Article de méthode

Transduction rétrovirale efficace et guidage compétitif pour l’étude de la localisation des lymphocytes T médiée par les RCPG dans divers microenvironnements tissulaires

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DOI :

10.3791/67754

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28 mars 2025

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1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Palo Alto Veterans Institute for Research, 3Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Dans cet article

Résumé

Nous présentons des protocoles améliorés pour la transduction rétrovirale des récepteurs de trafic et le guidage compétitif afin d’étudier le positionnement des lymphocytes spécifiques aux organes et au microenvironnement médiés par les récepteurs. Cette méthode offre des informations précieuses sur les mécanismes de trafic des cellules immunitaires et a des applications potentielles dans la recherche fondamentale et thérapeutique future.

Résumé

Comprendre comment l’expression du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) affecte le positionnement cellulaire dans divers microenvironnements tissulaires est essentiel pour élucider les mécanismes de trafic des cellules immunitaires. Nous présentons un test de guidage compétitif conçu pour étudier la localisation des lymphocytes T médiés par les RCPG dans les organes exprimant leurs ligands chimioattractants apparentés, applicable à la fois aux études à court et à long terme. L’approche implique un protocole amélioré pour la transduction des lymphocytes T par le virus des cellules souches murines recombinantes (MSCV) afin d’exprimer le RCPG d’intérêt ou une construction de contrôle, suivie d’un retour compétitif chez les souris receveuses. La distribution cellulaire entre les différents organes est analysée à l’aide de la cytométrie en flux et/ou de la microscopie confocale. Dans des expériences à court terme (10-12 h), la microscopie confocale a révélé des schémas de localisation cellulaire distincts, y compris vers les alvéoles, les bronches sous-muqueuses, les sites veineux et l’interstitium dans le poumon, ainsi que l’épithélium tapissant la trachée, l’estomac et la corne utérine. Dans des études à long terme (1 à 7 semaines), la cytométrie en flux a fourni des informations sur l’accumulation cellulaire préférentielle, révélant des changements dynamiques et une maturation ou un repositionnement potentiel dans les tissus au fil du temps. Ce test de guidage compétitif est un outil robuste pour étudier le positionnement cellulaire médié par les RCPG, offrant des informations précieuses sur la distribution spécifique des tissus et les applications potentielles en immunologie et en recherche thérapeutique.

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont fondamentaux dans la régulation d’une variété de processus cellulaires, notamment la transduction du signal, la neurotransmission, la régulation hormonale et la migration des cellules immunitaires1. Ils jouent un rôle crucial dans le contrôle spatio-temporel de la migration et de la localisation des lymphocytes2. Au cours de la phase d’amorçage des réponses immunitaires, le microenvironnement local et les interactions cellulaires incitent les lymphocytes T à exprimer un ensemble unique de molécules d’adhésion et de récepteurs de chimiokines connus sous le nom de récepteurs homing. Cette adaptation permet aux lymphocytes T expérimentés par l’antigène de s’engager avec des cellules endothéliales (CE) spécifiques à un organe et de migrer vers des tissus cibles distincts. La capacité des lymphocytes T à acquérir un tropisme tissulaire est essentielle pour des réponses de rappel efficaces, en particulier dans le contexte d’infections récurrentes affectant le même organe 3,4.

Les RCPG guident les cellules immunitaires vers des tissus et des organes spécifiques où elles remplissent des fonctions essentielles, comme diriger les lymphocytes T et NK CD8+ vers les sites tumoraux pour une action cytotoxique ou aider les lymphocytes T CD4+ à orchestrer les réponses immunitaires en soutenant l’activation d’autres cellules immunitaires. Comprendre comment les RCPG dirigent les lymphocytes T vers leurs emplacements précis est essentiel pour faire progresser les immunothérapies ciblées 5,6. Le défi, cependant, réside dans la modélisation de ces interactions complexes in vitro, car il est difficile de reproduire simultanément des signaux spatialement restreints et des signaux chimiotactiques directionnels.

Il est également souvent difficile d’élucider les rôles de récepteurs leucocytaires spécifiques en raison de leur fréquence d’expression limitée dans les populations endogènes et du fait que ces récepteurs décorent généralement des types de cellules distincts. Cette complexité rend difficile l’isolement du rôle d’un récepteur spécifique à partir d’autres mécanismes spécifiques à un sous-ensemble cellulaire. Idéalement, les méthodes devraient comparer des populations similaires, ne différant que par le récepteur d’intérêt pour fournir des informations claires.

Pour surmonter ces défis, nous avons adopté un test de guidage compétitif qui utilise la transduction rétrovirale recombinante du MSCV pour une expression efficace des RCPG dans les lymphocytes T. Les vecteurs rétroviraux MSCV, qui combinent des éléments des vecteurs MESV basés sur le virus du sarcome myéloprolifératif (PCMV) et des vecteurs LN basés sur le virus de la leucémie murine Moloney (MMLV), intègrent un signal d’emballage hybride étendu dérivé des vecteurs LN7. Cette modification améliore l’efficacité de l’administration des gènes, permettant des études à court et à long terme de la localisation des lymphocytes T in vivo. En utilisant des particules rétrovirales à titre élevé et la microscopie confocale, l’approche permet une visualisation précise du positionnement et des interactions des lymphocytes T dans des environnements tissulaires complexes. Nous présentons des protocoles détaillés pour la transduction rétrovirale des récepteurs de trafic et la réalisation de tests de guidage contrôlés en interne (dits compétitifs) pour étudier le positionnement des lymphocytes spécifiques aux organes et au microenvironnement médiés par les récepteurs. L’objectif global de cette méthode est de fournir des informations précieuses sur les mécanismes de trafic des cellules immunitaires et de permettre des applications futures dans la recherche fondamentale et le développement thérapeutique.

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Protocole

Toutes les souris de cette étude ont été maintenues dans des installations exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SPF) du système de soins de santé des anciens combattants de Palo Alto (VAPAHCS). Les souris B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) et Rag1-/- ont été achetées à Jackson Laboratories. Bien que nous ayons utilisé PepBoy pour obtenir des cellules CD45.1, nous recommandons d’utiliser JAXBoy (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy est une souche entièrement coisogénique générée par CRISPR au lieu du rétrocroisement traditionnel, ce qui améliore la cohérence génétique. Historiquement, les études marquées par l’allotype CD45 utilisant des souris PepBoy (CD45.1), qui ne sont pas entièrement congéniques, ont inclus des tests de contrôle par guidage et de recirculation avec des comparaisons de type sauvage (WT/WT) pour tenir compte de la variabilité potentielle. Les souris JAXBoy étant désormais disponibles en tant qu’alternative entièrement isogénique, ces contrôles supplémentaires pourraient ne plus être nécessaires. Les chercheurs devraient toujours tenir compte du fait que les différences entre les variants CD45.1 et CD45.2, telles que leurs rôles en tant que protéines tyrosine phosphatases, peuvent influencer le comportement cellulaire et les modèles de ralliement. Tous les protocoles discutés dans le texte et ci-dessous ont été approuvés ou répondent aux directives du Département accrédité de médecine des animaux de laboratoire et du Groupe administratif sur les soins aux animaux de laboratoire du système de soins de santé VA Palo Alto (VAPAHCS). Les animaux ont été sacrifiés selon des procédures approuvées. Des souris des deux sexes, âgées de 8 à 12 semaines, ont été incluses dans les expériences.

1. Préparation du vecteur MSCV

  1. Achetez le vecteur rétroviral MSCV-IRES-Thy1.1 avec la région codante du gène d’intérêt (GOI) de la souris ou un ORF_Stuffer (contrôle ORF négatif)
    REMARQUE : Cette construction comprend le marqueur de surface Thy1.1 à côté du gène d’intérêt GPCR. L’agent de liaison IRES (Internal Ribosome Entry Site) permet la co-expression du RCPG avec le Thy1.1, facilitant ainsi l’identification des cellules transduites par cytométrie en flux ou purification et isolement par billes magnétiques. Ceci est particulièrement utile lorsque les anticorps spécifiques aux RCPG ne sont pas disponibles, comme c’est souvent le cas avec les RCPG mal étudiés.
  2. Procurez-vous le plasmide MSCV sous forme bactérienne et cultivez-le en inoculant du bouillon Luria-Bertani (LB) complété par une sélection d’antibiotiques appropriée basée sur le gène de résistance codé par le plasmide (par exemple, ampicilline, kanamycine ou chloramphénicol). Le milieu LB est composé de tryptone (10 g/L), d’extrait de levure (5 g/L) et de NaCl (10 g/L), ajusté à un pH de 7,0 et stérilisé par autoclavage. Incuber la culture à 37 °C dans un incubateur à agitation (220 tr/min) pendant la nuit.
  3. Préparez des stocks de plasmides à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard à l’aide d’un kit de préparation d’ADN.
  4. Après l’isolement de l’ADN, mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et préparer des solutions de plasmides fonctionnelles à une concentration de 1 μg/μL. Stocker les plasmides à -20 °C pour une utilisation future.

2. Mise en place de la culture de lignées cellulaires d’emballage

REMARQUE : Nous avons utilisé des cellules Platinum E (Plat-E) de Cell Biolabs. Les cellules Plat-E sont une lignée cellulaire à base de 293T avec un promoteur EF1α, qui fournit une expression stable et à haut rendement de protéines structurelles rétrovirales (gènes gag, pol et env), permettant un empaquetage rétroviral avec une seule transfection plasmidique8. Bien que d’autres lignées cellulaires, telles que NIH-3T3 ou 293T, puissent être utilisées, nous n’avons pas testé ces alternatives.

  1. Préparez le milieu cellulaire Plat-E en ajoutant du DMEM, du FBS à 10 %, de la pénicilline/streptomycine à 1 %, de la blasticidine (10 μg/mL) et de la puromycine (1 μg/mL). Utilisez la blasticidine et la puromycine pour l’entretien des cellules, mais omettez-les pendant et après la transfection.
  2. Les cellules Plate Plat-E ont été expédiées congelées dans 1,0 mL, à >3 x 106 cellules/mL dans du DMEM, 20 % FBS et 10 % DMSO. Décongelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Transférez toutes les cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL contenant du milieu de culture Plat-E.
  3. Centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu Plat-E en pipetant doucement pour créer une suspension unicellulaire.
  4. Ajouter 9 mL de milieu Plat-E dans une boîte de culture de 10 cm, puis transférer 1 mL de cellules remises en suspension dans la boîte. Confirmez que les cellules décongelées sont viables en mélangeant un volume égal de suspension cellulaire et de Trypan Blue et en comptant les cellules viables (non colorées) et mortes (colorées en bleu) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules, en visant une viabilité de >70 %.
  5. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Ne changez pas de milieu pendant les 3 premiers jours ; Il est normal d’observer des cellules flottantes et mortes dès le premier dégel.
  6. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 85 % à 90 %, les laver avec du DMEM/PBS Ca-/Mg-. Détacher les cellules à l’aide de 2 ml de trypsine à 0,05 % / 0,5 mM d’EDTA et incuber pendant 3 min à 37 °C. Ajouter 8 mL de milieu Plat-E, recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Fendre à un rapport de surface de 1:10 ou 1:5 (c’est-à-dire semer de nouvelles plaques avec 1/10 ou 1/5 du volume total du plat d’origine). Remettre en suspension dans un volume final de 10 mL de milieu Plat-E et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2.
  8. Aliquote le reste des cellules dans 1 mL de FBS avec 10 % de DMSO et congélation à -80 °C puis dans de l’azote liquide pour une utilisation à long terme.
    REMARQUE : Traiter les cellules comme décrit ci-dessus lorsqu’elles sont proches de 85 % confluentes. Pour maintenir une santé cellulaire optimale, évitez la sur-confluence et visez des fractionnements de 3 jours avec une dilution de 1:10. Si la croissance ralentit, utilisez une aliquote fraîche. Les performances cellulaires diminuent généralement avec les passages suivants. Nous recommandons d’utiliser des cellules pour la transfection entre les passages 4 et 15 pour de meilleurs résultats.

3. Production de cellules transduites

  1. Jour 1 : Graine des cellules Plat E
    REMARQUE : Calculez le nombre de cellules et de plaques Plat E requises. Nous avons utilisé 1 mL de surnageant viral par puits dans une plaque de 24 puits pour transfecter les cellules 2x. Nous utilisons généralement environ deux plaques transfectées en boîte de Pétri de 10 cm avec des cellules E par plaque de 24 puits avec des cellules T en culture.
    1. Commencez par enduire des plaques de culture tissulaire de 10 cm avec 5 ml de poly-D-lysine à 50 μg/mL dans de l’eau stérile. Incuber à température ambiante pendant 45 min. Lavez 2 fois avec du PBS stérile Ca-/Mg - pour vous assurer qu’il ne reste aucun résidu.
      REMARQUE : Nous recommandons d’enrober les plaques car les cellules Plat-E ont tendance à se détacher après la transfection, ce qui entraîne de mauvaises performances cellulaires et une production réduite de titres viraux.
    2. Détachez les cellules Plat-E comme décrit ci-dessus à l’étape 2.6 et effectuez un test d’exclusion au bleu trypan pour assurer la viabilité. Mélangez un volume égal de suspension cellulaire et de Trypan Blue. Comptez les cellules viables (non colorées) et mortes (colorées en bleu) à l’aide d’un hémocytomètre/compteur de cellules. Semez 3 cellules vivantes de 10 cm dans une boîte de Pétri de culture tissulaire de 10 cm avec un milieu Plat-E sans antibiotique.
      REMARQUE : Les plaques ensemencées doivent atteindre 85 % à 90 % de confluence le lendemain. Si ce n’est pas le cas, envisagez d’utiliser une autre aliquote de cellule. Ajuster la densité de semis en fonction du moment du placage ; Pour le dressage du soir, 3,5 x 106 cellules peuvent être utilisées.
  2. Jour 2 : Transfection des cellules Plat-E et plaques d’enrobage des lymphocytes T avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28
    1. Remplacer le milieu sur les cultures cellulaires Plat-E par 6,5 mL de milieu sérique réduit.
    2. Préparez le mélange de transfection selon les instructions du fabricant pour le réactif de lipofectamine (Lipofectamine 2000 a été utilisé dans cette étude).
    3. Pour chaque plaque, mélangez 45 μL de Lipofectamine 2000 avec 210 μL de milieu sérique réduit dans un tube, et 15 μg d’ADN avec 235 μL de milieu sérique réduit dans un autre tube. Combinez le contenu des tubes en pipetant 3x-4x.
    4. Incuber le mélange pendant 5 à 20 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes lipofectamine/ADN, puis ajouter goutte à goutte dans les plaques. Incuber les plaques pendant 16 h à 37 °C.
    5. Puits d’activation des lymphocytes T : Enduire les plaques de 24 puits avec 5 μg/mL de CD28 (37,51) et 10 μg/mL de CD3 (145-2c11) dans 375 μL/puits PBS pendant une nuit à 4 °C ou pendant 3 à 4 h dans l’incubateur à 37 °C le jour 3.
      REMARQUE : Enveloppez les plaques dans un film transparent si vous incubatez pendant la nuit pour éviter l’évaporation. L’activateur de souris Dynabeads CD3/CD28 peut être utilisé comme alternative avec des résultats comparables.
  3. Jour 3 : Changer de média Plat-E et isoler et activer les lymphocytes T
    1. Remplacez le milieu de transfection Plat-E par 14 ml de milieu complet DMEM le matin. Préparez le milieu cellulaire T en ajoutant RPMI-10 : RPMI 1640 avec L-glutamine, 10 % FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 x MEM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μM de β-mercaptoéthanol et 1 mM d’HEPES.
    2. Euthanasier les souris JAXBoy (CD45.1) et C57B6/J (CD45.2) en utilisant l’inhalation de CO2suivie d’une luxation cervicale. Isolez la rate et les ganglions lymphatiques dans des conditions stériles.
    3. Écrasez doucement les rates sur une passoire à mailles de nylon de 100 μm avec un milieu RPMI dans une plaque à 6 puits à l’aide d’un piston de seringue.
    4. Transvaser la solution à travers une crépine à mailles de nylon de 40 μm pour une suspension à cellule unique dans un tube conique de 50 mL. Centrifugez à 450 x g pendant 5 min à 4 °C et lavez-les avec du PBS Ca-/Mg-.
    5. Effectuez une sélection négative magnétique à l’aide du kit d’isolation Mouse T/T CD4 en suivant les instructions du fabricant, ou bien triez les cellules à l’aide d’un FACS stérile
    6. Comptez les lymphocytes T à l’aide d’un compteur de cellules et placez-les dans les puits d’activation des lymphocytes T à raison de 1-1,5 x 106 par puits dans 1 mL de milieu RPMI-10 par puits. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié. Attendez 24 à 48 h pour une activation correcte, telle qu’évaluée au microscope, comme expliqué dans les notes ci-dessous.
      REMARQUE : La réticulation de CD3 et CD28 active efficacement les lymphocytes T dans cette configuration. Une rate de souris produit généralement environ 1 x 108 splénocytes. Les lymphocytes T CD4+ représentent généralement environ 10 % de la population totale de splénocytes. Par conséquent, pour préparer une plaque de 24 puits avec 1-1,5 x 106 cellules T CD4+ par puits, on estime que les cellules de 2-3 souris seront suffisantes.
  4. Jour 4 : Transduction
    1. Vérifiez les lymphocytes T après 24 h au microscope. Assurez-vous que les lymphocytes T sont dans un état d’explosion (formant des grappes et apparaissant agrandis en raison de l’activation) avant la transduction. Les lymphocytes T dynamités garantissent qu’ils sont dans un état de division, ce qui est crucial pour la transduction du MSCV9.
    2. Prélever ~10 mL de surnageant viral à partir des plaques de 10 cm dans un tube conique. Remplacez les plaques de culture Plat-E par 10 mL supplémentaires de milieu Plat-E sans antibiotiques afin d’obtenir suffisamment de milieu pour générer plus de milieu pour une deuxième transduction le lendemain. Ajustez le volume du fluide dans les plaques PLAT-E en fonction du nombre de puits de cellules T qui doivent être transfectés le lendemain.
      REMARQUE : La transduction 2x améliore considérablement l’efficacité.
    3. Filtrez le surnageant viral en passant à travers un filtre à seringue de 0,45 μm. Ajouter 8 μg/mL de polybrène et 1:100 HEPES.
    4. Faites tourner la plaque de cellules T à 24 puits pendant 7 min à 950 x g. Prélevez et conservez soigneusement le surnageant sans déloger les cellules. Ce surnageant contient des cytokines et d’autres facteurs sécrétés par les lymphocytes T après l’activation et remplacés par ce surnageant après la spinfection pour maintenir le profil de cytokines et de facteurs favorisant la prolifération et la croissance des lymphocytes T.
    5. Effectuer la spinfection en ajoutant 1 mL de surnageant viral dans chaque puits et en tournant à 1 150 x g pendant 4 h à 32 °C. Scellez les plaques avec une pellicule plastique pendant la spinfection.
    6. Après la spinfection, remplacez soigneusement le milieu par le surnageant de cellules T précédemment enregistré.
  5. Jour 5 : Transduction répétée
    1. Répétez la transfection comme décrit le jour 4. Si vous le souhaitez, mélangez le surnageant enregistré à l’étape 3.4.3 des lymphocytes T initialement activés avec un milieu frais dans un rapport de 1:1 si le milieu semble épuisé.
  6. Jour 6 : Laver les cellules et les dilater
    1. Laver les cellules avec du PBS Ca+/Mg+. et transférez-les dans une nouvelle plaque de culture avec 130 U/mL d’IL2 de souris et 10 ng/mL d’IL7 de souris. Incuber les cellules pendant au moins 2 jours ou jusqu’à ce qu’elles atteignent le niveau d’expansion souhaité, en fonction du nombre de cellules nécessaires à l’injection.
  7. Jour 8 : Récolte et purification
    1. Récoltez les cellules et purifiez-les avec un gradient de densité Histopaque 1.077.
      REMARQUE : Cette technique permet d’isoler les cellules viables (comme les lymphocytes ou d’autres cellules immunitaires) des cellules mortes ou des débris. Les cellules mortes, qui ont une densité plus élevée, se déposent au fond du tube, tandis que les cellules viables restent généralement dans la couche d’interface.
    2. Ajouter 5 ml d’Histopaque 1.077 dans un tube de 15 ml. Récoltez les cellules par centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    3. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de PBS Ca+/Mg+. Superposez soigneusement la suspension cellulaire sur 5 ml d’Histopaque 1.077 dans le tube à centrifuger.
    4. Centrifugeuse à 400-500 x g pendant 20 min à température ambiante, en veillant à ce que la pause/accélération de la centrifugeuse soit réglée à zéro.
    5. Après la centrifugation, les cellules se séparent en couches distinctes en fonction de leur densité. Les cellules souhaitées se trouvent généralement à l’interface entre l’Histopaque et le milieu supérieur, tandis que les cellules mortes se déposent en bas. Prélevez soigneusement la couche cellulaire au niveau de la couche d’interface à l’aide d’une pipette, en évitant la contamination par d’autres couches. Les cellules collectées sont maintenant prêtes et propres pour les injections.
    6. Évaluez l’efficacité de la transduction en effectuant une coloration Thy1.1 et une analyse par cytométrie en flux. Voir la stratégie de contrôle dans la figure 1.
      REMARQUE : Après la transduction, les cellules peuvent être utilisées dans des tests de chimiotaxie pour évaluer leur migration vers des chimiokines spécifiques par rapport aux cellules vectrices de contrôle afin de confirmer fonctionnellement leur activité in vitro avant de procéder aux injections.
  8. Essai de localisation in vivo à long terme
    1. Pour le guidage à long terme, utilisez CD45.1 pour le RCPG de souris d’intérêt et CD45.2 pour les cellules vectorielles vides (ou vice versa) transduites. Mélangez les deux populations cellulaires dans un rapport de 1:1.
    2. Injecter par voie intraveineuse 20-30 x 106 cellules totales pour chaque souris receveuse adulte Rag1-/- pendant 1 semaine de tropisme et 5 x 106 pour un tropisme de 7 semaines. Nous utilisons des receveurs de Rag1-/- déficients en lymphocytes pour réduire la compétition avec les lymphocytes T endogènes.
    3. Après 1 à 7 semaines (selon l’étude), injectez l’anticorps anti-CD45 par voie intraveineuse (i.v.) dans les souris 5 min avant la récolte pour marquer les cellules transmissibles par le sang.
    4. Euthanasier les souris en utilisant l’inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale.
      REMARQUE : Des études de 1 semaine et 7 semaines ont été menées ; Des études plus longues pourraient être possibles, mais n’ont pas encore été testées.
    5. Récolter des cellules de différents organes d’intérêt et de contrôle. Digérer les tissus selon les protocoles standard de préparation des lymphocytes pour chaque organe10,11.
    6. Colorer les cellules collectées avec des anticorps monoclonaux (mAbs) pour l’analyse cytométrique en flux.
  9. Ralliement compétitif à court terme : positionnement et imagerie des lymphocytes T
    1. Nous recommandons d’utiliser des souris C57B6/J comme donneuses, étant donné que nous marquerons les cellules par fluorescence. Cependant, pour des essais de guidage très courts pouvant durer jusqu’à quelques heures, n’importe quelle souche peut être utilisée.
    2. Au jour 8 de la culture, isolez magnétiquement les cellules transduites (Thy1.1+) à l’aide de microbilles CD90.1, conformément aux instructions du fabricant12.
    3. Ne maintenir que les cellules transduites (pureté de >95 %) en culture après ce point pendant 2 jours sous IL2 et IL7 comme indiqué ci-dessus et laisser se développer. Les microbilles sont biodégradables et après 48 heures, elles n’altèrent pas le fonctionnement normal des cellules.
    4. Au jour 11, marquez les cellules exprimant le RCPG d’intérêt avec de l’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE est un colorant cellulaire fluorescent). Pour les cellules de remplissage, utilisez un colorant fluorescent jaune, ou vice versa. Vous pouvez utiliser des colorants alternatifs si vous préférez.
      1. Préparer une suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/mL dans un IPRP avec 2 % de FBS. Incuber les cellules avec le colorant à une concentration finale de 5 μM à 37 °C dans un bain-marie avec agitation douce pendant 20 min. Pour obtenir des résultats comparables, alternez les affectations de colorants dans des expériences distinctes. Vous pouvez également utiliser un seul colorant pour étiqueter un type de cellule commun en tant qu’étalon interne, y compris les cellules expérimentales et les cellules de contrôle chez différents receveurs.
      2. Lavez les cellules marquées et mélangez-les dans un rapport de 1:1. Estimez la concentration des cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Injecter 15-30 x 106 cellules par voie intraveineuse chez des souris receveuses (WT ou souris receveuses transgéniques, selon le but de l’expérience).
    5. Environ 10 à 12 heures plus tard, injectez aux souris un anticorps anti-CD31 (par exemple, marqué DyLight 633, clone 390), qui devrait être 10 à 15 minutes avant le sacrifice pour délimiter les vaisseaux sanguins et distinguer les cellules intravasculaires des cellules extravasées.
    6. Euthanasier les souris en utilisant l’inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale. Analyser la localisation cellulaire par FACS des suspensions cellulaires comme décrit à l’étape 3.8 ci-dessus ou en imageant des montages entiers de tissus comme à l’étape 3.9.8 ou à l’étape 3.9.7 pour les organes d’intérêt à l’aide de la microscopie confocale.
    7. Pour les organes minces tels que la trachée, la corne utérine ou les ganglions lymphatiques, préparez des supports de courge. Placez le mouchoir sur une diapositive avec du ruban adhésif double face sur les côtés, ajoutez quelques gouttes de solution de montage Fluoromount-G, couvrez avec une lamelle et appuyez doucement et uniformément pour fixer la lamelle au ruban à l’aide d’une lame séparée ou d’un autre objet plat.
    8. Pour les sections congelées, incorporez le tissu dans le composé à température de coupe optimale (OCT). Pour les poumons, perfuser avec 50 % d’OCT/PBS avant l’enrobage.
    9. Utilisez la cytométrie en flux pour les organes de contrôle tels que les ganglions lymphatiques périphériques (NPL), la rate ou le sang pour évaluer l’efficacité de la transduction ( % Thy1.1+) comme le montre la figure 1 et normaliser les résultats. Visualisez le PLN avec des supports ou des coupes de squash à l’aide de la microscopie confocale. Comptez les cellules à l’aide de la microscopie confocale avec le logiciel Imaris.
    10. Déterminer le rapport entre les cellules transduites par RCPG et les cellules témoins (transduites par Stuffer) dans des organes entiers ou des compartiments d’organes spécifiques. Normaliser en fonction des rapports d’entrée déterminés par FACS et/ou en fonction du rapport récupéré des organes de contrôle lorsque le RCPG est connu ou présumé non pertinent.
    11. Pour l’analyse de la localisation microenvironnementale dans les poumons, mesurez la distance des cellules par rapport aux repères histologiques (par exemple, les membranes basales bronchiques ou les veines) à l’aide du logiciel Imaris.

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Résultats

Dans cette étude, nous présentons un protocole détaillé pour étudier la capacité de récepteurs spécifiques à diriger la localisation des lymphocytes T in vivo. Comme démonstration de ce protocole, nous avons utilisé le GPR2513. Nous sommes en mesure d’atteindre une efficacité de transduction de 30 à 40 % en utilisant ce protocole, comme l’évalue la coloration Thy1.1 par cytométrie en flux. Nous avons effectué des tests de chimiotaxie in vitro basés sur le transpuits en utilisant des cellu...

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Discussion

Le test de guidage contrôlé en interne décrit dans cette étude est une méthode complète pour examiner le trafic et le positionnement des lymphocytes T médiés par les RCPG dans divers organes et microenvironnements tissulaires. Cette approche intègre plusieurs optimisations critiques pour améliorer la reproductibilité, la précision et l’efficacité.

Un aspect essentiel de ce protocole est la transduction efficace des lymphocytes T à l’aide de vecteurs rétrovirau...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Soutenu par les subventions R01 AI178113 et R01 AI047822 des NIH, la subvention 1903-03787 du Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust, et les subventions du Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) T31IP1880 et T33IR6609 à l’ECB ; Y.B. a été soutenu par une bourse de recherche de la Crohn’s and Colitis Foundation of America (835171). B.O. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation Ramon Areces (Madrid, Espagne) et une bourse de recherche de la Fondation américaine pour la maladie de Crohn et la colite (574148). Les AA ont reçu l’appui du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) - EDUC2-12677.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AF647 anti souris CD90.1-Thy1.1 (OX-7)Biolegend  ;202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)InvivoMab  ;BE0377
anti-souris CD28 37.51eBiosciences  ;
anti-souris CD3 145-2C11eBiosciences  ;
APCCy7 anti souris CD3 (145-2c11)Biolegend  ;100329
BV421 anti souris CD8b  ; (Ly-3)Biolegend  ;126629
BV711 anti-souris CD4 (RM4-5)  ;Biolegend  ;100549
Microbilles CD90.1Miltenyi  ;130-121-273
CFSE  ;Thermoscientifique  ;Réf. C34554
FITC anti souris CD45.2 (104)BDAB_395041
souris IL2  ;Peprotech  ;Référence 200-02-50UG
souris IL7  ;Peprotech  ;  ; Référence 217-17-10UG
Kit d’isolation Souris T CD4  ;Technologies STEMCELL  ;18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25Constructeur de vecteurs  ;
MSCV-IRES- Poussoir Thy1.1Constructeur de vecteurs  ;
Anticorps PE-CD45 (30-F11)Biolegend  ;103105
PECy7 anti souris TCRb  ; (H57-597)Le tonbo
PercpCy5.5 anti souris CD45.1 (A20)eBiosciences  ;
Platinum-E (Plat-E)  ;Biolabs cellulaires. Inc  ;RV-101
Colorant fluorescent jaune  ;Thermoscientifique  ;

Références

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Mots-clés

Localisation m di e par les GPCRtrafic des lymphocytes Tcytom trie en fluxmicroscopie confocalevirus des cellules souchespositionnement cellulairemigration des cellules immunitaires

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