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Article de méthode

Marquage in vivo d’isotopes stables pour l’identification par spectrométrie de masse des métabolites paternels transférés du spermatozoïde à l’ovocyte pendant la fécondation

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DOI :

10.3791/67765

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17 juin 2025

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1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

Dans cet article

Résumé

Cette procédure vise à identifier les métabolites transférés des spermatozoïdes aux ovocytes lors de la fécondation en utilisant un marquage isotopique stable avec du glucose 2H, 2O ou U13C suivi d’une analyse métabolomique. Les taureaux marqués au deutérium sont accouplés avec des mères non étiquetées. Les embryons préimplantatoires collectés sont analysés par spectrométrie de masse pour trier les métabolites paternels (deutérés) des métabolites maternels (non deutérés).

Résumé

La contribution paternelle à la génétique embryonnaire s’est jusqu’à présent limitée aux séquences alléliques pendant des décennies. Une décennie de résultats suggère, au contraire, que les facteurs épigénétiques - méthylation de l’ADN, modifications des histones, organisation chromosomique et ARN régulateurs - jouent un rôle crucial dans l’hérédité paternelle et influencent le développement embryonnaire et l’expression des gènes zygotes. Avec les acides nucléiques, le métabolome des spermatozoïdes (lipides, glucides, acides aminés libres) peut agir comme un signal épigénétique. Ce protocole vise à identifier les métabolites transférés de spermatozoïdes à ovocytes par spectrométrie de masse. La procédure comprend le marquage isotopique stable des spermatozoïdes avec du glucose 2H2O ou U13C pour tracer, par métabolomique, les métabolites paternels transférés dans l’ovocyte pendant la fécondation. L’objectif général du protocole est de révéler le rôle du métabolome des spermatozoïdes paternels dans la susceptibilité de la progéniture au dysmétabolisme, et il peut être adapté pour fournir des informations sur la façon dont les conditions environnementales, telles que l’alimentation et l’exposition aux polluants, modifient les messages métaboliques paternels, affectant potentiellement la santé de la progéniture et sa prédisposition au diabète, à l’obésité et aux maladies cardiovasculaires.

Introduction

L’épigénome paternel influence la susceptibilité de la progéniture au dysmétabolisme
Contrairement à la pléthore de rôles pré et post-conceptionnels exploités par les mères au cours du développement embryonnaire, on a pensé pendant des décennies que la contribution des spermatozoïdes était exclusivement génétique. Selon la théorie de l’hérédité génétique, la contribution paternelle à la variabilité phénotypique d’un individu (y compris sa susceptibilité à la maladie) devait être attribuée exclusivement à la séquence génétique des variantes alléliques héritées du père et à leurs interactions avec celles héritées de la mère1. De nos jours, il est clair que les allèles ne sont pas les seuls messages génétiques transmis par le père à sa progéniture lors de la fécondation et qu’au contraire, une multitude de signaux épigénétiques contribuent à l’hérédité paternelle 2,3,4. Les signaux épigénétiques identifiés jusqu’à présent comprennent : (1) l’ajout covalent de groupes méthyles aux cytosines du génome parental 5,6,7, (2) les modifications post-traductionnelles (acétylation, méthylation) des histones associées aux chromosomes des spermatozoïdes et délivrées aux ovocytes8, (3) l’organisation 3D des chromosomes paternels conduisant à une interaction intrachromosomique (également connue sous le nom de domaines d’association topologique, TAD) persistant dans le zygote9,10, et (4) les molécules d’ARN régulatrices (miARN, fragments dérivés de l’ARNt et ARN interagissant avec piwi)11,12 ainsi que les ARNr13 et les ARNt14 libérés par les spermatozoïdes dans l’ovocyte pendant la fécondation.

L’épigénome paternel est un important vecteur d’information pour la descendance. L’information paternelle influencera le zygote, l’embryon au cours de son développement et, après la naissance, la propension de la progéniture au dysmétabolisme et aux maladies. Cette hérédité non mendélienne (dite intergénérationnelle ou transgénérationnelle selon qu’elle touche une ou plusieurs générations consécutives) est considérée par de nombreux auteurs comme l’un des facteurs cachés contribuant à l’augmentation drastique des maladies dysmétaboliques survenant dans les pays occidentauxdéveloppés15. En effet, selon les théories PoHaD (Paternal Origin of Health and Disease) et DoHaD (Developmental Origin of Health and Disease), la contribution épigénétique parentale est l’un des facteurs prédisposant la progéniture à développer le diabète, l’obésité et les maladies cardiovasculaires à l’âge adulte16,17. Il est intéressant de noter que l’épigénome parental est exceptionnellement sensible aux stimuli environnementaux et peut être influencé par des conditions métaboliques (telles que la consommation de drogues, les habitudes alimentaires et la forme métabolique)18 ainsi que par des paramètres strictement environnementaux (tels que l’exposition aux polluants, les relations sociales et le stress mental et relationnel)5,11. Chacun des stimuli mentionnés ci-dessus peut ainsi modifier les épigénomes des cellules germinales (spermatozoïdes et ovocytes) et influencer les générations futures.

La consommation d’un régime riche en graisses (HFD) représente l’un des stimuli environnementaux les plus étudiés, capable d’altérer l’épigénome paternel et d’entraîner des messages délétères délivrés à la progéniture19. Ce stimulus affecte le phénotype de la progéniture (jusqu’à la troisième génération), qui présente souvent une plus grande propension à développer un dysmétabolisme, quel que soit son apport calorique. La progéniture du père consommant HFD présente un retard de croissance, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline chez les souris et les rats20,21. Chez l’homme, l’héritage épigénétique a été principalement étudié dans les générations nées pendant et immédiatement après les périodes de famine ou de suralimentation22. Dans la cohorte d’Överkalix, la disponibilité alimentaire des grands-parents paternels pendant leur période de croissance lente était corrélée avec le risque global de mortalité, les maladies cardiovasculaires, l’IMC, le tour de taille et la masse grasse de leurs petits-enfants23. Récemment, des signes de transmission intergénérationnelle paternelle ont été confirmés dans d’autres cohortes24.

Métabolites paternels impliqués dans l’hérédité intergénérationnelle
Malgré les preuves cliniques et épidémiologiques, les détails moléculaires de l’hérédité intergénérationnelle paternelle restent incertains. Dans un premier temps, l’identification de tous les transducteurs moléculaires de l’information épigénétique doit encore être réalisée. Des preuves scientifiques suggèrent que le composant nucléique des spermatozoïdes, à lui seul, ne peut pas expliquer la complexité de l’hérédité intergénérationnelle. Des variations dans la méthylation de l’ADN ont en effet été mesurées dans les spermatozoïdes de souris et de rats nourris avec HFD, mais dans un pourcentage si faible de la population de spermatozoïdes que cela ne peut pas expliquer la forte pénétrance du phénotype dysmétabolique observée chez la progéniture25. D’autre part, le pool d’ARN de signalisation transférés des spermatozoïdes aux ovocytes a une demi-vie très courte et, bien que capable d’influencer l’expression des gènes zygotiques, il semble peu probable qu’il soit maintenu à des concentrations efficaces après la fécondation, dans le zygote chez les embryons des jours 2 et 3, chez les morules et les blastocystes. Ainsi, il semble évident que de nouveaux déterminants moléculaires doivent être impliqués dans le mécanisme d’hérédité intergénérationnel.

En plus des acides nucléiques, les spermatozoïdes contribuent également aux composants métabolomiques du zygote, tels que les lipides, les glucides et les acides aminés 26,27,28,29. Ces métabolites, en particulier ceux dotés d’activités modulatrices, pourraient influencer l’expression des gènes zygotiques et le développement embryonnaire et pourraient donc agir comme des signaux épigénétiques30. De plus, à l’instar des acides nucléiques, la concentration et l’abondance relative de ces métabolites dans les spermatozoïdes peuvent être influencées par les conditions environnementales vécues par le père et représentent ainsi des véhicules d’information pour la progéniture 28,30,31,32,33,34 . En effet, il a été démontré que le métabolome des spermatozoïdes matures dépend de l’état de santé du père et est influencé par des facteurs environnementaux tels que l’alimentation, l’exercice physique, les substances toxiques et les perturbateurs endocriniens.

La compréhension du rôle des métabolites des spermatozoïdes dans le développement embryonnaire est compliquée par plusieurs limitations techniques : (1) la différence de taille entre le spermatozoïde et l’ovocyte, qui se traduit par une contribution minimale de la masse métabolique des spermatozoïdes pour le zygote, et (2) les nombreuses variations métabolomiques que subit le spermatozoïde au cours de ses étapes de production (spermatogenèse), de maturation épididymaire, l’éjaculation et la fusion avec l’ovocyte.

Fluctuation du métabolome des spermatozoïdes au cours de la maturation des spermatozoïdes
Chez les mammifères, les spermatozoïdes sont produits dans les testicules par la spermatogenèse, un processus dépendant des cellules souches spermatogoniales par lequel les spermatogonies engagées se développent en spermatocytes primaires qui entrent en méiose et produisent des spermatides haploïdes ronds. La morphogenèse de ces cellules en spermatozoïdes se produit par spermiogenèse, un remodelage morphofonctionnel massif des spermatides, passant de cellules rondes à des cellules allongées/condensées/hautement spécialisées, correspondant à la dernière phase de la spermatogenèse. Cependant, les spermatozoïdes résultants sont immobiles et pas encore capables de fécondation35. Après la spermiation, lorsque les spermatozoïdes sont libérés du rete testis dans l’épididyme, les spermatozoïdes interagissent avec les cellules épithéliales de l’épididyme et s’engagent avec les protéines et les vésicules exosomiques sécrétées par ces cellules (épididymosomes, riches en sphingomyéline et en acide arachidonique). Le passage à travers l’épididyme permet aux spermatozoïdes d’atteindre leur pleine maturité et, même s’ils sont maintenus dans un état de précapacité, ils acquièrent la compétence pour la motilité36. Au cours du transit épididymaire, la membrane des spermatozoïdes devient plus chargée négativement et enrichie en sphingomyéline. La membrane spermatozoïdale devient également plus fluide en raison d’une réduction progressive du cholestérol et d’une augmentation concomitante des acides gras polyinsaturés (principalement les acides arachidonique, docosapentaénoïque et docosahexaénoïque). Après l’éjaculation, dans l’appareil génital féminin, les protéines du liquide séminal et l’albumine favorisent la capacitation des spermatozoïdes en favorisant l’hyperpolarisation et l’afflux de calcium pour activer la motilité des spermatozoïdes. La membrane plasmique des spermatozoïdes capacités présente une fluidité accrue, un faible rapport cholestérol/phospholipides et une teneur réduite en acide sialique, en ganglioside GM1 et en triglycérides31,37.

Avant de rencontrer l’ovocyte, le spermatozoïde subit la réaction acrosomique, une fusion de l’acrosome (un organite membraneux dérivé de Golgi qui recouvre la partie antérieure du noyau du spermatozoïde et se forme lors de la spermiogenèse) avec la membrane plasmique du spermatozoïde, ce qui facilite la réorganisation de la membrane plasmique des spermatozoïdes et la capacité à pénétrer la zone pellucide (ZP), une matrice de glycoprotéines entourant l’ovocyte35, 38. Planche 38. Comme dernière étape, l’hémifusion entre le spermatozoïde et la membrane ovocytaire, favorisée par les protéines spermatozoïdes IZUMO1, SPACA6 et TMEM9539, entraîne l’incorporation des lipides des spermatozoïdes dans les membranes ovocytaires et le transfert du contenu nucléique et métabolique dans l’ovocyte.

Raison d’être de la procédure
L’objectif de cette procédure est d’identifier les métabolites transportés par le spermatozoïde et transférés dans l’ovocyte lors de la fécondation (Figure 1). Pour distinguer les métabolites dérivés des spermatozoïdes et des ovocytes dans le zygote, les spermatozoïdes sont marqués avec du deutérium (2H, un isotope de l’hydrogène) ou du 13°C (un isotope du carbone) à l’aide d’un marquage métabolique in vivo avec de l’oxyde de deutérium, 2H2O40, ou uniformément marqué U13C Glucose41. Les souris mâles marquées aux isotopes sont ensuite accouplées avec des femelles non marquées pour finalement collecter des zygotes, des morulae et des blastocystes. Les embryons à un stade précoce sont traités pour extraire (1) les métabolites polaires, (2) les métabolites non polaires et (3) les stérols. Les métabolomes sont ensuite analysés à l’aide de techniques de spectrométrie de masse. Les métabolites marqués isotopiquement (paternels) seront identifiés et distingués des métabolites non marqués (maternels), démontrant sans équivoque leur origine paternelle.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Naples Federico II, en Italie. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Sélection et regroupement des mâles C57BL/6J

  1. Sélectionnez des mâles C57BL/6J d’environ 12 semaines.
  2. Divisez les mâles en deux groupes et nommez-les ÉTIQUETÉS (en cours de marquage d’isotopes stables) ou NON ÉTIQUETÉS (utilisés comme contrôle et pour mesurer l’efficacité du marquage isotopique dans les spermatozoïdes et les morules).
  3. Afin de vider l’épididyme des spermatozoïdes non marqués, permettez aux mâles de s’accoupler avec des femelles appariées.

2. Marquage isotopique stable des mâles C57BL/6J

  1. Si vous utilisez du 2H2O pour l’étiquetage in vivo , préparez de l’eau enrichie à 10 % v/v 2H2O pour l’utilisation comme eau potable en mélangeant 100 mL de 2H2O avec 900 mL d’eau du robinet. Si vous utilisez du C-glucose U13pour le marquage in vivo , préparez de l’eau de C-glucose U13à 5 % à 15 % à utiliser comme eau potable en dissolvant 50 à 150 g de C-glucose U13dans 1 L d’eau du robinet ;
    ATTENTION : La consommation prolongée de 2H2O est toxique pour les souris. Réglez pour chaque souche de souris spécifique, la quantité maximale de 2H2O à ajouter dans l’eau potable pour obtenir une efficacité de marquage maximale et des effets secondaires minimaux. La consommation prolongée de glucose provoque une hyperglycémie et un diabète chez la souris. Réglez la quantité maximale d’U-13-C-glucose à ajouter à l’eau potable pour obtenir une efficacité d’étiquetage maximale et des effets secondaires minimaux.
  2. Remplacez les bouteilles d’eau par celles contenant de l’eau de boisson marquée aux isotopes et laissez les souris la boire pendant 2,5 à 5 semaines (couvrant au moins la moitié de la spermatogenèse), en renouvelant le liquide deux fois par semaine.
  3. À la fin de la période de traitement, laissez les mâles marqués s’accoupler avec des femelles superovulées.

3. Superovulation des femelles C57BL/6J

  1. Sélectionnez des femelles d’environ 4 semaines avec un poids compris entre 12,5 et 14 g, en âge prépubère.
  2. Induire la maturation folliculaire par injection intrapéritonéale de 5 UI/50 μL/souris de PMSG (sérum de jument gestante).
  3. Après 47 h, injecter par voie intrapéritonéale de l’hormone lutéinisante HCG (gonadotrophine chorionique humaine, 5 UI/50 μL/souris) pour favoriser l’achèvement de la maturation du follicule et induire l’ovulation et la formation du corps jaune.
  4. Après l’injection d’HCG, laissez les femelles s’accoupler avec des souris MARQUÉES et NON MARQUÉES, conformément à l’étape 1 de la figure 1.
  5. Après l’accouplement, effectuez le contrôle du plug vaginal42. Séparez les femelles positives et mettez-les en cage.

4. Prélèvement d’embryons préimplantatoires par rinçage

  1. Sacrifier les femelles positives au bouchon vaginal en suivant les protocoles approuvés par l’établissement (2,5 jours après le coït pour recueillir les morules).
  2. Placez les animaux en position couchée dorsale sur la table ; Mouillez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % et effectuez une laparotomie large.
  3. Retirez l’utérus d’un côté en pinçant le col de l’utérus et en coupant à l’extrémité caudale du col de l’utérus ; de l’autre côté, en coupant à l’extrémité de la corne utérine (portion infundibulaire).
  4. Placez l’utérus dans la boîte de Pétri avec du PBS pour les rincer, puis transférez-les dans une autre boîte de Pétri propre pour éviter la présence de résidus.
  5. Pour rincer l’utérus, chargez une seringue de 2,5 ml avec le milieu de culture et fixez-la à une aiguille Hamilton à pointe émoussée de 33 g.
  6. Insérez l’aiguille dans l’infundibulum de l’oviducte préparé comme décrit ci-dessus et lavez tout l’utérus.
  7. Récupérez les morulae dans une goutte de milieu de culture pour les laver de toute muqueuse résiduelle et de tout sang.
  8. Transférez les échantillons collectés dans de nouveaux tubes de collecte et regroupez-les en MORULAE ÉTIQUETÉES ET MORULAE NON ÉTIQUETÉES, selon qu’ils proviennent d’événements d’accouplement impliquant des taureaux ÉTIQUETÉS ou NON ÉTIQUETÉS. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide.
  9. Sacrifiez un groupe de femelles superovulées non accouplées (en suivant les protocoles approuvés par l’institution) afin de recueillir des ovocytes non fécondés. Transférez les échantillons collectés dans de nouveaux tubes de collecte et étiquetez-les comme des ovocytes non étiquetés. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide.

5. Collecte de spermatozoïdes de la queue de l’épididyme

  1. Sacrifiez des taureaux LABELLISÉS ou NON ÉTIQUETÉS.
  2. Placez les animaux en position couchée dorsale sur la table, mouillez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % et effectuez une laparotomie large.
  3. Retirez l’épididyme et plongez-le immédiatement dans 3 ml de PBS (pH 7,6) et coupez-le sans serrer pour drainer les spermatozoïdes des canaux.
  4. Filtrez les échantillons de sperme à travers l’étamine.
  5. Centrifuger les spermatozoïdes à 800 x g pendant 10 min (à température ambiante).
  6. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL d’eau froide déminéralisée. Seuls les spermatozoïdes résisteront à la solution hypotonique, tandis que les non-spermatozoïdes éclateront.
  7. Centrifuger les spermatozoïdes à 800 x g pendant 10 min à température ambiante.
  8. Étiquetez les tubes et regroupez-les en SPERMATOZOÏDES MARQUÉS et SPERMATOZOÏDES NON ÉTIQUETÉS, selon qu’ils ont été prélevés sur des taureaux ÉTIQUETÉS ou NON ÉTIQUETÉS.
  9. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.

6. Extraction des lipides et des métabolites polaires

  1. Équilibrez l’échantillon des étapes 1 à 5 à 4°C sur de la glace.
  2. Ajoutez 225 μL de méthanol glacé (MeOH) aux échantillons et incubez à -30 °C pendant 1 min, puis mettez-les dans un bain sonique pendant 10 min.
    1. Facultatif : lors de la définition de la condition expérimentale, ajoutez 0,1 à 2 ppm de chlorhydrate de C16-Céramide-13 C3-15 N et de chlorhydrate de L-Lysine-ε-15N comme étalons internes pour mesurer l’efficacité de l’extraction des métabolites non polaires et polaires, respectivement.
  3. Ajouter 750 μL d’éther méthyltert-butylique (MTBE) glacé dans un thermomélangeur pendant 1 h à 4 °C (550 tr/min).
  4. Ajouter 188 μL de H2O aux échantillons après les avoir centrifugés. Séparez les phases supérieures (lipides) de la phase inférieure (métabolites polaires) et séchez-les.
    ATTENTION : MeOH provoque la cécité et des dommages au foie, aux reins et au cœur en cas d’ingestion. La surexposition a un effet cumulatif sur le système nerveux central. Le MTBE peut provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Travaillez sous une hotte.
  5. Séchez l’échantillon à l’aide d’un concentrateur sous vide. Conserver les échantillons séchés à -80 °C jusqu’à l’analyse de masse/spectrométrie.
    REMARQUE : Les échantillons séchés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à 6 mois, en attendant l’analyse de masse/spectrométrie. Pour l’identification des métabolites moins représentés dans les embryons préimplantatoires, il peut être nécessaire de regrouper des échantillons obtenus à partir du même couple d’accouplement et du même événement d’accouplement.

7. Extraction des stérols

REMARQUE : Évitez d’utiliser des tubes et des embouts en plastique [ils seront dissous par le solvant organique non polaire] ; utilisez plutôt des tubes en verre et des pipettes Pasteur en verre pour distribuer des liquides.

  1. Équilibrez l’échantillon des étapes 1 à 5 à 4 °C sur de la glace. Remettre en suspension les échantillons prélevés dans 500 μL d’une solution de Méthanol/H20 70 % v/v et transférer la suspension dans un tube de verre.
    1. Homogénéiser par vortex pendant 30 s. Laisser l’homogénat pendant 16 h à 4 °C.
    2. Facultatif : lors de la définition des conditions expérimentales, ajoutez 0,1 à 2 ppm du stérol végétal Sitostanol-5,6,22,23-d4 comme étalons internes pour mesurer l’efficacité de l’extraction des stérols.
      ATTENTION : MeOH provoque la cécité et des dommages au foie, aux reins et au cœur en cas d’ingestion. La surexposition a un effet cumulatif sur le système nerveux central.
  2. Centrifuger l’échantillon à 3,220 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférez le surnageant dans un tube en verre propre et complétez-le avec 500 μL de PBS.
  3. Ajouter 7 mL d’éther diéthylique glacé et agiter pendant 1 min. Laissez reposer l’échantillon pendant 1 à 2 minutes et attendez la séparation des phases. Congelez en immergeant le tube dans un bain de glace sèche ou d’acétone. Transférez la phase d’éther diéthylique non congelée dans un tube de verre nouvellement étiqueté.
    ATTENTION : L’éther diéthylique est un liquide et une vapeur extrêmement inflammables et se décompose en peroxydes explosifs dans l’air et la lumière. Ne travaillez pas en contact étroit avec les flammes. L’éther diéthylique est dangereux en cas d’ingestion et nocif pour la peau.
  4. Dégivrez la phase aqueuse à 37 °C et répétez l’étape 4.3. Combinez les phases d’éther diéthylique recueillies aux étapes 4.3-4.4 dans un seul tube de verre.
  5. Séchez l’échantillon à l’aide d’un concentrateur sous vide. Conserver les échantillons séchés à -80° C jusqu’à l’analyse de masse/spectrométrie.

8. Dérivation de l’échantillon

REMARQUE : Les échantillons bénéficieraient de la dérivation de la TMS pour l’analyse de métabolites spécifiques (cholestérol, acides gras, acides aminés).

  1. Équilibrer les échantillons à température ambiante
    ATTENTION : Un équilibrage incomplet peut provoquer la condensation de l’eau atmosphérique sur les parois des tubes et les échantillons. L’eau est en concurrence féroce pour la dérivation du TMS.
  2. Solubiliser les échantillons dans 50 μL de pyridine et les dérivatiser en ajoutant 25 μL de N,O-Bis(triméthylsilyl(TMS)trifluoroacétamide (BSTFA). Incuber les échantillons pendant 90 min à 60 °C. Faites tourner les échantillons et procédez immédiatement à l’analyse GC-MS.
    ATTENTION : La pyridine est inflammable, irritante et toxique. Le BSTFA est inflammable, corrosif et irritant. Passez sous une hotte et utilisez des gants de protection.

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Résultats

Afin de surveiller le transfert de métabolites du spermatozoïde à l’ovocyte, des morulae isolées de femelles C57 BL/6J accouplées avec des taureaux de groupes LABELLISÉS et NON MARQUÉS sont collectées et analysées par métabolomique basée sur la spectrométrie de masse. Les métabolites ont été extraits comme décrit aux étapes 6 et 7 et dérivatisés avec la TMS comme décrit à l’étape 8. Le profilage métabolomique et lipidomique des morules MARQUÉES, des morules NON MARQUÉES, des ovocytes NON MARQUÉS, des MARQUÉS et des sperm...

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Discussion

Le protocole décrit permet l’identification des métabolites transférés des spermatozoïdes aux ovocytes lors de la fécondation par marquage isotopique stable de souris mâles avec du glucose 2H, 2O ou U,13°C, suivi d’une analyse métabolomique. Les métabolites marqués isotopiquement trouvés dans les morulae sont d’origine paternelle.

Bien que l’hydrogène et le deutérium soient des isotopes, ils ne sont pas tout à fait identiques e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2H2O filtré, 99,8 atomes % 2HSigma Aldrich756822
AcétoneSigma Aldrich179124
Agilent  ; SIL-8Agilent (Santa Clara, Californie, États-Unis)
C16-Céramide-13C3-15NNorme LGCTRC-C342770-25MG
dichlorométhaneSigma Aldrich34856
Éther diéthylique  ;Sigma Aldrich673811
éthanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (gonadotrophine chorionique humaine,Sigma AldrichCG5-1VL
Chlorhydrate de L-Lysine-&epsilon ;-15NSigma Aldrich608971
Mâle et femelle  ; Souris C57BL/6JOlaHsdInotiv  ;C57BL/6JOlaHsd
éther méthyltert-butylique (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-Bis(triméthylsilyl(TMS)
trifluoroacétamide (BSTFA)		Supelco15238
PBSApplichemA0965-9010
PMSG (Jument gestante) s)Lee Biosolutions493-10
PyridineSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus  ;Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
trifluoracétate de sodiumSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T  ;Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF ;Bruker Daltonics
Glucose U13C  ;Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC  ;Thermo Fisher Scientific
Précolonne VanGuard CSHTM (5,0 & times ; 2,1 mm ; 1,7 &mu ; m, 130 Å ;)Eaux

Références

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

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