L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Résumé

Ici, nous proposons une approche fiable pour isoler les neutrophiles de densité faible et normale du sang total en utilisant l’isolement magnétique (sélection négative) et le milieu à gradient de densité discontinu. Il garantit l’isolement intact des cellules de haute pureté (≥93 %), facilitant ainsi l’analyse précise en aval des sous-populations de neutrophiles, ce qui est crucial pour comprendre leurs rôles dans la santé et la maladie.

Résumé

De nouvelles recherches montrent que la population de neutrophiles en circulation chez l’homme se compose de divers sous-types et ne devrait pas être étudiée comme une seule population, comme cela a été fait par le passé. En particulier, il a été démontré que les neutrophiles de faible densité et de densité normale (LDN, NDN) ont des profils fonctionnellement et métaboliquement distincts, un facteur qui doit être pris en compte lors de la publication de recherches sur les neutrophiles. Ici, nous présentons une méthode modifiée pour l’isolement et la séparation intacts des LDN et des NDN du sang total.

Le milieu de gradient de densité (1,135 g/mL) est combiné à 9:10 avec 10x PBS. Des gradients de densité spécifiques de 55 %, 70 % et 81 % sont ensuite obtenus en combinant le milieu à gradient de densité de 100 % avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x. Les neutrophiles isolés à partir de 12 mL de sang total périphérique obtenu de donneurs consentants à l’aide d’un kit d’isolement magnétique basé sur la sélection négative sont remis en suspension dans la fraction à 55 %. Un volume de 3 mL des fractions à 81 % et à 70 % est superposé dans un tube de 15 mL, suivi de la fraction à 55 % contenant des neutrophiles totaux. Les gradients de densité sont ensuite centrifugés à 720 x g pendant 30 min. Deux bandes distinctes sont obtenues au niveau de l’interface 55 %/70 % (LDN) et de l’interface 70 %/81 % (NDN). Les cellules sont soigneusement pipetées dans des tubes séparés et lavées à l’aide de PBS. La pureté des fractions isolées est déterminée par cytométrie en flux. Les LDN et les NDN ont été définis comme CD14lo CD15+ SSChi par cytométrie en flux. La pureté d’isolement a été calculée à ≥93 % des cellules viables pour les deux types.

Cette méthode fournit une approche fiable et efficace pour séparer les LDN et les NDN du sang périphérique, garantissant ainsi une pureté et une viabilité élevées des cellules isolées. L’amélioration de la précision de l’isolement des neutrophiles facilite des analyses en aval plus précises de ces sous-populations distinctes de neutrophiles. Ceux-ci sont essentiels pour faire progresser notre compréhension de l’hétérogénéité des neutrophiles et de ses implications dans divers contextes physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les neutrophiles sont des cellules immunitaires granulaires et les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique, constituant environ 50 à 70 % des leucocytes en moyenne. Ils se développent dans la moelle osseuse à partir de précurseurs de granulocytes-monocytes (GMP), qui à leur tour se développent à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) en présence de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF). À l’homéostasie, ils ont une durée de vie de ~24 h, mais des études ont montré que leur durée de vie peut être prolongée dans des conditions physiologiques spécifiques et leurs microenvironnements ....

Protocole

Des échantillons de sang ont été prélevés avec le consentement éclairé de participants en bonne santé. L’étude a reçu l’approbation du comité d’éthique de la recherche de l’hôpital St. James et de l’hôpital universitaire de Tallaght.

1. Préparation d’un milieu à gradient de densité, de fractions de solutions de travail isotoniques et d’un tampon de séparation cellulaire

1. Préparation de solutions de travail isotoniques à partir d’un milieu à gradient de densité
   1. Préparation de la solution de travail isotonique à 100 % (~1,123 g/mL)
      1. Pour préparer la solution iso....

Résultats

La superposition réussie des neutrophiles totaux sur le milieu de gradient de densité peut être observée à la figure 1B. Deux bandes distinctes doivent être obtenues. Si le mélange des gradients se produit, ou si le nombre total de neutrophiles stratifiés par tube est élevé (supérieur à environ 5-6 × 10⁶), les bandes auront l’air diffuses (figure 1C) et le risque de mélange des deux sous-types de neutrophiles augmente considérablement. Pour éviter ce .......

Discussion

Ici, nous présentons une méthode optimisée de division de la population totale de neutrophiles en neutrophiles de faible densité et de densité normale, ainsi qu’une caractérisation phénotypique de chaque type de cellule à l’aide de la cytométrie en flux adaptée des méthodes précédentes⁵.

Ce protocole est basé sur l’isolement des LDN et des NDN dans le sang total. Une étape cruciale est que les neutrophiles totaux sont isolés par des mét.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polypropylène de 14 ml (17 x 100 mm)	Corning Science 352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
Tampon EasySep (tampon de séparation cellulaire)	StemCell Technologies	#20144
Kit d’isolement direct des neutrophiles humains	EasySep StemCell Technologies	#19666
Réactif bloquant FcR, humain	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-humain CD16 (3G8)	BioLegend	302005
Rémunération OneComp eBeads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate  ;	Gibco	18912-014
Zombie NIR Kit de viabilité fixable	BioLegend	423105