et effectuez une correction de base et un filtrage du bruit à l’aide des boutons appropriés en bas de la fenêtre, avant de calculer les centroïdes de crête. Dans la fenêtre contextuelle, choisissez la plage de masse appropriée, le rapport signal/bruit min et l’intensité de crête MS minimale.
   2. Une fois les centroïdes de crête calculés, utilisez l’outil Glyco-Peakfinder pour trouver des compositions de structure correspondant à la liste des pics. Sélectionnez perMe comme dérivatisation, redEnd comme extrémité réductrice et le nombre minimal et maximal de résidus attendus.
      1. Pour les mucines, sélectionnez Hexose, N-Acétyl-Hexosamine, Deoxy-Hexose et N-Acétyl-Neuraminic Acid. Pour les glycanes sulfatés, utilisez l’autre option résidu d’une masse de 87,9. Pour les données MALDI-TOF, réglez les ions Max # Na et les charges Max # sont définis sur 1 et la précision sur 0,5 Da.
         REMARQUE : Il peut être nécessaire d’augmenter encore la précision en fonction de l’étalonnage du spectromètre de masse.
   3. Sélectionnez toutes les annotations correctes en maintenant la touche Ctrl enfoncée et en cliquant sur chaque annotation ; puis faites un clic droit sur l’annotation et cliquez sur Ajouter à la liste des pics annotés.
   4. Pour générer un rapport comparant plusieurs spectres annotés, dans l’onglet Outils , sous Rapports, sélectionnez Créer un rapport comparant différents profils. Imprimez le rapport au format PDF pour l’enregistrer.
   5. Après avoir identifié les pics de glycanes, calculez l’abondance relative de chaque structure individuelle en pourcentage de l’aire totale sous la courbe de tous les pics de glycanes.
   6. Pour l’analyse des spectres de fragmentation, chargez les spectres sur Glycoworkbench et générez la liste des pics comme à l’étape 2.3.1.
   7. Dessinez des structures glycanes présumées qui correspondent aux compositions de glycanes annotées. Générez des fragments pour chaque structure dessinée en sélectionnant l’option de calcul des fragments appropriée dans l’outil Fragments . Ensuite, sélectionnez tous les fragments, faites un clic droit dessus, puis cliquez sur Copier les fragments dans le canevas.
   8. Pour appuyer davantage l’analyse de la fragmentation, sélectionnez un pic d’intérêt en cliquant dessus dans le visualiseur de spectre. Ensuite, en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Trouver toutes les structures correspondant aux pics, interrogez le m/z du pic sélectionné par rapport aux bases de données en ligne pour les structures de glycanes présumées.
   9. Sélectionnez les structures présumées d’intérêt et copiez-les dans la fenêtre de canevas du logiciel après un clic droit et en sélectionnant l’option appropriée.
   10. Pour calculer les fragments possibles qui peuvent être générés à partir de chaque structure de glycane, sélectionnez la structure d’intérêt dans le canevas, puis, sous l’onglet Outils , choisissez Fragments et Calculer les fragments pour la structure actuelle.
   11. Si des fragments pour plus d’une structure de glycane ont été calculés, affichez le tableau de comparaison dans l’onglet Résumé, sous la vue Tableau des fragments.
   12. Sélectionnez les fragments qui correspondent à la liste des pics pour chaque structure de glycane potentielle et sélectionnez Copier les fragments sur le canevas dans le menu déroulant du clic droit.
   13. Dans l’onglet Outils , sous Profileur, sélectionnez Annoter les pics avec toutes les structures , puis cliquez sur Outils | Rapports | Créez un rapport des annotations. Imprimez le rapport au format PDF pour l’enregistrer.

Résultats

Dans les résultats suivants, la mucine gastrique porcine (PGM) a été utilisée pour optimiser les étapes de dessalage et de perméthylation. Pour comparer deux approches de dessalage couramment utilisées, après libération des glycanes, les échantillons ont été dessalés soit par échange cationique (comme décrit dans le protocole ci-dessus) et co-évaporation du borate avec du méthanol, soit par extraction en phase solide avec des cartouches de carbone graphitisé poreux (PGC). Cela nécessite un préconditionnement de la cartouche avec 80 % d’acétonitrile et 100 %_{de H 2}O, une étape de lavage avec de l’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % (v/v) et l’élution des glycanes avec 2 ml d’acétonitrile à 25 % dans l’AGF à 0,1 %, 2 mL d’acétonitrile à 50 % dans l’AGF à 0,1 % et 2 mL d’acétonitrile à 80 % dans l’AGT à 0,1 %.

Les spectres résultants après perméthylation ont été analysés dans la gamme m/z 500 à m/z 2 500. Au total, 33 structures glycanes ont été identifiées dans l’échantillon dessalé par échange d’ions et élimination du borate, tandis que 32 structures ont été identifiées dans l’échantillon dessalé par extraction PGC (figure 2A). Une structure glycane n’a pas été identifiée dans l’échantillon dessalé PGC (marquée d’un astérisque à la figure 2A). Cette analyse comparative a montré que la récupération des glycanes plus gros n’était pas aussi efficace après l’extraction par PGC, par rapport à l’échange d’ions. Cela est également mis en évidence par l’abondance relative de glycanes plus gros, qui représentent 21 % du total des glycanes après extraction PGC, contre 31 % pour l’échange d’ions. De plus, le dessalage par échange d’ions et élimination du borate a conduit à des spectres avec des rapports signal/bruit accrus par rapport à ceux produits après dessalage par extraction en phase solide avec PGC (Figure 2B).

Pour optimiser le temps de réaction de perméthylation, les aliquotes de la même réaction de perméthylation ont été éteintes en ajoutant de H₂O à différents points temporels (c’est-à-dire 5 min, 30 min ou 90 min). Les résultats ont montré que 33 pics de glycanes pouvaient être identifiés dans la gamme m/z 500 à m/z 2 500, dans les échantillons perméthylés pendant 30 ou 90 min, les spectres résultants étant similaires. En revanche, seuls 31 pics de glycanes ont pu être identifiés lorsque la perméthylation a été effectuée pendant 5 min (Figure 3). Il est intéressant de noter que les deux structures qui n’ont pas été identifiées dans ce temps de réaction plus court (marquées d’un astérisque sur la figure 3) sont les deux structures sialylées, ce qui suggère que la modification des acides sialiques n’est pas efficace en 5 min, dans les conditions testées.

La fragmentation a été utilisée pour chaque pic de glycane PGM afin de confirmer la composition en glycanes et de déterminer la structure des glycanes. Deux exemples sont présentés ici (figure 4). La figure 4A présente le spectre de fragmentation d’un pic à 983 m/z. La composition en glycanes est attribuée comme HexNAc₂Hex₂. Il existe deux structures potentielles pour cette composition de glycanes, soit Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glycane 1) ou Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glycane 2). La fragmentation de ce composé a produit un spectre de masse avec des pics qui peuvent être attribués à différents fragments du glycane. Le pic à m/z 529 et le pic à m/z 708 sont caractéristiques des structures 1 et 2, respectivement, et nous pouvons conclure que les glycanes 1 et 2 sont présents dans le mélange de glycanes PGM.

La figure 4B présente le spectre de fragmentation d’un pic à m/z 2 026. Glycoworkbench a calculé deux compositions potentielles de glycanes pour ce pic, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ et Hex₃HexNAc₄dHex₂. La composition sialylée a une précision plus faible (~160 ppm et 178 ppm, respectivement), ce qui suggère que le premier doit être le bon choix. Cependant, le profil de fragmentation indique la présence de Fuc, et non de Neu5Ac ; Par conséquent, la deuxième composition est la bonne. Ici, quatre structures glycanes putatives sont présentées, et le spectre a été annoté avec les fragments calculés de chaque structure glycane présumée. Dans le spectre annoté, on peut voir que des pics caractéristiques uniquement des glycanes 4 et 6 sont présents, alors qu’aucun pic caractéristique des glycanes 3 et 5 n’a été identifié. Sur la base de ces données, nous pouvons conclure que les glycanes 4 et 6 sont présents.

Figure 2 : Comparaison des pics de glycanes en fonction du dessalage et de l’extraction en phase solide. (A) Comparaison du profil glycane des PGM après dessalage soit par chromatographie échangeuse de cations et élimination du borate, soit par extraction en phase solide PGC. (B) Comparaison des deux approches de dessalage dans le rapport signal/bruit résultant pour chaque pic de glycane identifié. L’astérisque spécifie le glycane qui n’a été identifié que dans les échantillons dessalés par échange cationique et élimination du borate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison du profil glycane des platinoïdes après perméthylation pendant 5, 30 ou 90 min. Les astérisques indiquent les glycanes sialylés qui n’ont été identifiés qu’après 30 ou 90 min de perméthylation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Exemples de spectres de fragmentation des glycanes PGM. (A) Fragmentation du pic du glycane à m/z 983. (B) Fragmentation du pic de glycane à m/z 2026. Les cases indiquent les structures potentielles des glycanes. Les chiffres au-dessus des fragments indiquent à partir de quelle structure glycane ils pourraient être dérivés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Pour étudier les glycanes, les chercheurs utilisent diverses méthodologies, allant de l’utilisation de lectines pour identifier des épitopes spécifiques à la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS) et à la résonance magnétique nucléaire (RMN) plus sophistiquées pour obtenir une caractérisation détaillée des structures des glycanes. Les principaux avantages de la méthode MALDI-TOF MS par rapport aux autres approches sont la sensibilité et le caractère à haut débit de la méthode¹³. Cependant, comme il n’est pas possible de séparer les composés isobares, différentes structures de glycanes ayant la même valeur m/z produisent un mélange de fragments sous MS/MS qui est alors difficile à déconvoluer¹³. S’il est nécessaire de déterminer la structure exacte des glycanes de mucine, la LC-MS doit être la méthode de choix.

Nous présentons ici un protocole d’analyse des glycanes mucines par MS MALDI-TOF qui comprend toutes les étapes critiques du processus, de la libération des glycanes, le dessalage et la perméthylation, à l’acquisition et à l’analyse des données. Il est important de reconnaître que chacune de ces étapes peut être réalisée à l’aide d’approches différentes, et qu’elles s’accompagnent toutes d’avantages et de limites.

Dans ce protocole, nous avons utilisé la β-élimination réductrice pour libérer les glycanes. La réaction se déroule dans des conditions basiques. Si les échantillons de mucine sont déjà en suspension et n’ont pas été préalablement purifiés, le pH doit être vérifié à l’aide d’un papier indicateur de pH ; s’il est acide, il doit être augmenté à un pH de ~8-9. Une limite de cette approche est que les conditions de base requises pour la libération des glycanes conduisent également à l’hydrolyse et, par conséquent, à la perte des groupes O-acétyle souvent trouvés sur les acides sialiques, dans une réaction connue sous le nom de saponification.

Alors que d’autres méthodes ont été décrites dans la littérature pour la libération de glycanes 15,16,17,18, dont certaines peuvent préserver les groupes O-acétyle labiles, la β-élimination réductrice reste la référence dans le domaine. Cette approche nécessite une forte concentration de sels. Les sels et autres contaminants suppresseurs d’ions doivent ensuite être éliminés avant l’analyse MALDI-TOF¹⁹, car ils peuvent affecter l’efficacité de l’ionisation et la quantification des glycanes. Ici, la chromatographie d’échange cationique, suivie de l’élimination du borate par évaporation du méthanol, s’est avérée être l’approche la plus efficace pour dessaler les glycanes libérés par la mucine. Dans ce cas, les glycanes n’interagissent pas avec la résine et s’écoulent à travers elle, tandis que les ions sodium sont piégés sur la résine. Cependant, la préparation des colonnes d’échange d’ions est laborieuse et rend cette approche inefficace pour les expériences à grande échelle avec de nombreux échantillons. Dans de tels cas, le dessalage PGC peut être préféré, car cette résine est également disponible dans un format de plaque à 96 puits. Cependant, comme nous l’avons vu plus haut, le dessalage par extraction par AGP peut entraîner une élution inefficace, en particulier des glycanes plus gros, et cela doit être pris en compte lors de l’interprétation des résultats.

Bien que les glycanes natifs puissent également être analysés par MALDI-TOF, la perméthylation est généralement utilisée, car cette réaction augmente considérablement la sensibilité de détection, car les glycanes natifs ont une faible efficacité d’ionisation²⁰. De plus, la perméthylation facilite la détection des glycanes chargés négativement, tels que les glycanes sulfatés ou sialylés, en mode positif et préserve les épitopes des glycanes labiles, tels que les acides sialiques ou le fucose²⁰. Le plus souvent, la perméthylation est laissée pendant 5 à 10 min^14,21, certains rapports permettant à la réaction de se poursuivre jusqu’à 40 min²². Ici, nous avons montré que, dans les conditions testées, les glycanes sialylés n’étaient pas détectés efficacement après 5 min de perméthylation, et qu’une incubation plus longue était nécessaire.

En plus du temps de réaction, un autre facteur qui peut affecter l’efficacité de la perméthylation est la teneur en eau de la réaction. La présence d’eau peut entraîner une sous-méthylation ou une méthylation partielle des glycanes, où tous les groupes hydroxyles n’ont pas été convertis en groupes méthyles²³. Cela peut facilement être déterminé car si une sous-méthylation s’est produite, des groupes de pics qui diffèrent de 14 Da (la différence de masse entre les groupes hydroxyle et méthyle) peuvent être observés dans les spectres de masse. Ce problème peut être résolu en répétant la réaction de perméthylation et en réanalysant les données.

Un facteur limitant dans l’analyse des glycanes est l’interprétation des spectres. Malgré les progrès récents, ce processus est encore largement manuel et nécessite une bonne connaissance et une bonne compréhension des voies de biosynthèse des glycanes pour annoter avec précision les spectres. Des outils tels que Glycoworkbench²⁴ peuvent aider en fournissant des annotations, des structures et des compositions de glycanes possibles, mais en raison de l’hétérogénéité inhérente aux mélanges de glycanes, les chercheurs doivent toujours décider quel choix est le bon. Dans l’exemple présenté ci-dessus en utilisant des PGM, Glycoworkbench a proposé deux compositions potentielles de glycanes pour le pic à mz 2,025,7620, et sur la base du profil de fragmentation, nous avons conclu que la structure fucosylée était présente, plutôt que la structure sialylée. Cependant, si un spectre de fragmentation n’était pas disponible (ce qui est souvent le cas pour les glycanes faiblement abondants), les chercheurs peuvent baser l’annotation sur le fait que les glycanes avec une composition de Hex3HexNAc1Neu5Ac3 se trouvent sur des gangliosides, plutôt que sur des mucines, et que cette option ne doit donc pas être envisagée dans le contexte des PGM. Ainsi, les structures ou compositions de glycanes identifiées doivent être référencées à des publications antérieures et doivent être en accord avec les principes de biosynthèse des O-glycanes. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une ressource précieuse, en particulier pour les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine de la glycobiologie et qui s’intéressent à l’étude des interactions se produisant à l’interface de la muqueuse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipettes pasteur en verre de 150 mm	Fisher Scientific	15202699	Consommables Référence dans le texte (si applicable) : pipette en verre
Tubes de 5 mL	Eppendorf	30122305	Consommables
Plaque d’extraction HLB à 96 puits	Fisher Scientific	16553290	Consommables
acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283	Réactif
acétonitrile	Fisher Scientific	15624520	Réactif
DMSO anhydre	Sigma-Aldrich	5.89569	Réactif
Méthanol anhydre	Sigma-Aldrich	5.89596	Réactif
Spectromètre de masse Autoflex	Bruker		Équipement
Résine DOWEX 50w x8, forme H+, maillage 200-400	Sigma-Aldrich	44519	Réactif Référence dans le texte (si applicable) : résine d’échange cationique
Chauffe-bloc sec	Subvention	QBD2	Équipement
Évaporateur/Concentrateur pour chauffages à blocs	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Équipement
flexAnalyse	Bruker		Logiciel, propriétaire & nbsp ;
flexControl	Bruker		Logiciel, propriétaire & nbsp ;
Genevac EZ-2	Biopharma	EZ-2	Équipement Référence dans le texte (si applicable) : évaporateur centrifuge
Fioles en verre avec des capuchons en PTFE assortis (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Consommables
Fioles en verre avec des capuchons en PTFE assortis (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Consommables
laine de verre	Supelco	1.04086	Consommables
Établi glyco-type	NA		Logiciel; téléchargeable depuis https://glycoworkbench.software.informer.com/
Cartouches HLB SPE	Supelco	57493-U	Consommable, en alternative à la plaque d’extraction HLB à 96 puits
Iodométhane	Sigma-Aldrich	289566	Réactif
Plaque cible MALDI	Bruker		Équipement
Lyophilisateur ModulyoD	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Équipement Référence dans le texte (si applicable) : lyophilisateur
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Réactif
Pellets NaOH	Sigma-Aldrich	567530	Réactif
Solution NaOH 50 %	Sigma-Aldrich	415413	Réactif
Processeur à pression positive-96	Eaux	186006961	Équipement
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Réactif
Acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	T6508	Réactif