Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Résumé

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre Teen-reporter.

Résumé

Les RASopathies sont des syndromes génétiques causés par l’hyperactivation d’ERK et entraînant des maladies multisystémiques qui peuvent également entraîner une prédisposition au cancer. Malgré une large hétérogénéité génétique, des mutations germinales de gain de fonction dans les principaux régulateurs de la voie RAS-MAPK sont à l’origine de la majorité des cas et, grâce à des techniques de séquençage avancées, des variants potentiellement pathogènes affectant la voie RAS-MAPK continuent d’être identifiés. La validation fonctionnelle de la pathogénicité de ces variants, essentielle pour un diagnostic précis, nécessite des protocoles rapides et fiables, de préférence in vivo. Compte tenu de la rareté des traitements efficaces dans la petite enfance, de tels protocoles, surtout s’ils sont mis à l’échelle dans des modèles animaux rentables, peuvent contribuer à offrir un terrain préclinique pour le repositionnement/réaffectation des médicaments.

Nous décrivons ici étape par étape le protocole pour la génération rapide de modèles RASopathy transitoires dans les embryons de poisson-zèbre et l’inspection directe des changements d’activité ERK associés à des maladies vivantes qui se produisent déjà pendant la gastrulation grâce à l’imagerie multispectrale de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) en temps réel. Le protocole utilise un rapporteur ERK transgénique récemment établi et intégré au matériel des microscopes commerciaux. Nous fournissons un exemple d’application pour les modèles de poisson-zèbre du syndrome de Noonan (NS) obtenus par expression de Shp2^D61G. Nous décrivons une méthode simple qui permet d’enregistrer le changement du signal ERK dans le modèle de poisson NS avant et après la modulation du signal pharmacologique par les inhibiteurs de MEK à faible dose disponibles. Nous détaillons comment générer, récupérer et évaluer les signaux FRET ratiométriques à partir d’acquisitions multispectrales avant et après le traitement et comment valider les résultats via l’immunofluorescence classique sur des embryons entiers à des stades précoces. Nous décrivons ensuite comment, en examinant les paramètres morphométriques standard, il faut interroger les changements tardifs de la forme de l’embryon, indiquant une altération de la gastrulation résultante, chez les mêmes embryons dont l’activité ERK est évaluée par FRET en direct 6 h après la fécondation.

Introduction

Les RASopathies sont des syndromes génétiques qui altèrent le développement normal et affectent divers organes et tissus. Ces conditions sont souvent causées par des mutations germinales de gain de fonction (GoF) dans les gènes clés et les acteurs impliqués dans la signalisation RAS/MAK, entraînant une hyperactivation (augmentation de la phosphorylation) de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK). ERK régule certains processus fondamentaux importants lors du développement - la croissance tissulaire - en se déplaçant vers le noyau ^1,2. Les mutations somatiques dans les gènes impliqués dans la voie RAS-MAPK sont les événements les plus courants conduisant au cancer³. Ainsi, sans surprise, une prédisposition au cancer est également observée dans les RASopathies. Le syndrome de Noonan (SN), caractérisé par un retard de développement, une petite taille, des déficits cognitifs de gravité variable et une cardiomyopathie, est la forme la plus courante de RASopathy². Dans la plupart des cas, la maladie est causée par des mutations GoF dans PTPN11, le premier gène RASopathy découvert au début des années 2000⁴ codant pour la protéine tyrosine phosphatase SHP2, qui agit comme un régulateur positif de la voie.

Depuis, grâce à l’utilisation exponentielle des approches de séquençage de l’exome chez les patients non diagnostiqués, des variants potentiellement pathogènes affectant les facteurs impliqués dans le RAS-MAPK, et probablement liés à diverses formes de RASopathies, continuent d’être découverts et attendent une caractérisation fonctionnelle pour une stratification efficace des patients². Pour atteindre cet objectif, des protocoles expérimentaux garantissant une validation fonctionnelle rapide et informative au niveau de l’organisme sont nécessaires. L’utilisation de modèles de mammifères classiques et standardisés pour tester des variantes dont la signification est inconnue serait coûteuse, prendrait beaucoup de temps et nécessiterait des méthodes invasives chez de grands animaux non transparents. Une telle stratégie n’est manifestement pas compatible avec l’exigence d’un dépistage rapide, compte tenu du fardeau sociétal que représentent les patients atteints de RASopathie pauvres ou non diagnostiqués, actuellement sans prise en charge ni traitement. Des protocoles d’évaluation quantitative des traits phénotypiques clés et des corrélats moléculaires dans des organismes entiers serviraient également à accélérer l’application clinique possible de médicaments potentiellement disponibles pour les patients atteints de RASopathie en réorientant/repositionnant.

Le poisson-zèbre est un modèle de vertébré idéal pour étudier les maladies qui affectent le développement précoce. Pour commencer, le poisson-zèbre partage un haut niveau d’homologie génétique avec les humains. La fécondité élevée des poissons adultes se traduit par une grande production d’embryons qui sont petits et se développent rapidement. Les embryons sont transparents aux premiers stades, de sorte que les principaux processus de développement - épibolie, gastrulation, axes et formation du plan corporel - peuvent être visualisés sans effort à l’aide de la microscopie standard. De plus, la disponibilité de lignées transgéniques qui peuvent être utilisées pour suivre le comportement cellulaire spécifique et les événements moléculaires dynamiques dans l’espace et le temps au cours du développement, en conjonction avec des techniques avancées pour générer des modèles génétiques, est imbattable. De plus, les lectures phénotypiques peuvent être évaluées à plusieurs niveaux chez le poisson-zèbre (des défauts de l’organisme aux défauts cellulaires), et des tests dédiés sont déjà établis pour plusieurs maladies, y compris les RASopathies⁵. De plus, des méthodes relativement simples d’immersion dans le bain pour l’administration de médicaments au cours des premiers stades, au moins pour les composés solubles dans l’eau, permettent un criblage de médicaments à haut débit in vivo dans un format à 96 puits.

D’un point de vue moléculaire, les études utilisant des approches standard, telles que l’immunohistochimie et l’immunoblot, démontrent de manière robuste la corrélation entre l’activation d’ERK et les anomalies développementales associées à la RASopathie chez les embryons de poissons ^6,7. Le biocapteur FRET de type EKAR récemment développé chez le poisson zèbre (Tg[ef1a :ERK biosensor-nes], Teen) fournit un outil in vivo fiable pour enregistrer l’activation d’ERK pendant l’embryogenèse de manière spatio-temporelle. Par conséquent, il pourrait être utile pour une meilleure évaluation des altérations dynamiques de ERK et des modulations pharmacologiques dans les modèles de poissons RASopath.

Dans le capteur Teen , un substrat ERK spécifique dans le rapporteur est phosphorylé lors de l’activation d’ERK, déclenchant un changement de conformation qui rapproche le donneur fluorescent CFP (D) et l’accepteur fluorescent Ypet (YFP amélioré) (A). Si le spectre d’émission D chevauche considérablement le spectre d’absorption de A, il peut se produire des FRET (absorption d’énergie de D à A). Celle-ci est proportionnelle à la distance entre D et A et, donc, en Teen, à l’état d’activation de l’ERK. Différents protocoles d’imagerie peuvent être mis en place à l’aide de modules d’imagerie standard et avancés de microscopes standard ou confocaux dans des échantillons vivants et fixes. Lors de l’excitation D, l’acquisition de balayages multispectraux le long d’un spectre défini d’émission (λ) de CFP à YFP suivi d’algorithmes de « démixage » spectral est l’une des méthodes les plus fiables pour enregistrer et quantifier les données FRET⁸. Il peut également être appliqué à des spécimens de poissons-zèbres vivants pour enregistrer in vivo la dynamique des tissus.

Suite aux rapports précédents ^6,9 et à notre récente application⁷, nous détaillons ici le flux de travail étape par étape à l’aide de poissons adolescents pour évaluer l’activation de ERK dans les cellules à la marge du pôle animal des modèles NS au début de la gastrulation et la corréler avec des défauts caractéristiques des axes corporels visibles seulement plus tard dans le développement. Nous montrons comment obtenir et examiner des données quantitatives FRET à partir de gastrulae NS vivantes avant et après le traitement avec un MEKi disponible et comment valider les résultats via l’immunohistochimie standard contre ERK phosphorylé (actif) ou effectuer une analyse morphométrique corrélative des défauts d’élongation embryonnaire.

Le flux de travail pourrait être appliqué pour stimuler le test fonctionnel des variantes émergentes et des gènes de maladie supposément associés aux RASopathies et pour obtenir des informations sur la corrélation de la dynamique d’activation d’ERK spatialement et temporellement pendant le développement des vertébrés et les défauts morphologiques chez les embryons. Nous montrons que ce protocole peut également être utilisé pour tester l’efficacité de médicaments candidats agissant pour moduler l’activation d’ERK.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant l’hébergement et la reproduction des animaux ont été menées conformément aux directives ARRIVE pour l’utilisation du poisson-zèbre dans la recherche animale et autorisées par le ministère italien de la Santé (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Toutes les réactions ADN/ARN et les séances d’imagerie peuvent être augmentées ou réduites à volonté, en fonction du matériel final requis ou du nombre de gènes et de variantes testés.

1. Génération et traitement médicamenteux de modèles RASopathies de poisson-zèbre transitoire

REMARQUE : Pour surveiller l’expression des variants associés à la RASopathy, des constructions spécifiques hébergeant la séquence codante souhaitée (cds) de la protéine d’intérêt dans le cadre avec les cd de petites étiquettes non fluorescentes (telles que myc ou similaires) peuvent être utilisées. De cette façon, les niveaux d’expression de la protéine mutante peuvent être évalués par western blot standard contre l’étiquette. Si des anticorps contre la protéine d’intérêt spécifique sont disponibles, les marqueurs peuvent être évités. L’immunofluorescence peut également être utilisée pour évaluer l’expression des protéines dans le tissu embryonnaire en suivant les protocoles standard. Ce type d’expérience de contrôle peut être utile pour corréler l’expression des protéines mutantes avec les niveaux d’activation induits par ERK. L’utilisation de marqueurs fluorescents n’est pas recommandée en combinaison avec l’imagerie FRET, étant donné les interactions croisées possibles en émission de fluorescence pendant la microscopie.

1. Linéarisation plasmidique (jours 1-2) (Figure 1A)
   REMARQUE : Lors de la génération d’un modèle de maladie transitoire chez le poisson-zèbre (RAsopathie ici) causée par une mutation GoF affectant un gène spécifique, une approche rapide consiste à préparer l’ARNm codant pour le type sauvage (WT) et la protéine mutante d’intérêt, qui doit ensuite être injecté dans les embryons de poisson-zèbre en suivant les étapes ci-dessous. Le plasmide utilisé comme matrice pour transcrire l’ARNm doit contenir la CDS (séquence codante) complète souhaitée pour le gène d’intérêt cloné en aval d’un promoteur de polymérase T7, Sp6 ou T3 et en amont de la polyadénylation (polyA). S’il n’est pas disponible, la première étape consiste à le produire en clonant le poisson zèbre ou le CDS souhaité par l’homme dans un vecteur¹⁰ approprié et à le valider par séquençage SANGER. Pour le clonage, prévoyez du temps supplémentaire (en moyenne 1 semaine, y compris le clonage, le criblage des colonies et l’isolement et l’expansion des bons clones).
   1. Linéariser le plasmide avec des enzymes de restriction appropriées, en coupant une seule fois en aval le signal polyA (ici KpnI). Pour obtenir une linéarisation efficace des plasmides, mélangez 3 γ (μg/μL) d’ADN plasmidique, 2 μL d’enzyme de restriction (20 000 unités/mL) et 10 μL de tampon réactionnel 10x dans un volume final de 100 μL dans de l’eau sans nucléases. Mélangez soigneusement les composants en pipetant plusieurs fois et incubez le mélange réactionnel à 37 °C pendant 2 à 4 h.
   2. Vérifiez le résultat de la linéarisation par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5 %.
      1. Diluer 10 fois la solution mère de TBE (48,5 g de Tris, 11,4 mL d’acide acétique glacial, 20 mL de 0,5 M EDTA [pH 8,0]) avec de l’eau exempte de nucléases.
      2. Préparez le gel d’agarose en dissolvant au micro-ondes 1,5 g d’agarose dans un volume final de 100 ml de 1 x solution d’encéphale nitrable. Ensuite, ajoutez 3,5 μL de colorant gel.
      3. Coulez le gel en versant la solution d’agarose dans des chambres de taille appropriée, en fonction du nombre de conditions/plasmides. Réglez les rayons et attendez environ 1 h jusqu’à ce que le gel soit solidifié ; Ensuite, retirez les peignes et positionnez le gel polymérisé dans le plateau de gel approprié pour l’électrophorèse.
      4. Mélangez quelques μL du plasmide digéré (« coupé ») et 1,5 μL de tampon de charge 6x (contenant un colorant pour surveiller l’électrophorèse) dans un volume final de 10 μL d’eau sans nucléases. Préparer de la même manière un échantillon de contrôle séparé avec le plasmide non digéré (« non coupé »). Chargez les échantillons dans les voies d’agarose, et dans la première voie, chargez une échelle d’ADN de 1 Kb. Effectuez l’électrophorèse de l’ADN à 100 V pendant 30 min.
      5. Visualisez et documentez les bandes d’ADN résultant de l’exécution sur un transilluminateur UV standard. Vérifiez l’efficacité de la linéarisation plasmidique en inspectant le motif des bandes d’ADN en comparant « coupé » et « non coupé ».
         REMARQUE : Les plasmides suffisamment linéarisés doivent fonctionner plus rapidement sous la forme d’une bande pointue. Assurez-vous que le clivage de l’ADN est complet, car l’initiation de la réaction de transcription est une étape limitante clé qui peut être entravée par la présence de formes plasmidiques circularisées, ce qui entraîne un faible rendement en ARNm.
   3. Procédez à la purification du plasmide linéarisé à l’aide de kits de purification d’ADN basés sur des colonnes de centrifugation disponibles dans le commerce et stockez la préparation d’ADN purifié à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
      REMARQUE : Au lieu de la linéarisation, il est possible d’utiliser un produit PCR comme matrice pour la transcription de l’ARNm, à condition qu’il inclue la séquence promotrice de la polymérase en amont et la séquence du signal polyA en aval du codon stop. Les produits PCR doivent également être purifiés et inspectés sur un gel d’agarose avant de procéder.
2. In vitro Transcription, purification et contrôle de la qualité de l’ARNm (jours 2 et 3) (Graphique 1A)
   REMARQUE : nettoyez soigneusement la zone de travail et les pipettes avec des solutions de décontamination à base d’ARNase. Utiliser des matériaux et des réactifs sans nucléases ; Portez des gants. Cela minimisera la contamination par la RNase et permettra un meilleur rendement de l’ARNm complet.
   Transcrivez des ARNm codés et polyadénylés codant pour des protéines WT et mutantes à partir de plasmides linéarisés à l’aide de kits standard pour la transcription in vitro d’ARNm et en suivant les instructions du fabricant.
   1. Centrifugez le plasmide linéarisé purifié pendant quelques secondes à 17 949 × g pour vous assurer que les débris sont collectés au fond du tube et ne sont pas transférés dans la réaction de transcription.
   2. Décongeler tous les composants à température ambiante (RT), à l’exception du mélange d’analogues NTP et CAP, qui sont conservés sur de la glace. Maintenez la polymérase à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
   3. Centrifugez brièvement tous les réactifs à 17 949 × g avant utilisation pour éviter la perte de réactif ou la contamination accidentelle, et agitez brièvement le tampon de réaction 10x et le mélange analogique NTP/CAP prêt à l’emploi jusqu’à ce qu’ils soient complètement en solution. Conservez le tampon de réaction 10x à RT.
   4. Préparez la réaction de transcription à RT en ajoutant 600 à 800 ng du plasmide linéarisé et purifié à une solution contenant 10 μL de 2x mélange analogique NTP/CAP, 2 μL de 10x tampon réactionnel, 2 μL d’enzyme SP6, T7 ou T3 (selon le promoteur spécifique en amont du CDS dans le plasmide) dans un volume final de 20 μL composé d’eau sans nucléases. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
   5. Incuber la réaction de transcription à 37 °C dans un thermocycleur. Assurez-vous également de régler la température du couvercle sur 37 °C et de faire fonctionner la réaction pendant 2 h.
   6. Pour éliminer le plasmide résiduel qui n’a pas été transcrit pendant la réaction, ajoutez 1 μL de solution standard d’ADN (2 unités/μL). Mélangez soigneusement la réaction en pipetant plusieurs fois et incubez à 37 °C pendant 30 minutes supplémentaires.
   7. Avant de continuer, vérifiez la qualité et l’intégrité de l’ARNm synthétisé in vitro par électrophorèse de l’agarose TBE/formamide. Dissoudre 1,0 g d’agarose dans 50 ml de 1 solution de TBE, ajouter 5,5 ml de formamide à 37 % et 3,5 μL de colorant gel, mélanger et couler le gel comme expliqué ci-dessus.
      ATTENTION : Lors de la manipulation du formamide, portez un équipement de protection individuelle (EPI) et utilisez une cagoule chimique.
   8. Mélangez 1 μL de l’ARNm transcrit avec 2,5 μL de 2x tampon de charge de colorant formamide dans de l’eau sans nucléase dans un volume total de 5 μL. Mélangez soigneusement les composants en pipetant plusieurs fois et chargez les échantillons dans les voies de gel. Faites fonctionner le gel à 100 mV pendant 10 à 15 minutes dans un tampon 1x TBE pré-réfrigéré. Exécutez également une échelle d’ADN et/ou d’ARN de 1 kb.
   9. Facultatif : Dénaturer l’échelle et l’ARNm à 70 °C pendant 10 min.
   10. Visualisez et documentez les bandes d’ARNm résultantes sur un transilluminateur UV standard.
       REMARQUE : Les longues périodes de course et les températures élevées augmentent la probabilité de dégradation de l’ARN.
   11. Si l’intégrité et la taille de l’ARN coiffé synthétisé sont optimales, procéder à la polyadénylation du C-terminal en ajoutant à la réaction : 36 μL d’eau exempte de nucléases, 20 μL de tampon de charge dénaturant 5x, 10 μL de 25 mM de MnCl₂, 10 μL de 10 mM d’ATP et 4 μL d’enzyme de polyadénylation (comme la poly(A) polymérase d’E. coli purifiée). Mélangez soigneusement la réaction en pipetant plusieurs fois et incubez les 100 μL de la réaction finale à 37 °C pendant 1 h supplémentaire.
       REMARQUE : Il n’est pas conseillé de vérifier la qualité de l’ARN par électrophorèse sur gel après la réaction polyA, car l’ARN apparaîtra taché en raison des queues polyA.
   12. Précipiter et récupérer l’ARNm synthétisé et polyadénylé à l’aide de sels appropriés tels que LiCl. Mélanger brièvement des volumes égaux d’eau exempte de nucléases et une solution standard de LiCl de 2,5 M (30 μL) et incuber pendant >30 min à -20 °C.
       REMARQUE : Une précipitation efficace peut être obtenue après 2 h, mais l’incubation pendant la nuit augmente généralement le rendement final d’ARNm.
   13. Pour granuler l’ARNm purifié, centrifuger la réaction pendant 30 min à 4 °C à 17 949 × g et retirer le surnageant. Maintenant, lavez la pastille avec ~1 mL d’éthanol à 70 % (EtOH) et centrifugez-la pendant 15 min à 4 °C à 17 949 × g pour éliminer les contaminants et les nucléotides résiduels de la réaction.
   14. Faites sécher la pastille à l’air libre, puis mettez-la en suspension dans 20 μL d’eau sans nucléase. Dissoudre bien l’ARN en pipetant doucement et à plusieurs reprises à RT et incuber à 10 min.
       REMARQUE : Vérifiez le granulé toutes les 5 minutes pour assurer l’évaporation de l’EtOH. Lors de la remise en suspension, compte tenu de l’adhérence de l’ARN, pipetez-le jusqu’à ce qu’il soit correctement dissous dans l’eau.
   15. Évaluer la concentration et la pureté de l’ARNm préparé en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nm (rapport 260/280) dans un spectrophotomètre. Mesurez différentes dilutions scalaires de la préparation de l’ARN pour assurer une estimation correcte de la concentration.
       REMARQUE : Normalement, la concentration de l’ARN synthétisé varie de 1 à 2 μg/mL, mais la quantité finale peut différer en fonction de la longueur du CDS et de la quantité de matière première.
   16. Pendant l’évaluation de la qualité, conservez le stock d’ARNm dans de la glace, puis aliquotez-le en aliquotes de 5 μL et stockez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de l’injecter.
3. Préparation de solutions et de matériaux étalons pour l’injection d’embryons et le traitement médicamenteux (jours 2-3, figure 1B)
   1. Tirez les aiguilles de micro-injection pour les embryons de poisson-zèbre à l’aide de capillaires stériles (dimensions capillaires standard : 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm). Utilisez un appareil d’extraction disponible dans le commerce et appliquez les réglages souhaités, en termes de tension de sortie, de mode de traction (un pas ou deux pas) et de force de traction pour obtenir une longueur, un diamètre et une forme d’aiguille variables. Pour les caractéristiques d’aiguille couramment utilisées pour le poisson-zèbre, reportez-vous à Abdelrahman et ses collègues¹¹.
      REMARQUE : Les paramètres optimaux peuvent varier d’un laboratoire à l’autre, car les conditions environnementales (telles que l’humidité ou la température ambiante) peuvent influencer les résultats de l’extraction de l’aiguille. Les paramètres doivent être régulièrement testés et calibrés. Les aiguilles tirées peuvent être stockées chez RT dans des récipients propres pendant plusieurs mois.
   2. Préparez la solution mère 30x « Danieau » à pH 7,6 en dissolvant 101,7 g de NaCl, 1,56 g de KCl, 2,96 g de MgSO₄ x 7H₂O, 4,25 g de Ca(NO₃)₂ et 35,75 g de HEPES dans 1 L d’eau bidistillée (DD) pour la préparation de la solution de microinjection. Préparez également une solution mère de rouge de phénol à 5 % dans de l’eau DD pour l’utiliser comme traceur visible du mélange d’injection.
   3. Préparez une solution de milieu E3 pour la croissance embryonnaire en diluant 4 mL de NaCl (5 M), 680 μL de KCl (1 M), 1,32 mL de CaCl₂ x 2H₂O (1 M) et 1,32 mL de MgSO₄ (1 M) dans un volume final de 4 L d’eau d’osmose inverse.
   4. Préparez des solutions mères des médicaments souhaités (dans cet exemple : l’inhibiteur de MEK [MEKi] PD032590) sous forme de solutions mères conformément à la fiche technique du produit et à sa solubilité (10 mM du MEKi de votre choix en dissolvant 5 mg dans 1,036 mL de DMSO). Bien mélanger et générer de petites aliquotes à conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Le DMSO est un solvant couramment utilisé pour dissoudre les composés polaires et non polaires et montre une solubilité dans une large gamme de solvants organiques ainsi que dans l’eau.
   5. Préparez une suspension d’artémias vivants en laissant éclore les kystes d’Artemia salina dans une solution d’éclosion (2 g/L de kystes d’Artemia salina dans 30 g/L de sel de mer préalablement dissous dans de l’eau d’osmose inverse) à 28-30 °C pendant au moins 18 h, en assurant une aération constante.
      REMARQUE : Les conditions d’élevage et le temps d’éclosion peuvent être influencés par les conditions environnementales de l’installation et les lots de kystes, et doivent être testés de nouveau régulièrement et remis en place si nécessaire.
4. Préparation des couples reproducteurs pour les poissons Tg[ef1α :ERK biosensor-nes] (Adolescent) (Jour 3)
   1. Le jour de l’accouplement, nourrissez régulièrement les couples adultes selon le protocole approuvé de l’installation animale.
      1. Nettoyez l’élevage contenant des artémias éclos en filtrant les kystes non éclos ou vides à l’aide de deux passoires de tailles de filtre différentes (niveau de filtre I : 180 μm, niveau de filtre II : 112 μm).
      2. Recueillir et laver les artémias filtrés dans 200 mL d’eau d’osmose inverse pour nourrir 10 à 15 poissons adultes avec environ 5 à 10 mL de solution d’artémias.
         REMARQUE : Vérifiez la qualité de la solution d’artémias éclos en regardant leur vitalité, leur motilité, leur taille et leur couleur et assurez-vous d’éliminer les kystes non éclos ou vides, qui sont indigestes pour les poissons et peuvent nuire au tractus gastro-intestinal des poissons. Pour les couples reproducteurs, il est préférable de prévoir le dernier repas de la journée au moins 3 h avant d’isoler les couples dans le bassin d’élevage pour permettre la digestion des aliments et maintenir des niveaux élevés de qualité de l’eau.
   2. Sélectionnez des couples de poissons qui n’ont pas été accouplés pour l’accouplement au cours des 2 semaines précédentes, afin de minimiser la détresse et de permettre le développement des gamètes. Acclimatez les couples de poissons adolescents adultes sélectionnés (normalement avec cette composition : 1 ♂ : 2 ♀ ) dans des bassins d’élevage appropriés. Séparez les femelles des mâles à l’aide d’un séparateur de réservoir jusqu’au lendemain matin. Assurez-vous d’un cycle standard lumière/obscurité de 14/10 h.
      REMARQUE : Des croix de groupe peuvent également être organisées. Cependant, dans ce cas, la ponte peut avoir lieu à des moments différents et la sélection d’embryons au même stade à partir de couvées mixtes devient plus difficile. La transition de l’obscurité à la lumière est essentielle à la réussite de l’accouplement.
5. Collecte d’embryons et micro-injection d’ARNm WT et mutants (jour 4)
   1. Dès que la lumière est allumée dans l’installation, retirez le séparateur de réservoir séparant les mâles et les femelles et, si nécessaire, remplacez environ 20 % de l’eau du réservoir par de l’eau douce provenant du système d’aquaculture en recirculation afin de maintenir la qualité de l’eau élevée sans diluer excessivement les hormones libérées par les poissons.
   2. Laissez le poisson tranquille et vérifiez régulièrement qu’il n’y a pas de ponte (généralement dans les 30 premières minutes à 1 heure du jour). Les œufs (2-3 mm) sont pondus et tombent au fond du bassin, séparés par une grille de sorte que les adultes ne peuvent pas les manger. Isolez les adultes qui ont réussi à se reproduire et filtrez l’eau du réservoir contenant les œufs à l’aide d’une passoire standard (comme une passoire à thé) pour retenir les œufs.
      REMARQUE : Il est possible de remettre le même poisson dans le réservoir d’élevage pour un autre tour d’accouplement ou de ramener le poisson dans les réservoirs d’hébergement d’origine, en enregistrant le couple d’accouplement, la date et la performance.
   3. Lavez les embryons collectés avec un milieu E3 frais et retirez les œufs non fécondés et dégénérés, les excréments et autres types de débris des paires à l’aide d’une pipette Pasteur.
      REMARQUE : Prélever ~n = 100 œufs d’adolescents fécondés dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre pour éviter la surpopulation d’embryons.
   4. Disposez et alignez les œufs d’adolescents fécondés dans une plaque de micro-injection personnalisée obtenue en moulant de l’agarose à 2 % dans un milieu E3 pour générer des voies appropriées qui doivent contenir et restreindre les œufs lors de la micro-injection.
      REMARQUE : À cette fin, des moules sur mesure ou commerciaux peuvent être utilisés.
   5. Préparez un mélange frais de micro-injection pour générer des embryons mutants comme suit : 30-60 pg d’ARNm coiffé et polyadénylé (ici shp2) dissous dans une solution de Danieau 0,3x (diluée à partir d’une solution mère) pour un volume final de 20 μL. Ajouter 0,2 μL (0,05 %) de solution mère de rouge de phénol comme traceur de micro-injection.
   6. Chargez l’aiguille avec 2 μL de matériau d’injection à l’aide d’une pipette à microchargeur. Injectez la solution dans un stade unicellulaire d’embryons de poisson-zèbre adolescent à l’aide d’un dispositif de micro-injection à pression disponible dans le commerce, en ajustant manuellement les paramètres de pression et de temps pour calibrer chaque injection en fonction de la qualité de l’aiguille et de l’embryon. Reportez-vous aux protocoles standard de micro-injection de poisson-zèbre disponibles dans la littérature^11,12.
   7. Élevez les embryons d’adolescents microinjectés dans des conditions d’élevage contrôlées (température : 28 °C, humidité : 70 %, cycle lumière/obscurité : 14/10 h) pour un développement optimal et nettoyez les œufs qui semblent troubles ou dégénérés dans les 3 heures suivant la ponte.
   8. À ~4 h après la fécondation (hpf), dépister la fluorescence (expression du rapporteur) des embryons à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence standard avec des réglages de lampe et de filtre appropriés (465-500 nm). Utilisez des poissons adolescents positifs pour l’imagerie FRET et des frères et sœurs négatifs pour les évaluations immunohistochimiques (IHC) (voir ci-dessous).
      REMARQUE : Étant donné la variabilité connue dans l’expression des transgènes¹³ basés sur Tol2, les embryons peuvent présenter des niveaux variables de fluorescence chez l’adolescent . Il est recommandé d’inspecter les frères et sœurs non injectés pour contrôler la variabilité interindividuelle de la fluorescence au sein d’un lot et, compte tenu de la faible plage dynamique de l’imagerie FRET, d’éliminer les embryons présentant des niveaux extrêmement faibles de fluorescence basale.
6. Traitement des embryons de poisson-zèbre avec l’inhibiteur de MEK (MEKi) (Jour 4)
   1. Préparez une solution intermédiaire de MEKi PD0325901 (1 mM) en diluant 1 μL de solution mère de 10 mM avec 9 μL de milieu E3. Utilisez la solution intermédiaire pour obtenir les solutions finales à faible dose. Préparez une faible dose (0,25 μM) de MEKi PD0325901 dans un volume total de 3 mL en mélangeant 0,75 μL de la solution intermédiaire de 1 mM avec 2,25 μL de milieu E3. Diluer 0,75 μL de DMSO à 10 % avec 2,25 mL de milieu E3 pour obtenir la solution témoin (Ctrl).
   2. Placez des pools d’embryons d’un nombre égal dans différents puits d’une plaque à 6 puits et commencez le traitement par immersion dans le bain : pour chaque puits, remplacez le milieu E3 par un milieu E3 contenant un véhicule témoin (0,0025 % de DMSO) ou des médicaments dilués à la concentration souhaitée (0,25 μM, 0,0025 % de DMSO) comme mentionné précédemment. Utilisez 3 ml de solution médicamenteuse par puits.
      REMARQUE : Pour éliminer tout effet causé par des concentrations variables du support (DMSO), il est important de s’assurer que les solutions de contrôle et de traitement ont la même concentration finale de DMSO.
   3. Conservez les embryons traités à 28 °C avant de les prélever jusqu’au stade de développement souhaité pour les tests de suivi (ici : analyse morphométrique et validation IHC).

2. Imagerie FRET multispectrale en direct de modèles de poissons-zèbres RASopathy au stade de gastrula et analyse des données

1. Montage de gastrulae pour l’imagerie en direct (Jour 4) (Figure 2A)
   1. Préparez le milieu de montage pour les embryons vivants en dissolvant 1,5 g d’agarose à bas point de fusion (LMA) dans 1x PBS pour obtenir 1,5 % de LMA/E3.
      REMARQUE : Choisissez la concentration d’agarose de 0,8 à 1,5 % selon le stade de développement et le besoin spécifique de retenir le poisson. Distribuez la solution LMA fraîchement préparée en aliquotes du format souhaité et stockez le LMA dans un état polymérisé à RT (stable pendant quelques mois). Cela minimise la contamination bactérienne et fongique, mais vérifiez régulièrement la qualité de l’aliquote LMA avant utilisation.
   2. Avant le montage de l’échantillon, faites fondre l’aliquote LMA à 1,5 % dans un thermomélangeur ou un bain-marie stérile à 50 °C. Une fois dissous, baissez la température du thermomélangeur à environ 30 °C.
   3. Positionnez un embryon Teen⁺ injecté d’une seule fois (ici une gastrula exprimant Shp^D61G) au centre d’une parabole à fond de verre de 35 mm de diamètre pour l’imagerie en direct et orientez-le à l’aide d’un cheveu fin. Retirez l’excès de milieu E3 et immobilisez l’embryon en mettant une goutte de LMA sur le dessus et en le laissant polymériser à RT.
      REMARQUE : Au début du processus de polymérisation, le poisson peut être orienté à la position souhaitée. Il est strictement recommandé d’utiliser le LMA à une température ne dépassant pas 35 °C pour éviter d’endommager les tissus.
2. Réglage des paramètres de microscopie et réalisation d’une imagerie FRET multispectrale des gastrulae (jour 4) (Graphique 2B)
   REMARQUE : Le protocole s’applique à l’utilisation de toutes les plateformes de microscopie confocale équipées de tout le matériel et de tous les logiciels nécessaires pour effectuer l’imagerie FRET. Ici, nous avons utilisé un microscope confocal équipé d’un laser argon-ion avec les lignes de longueur d’onde de 458-476-488-496-514 nm, un séparateur de faisceau acousto-optique programmable (AOBS) qui sépare la lumière d’excitation et d’émission, deux détecteurs hybrides spectraux (HyD) et un incubateur de scène pour maintenir des conditions stables de température (à 28 °C) et d’humidité pendant l’imagerie en direct des échantillons.
   Le protocole d’imagerie FRET multispectrale en direct tel que décrit peut être appliqué à des embryons à différents stades de développement au-delà des gastrulae précoces, comme l’ont montré Fasano et al.⁷. Une pile z plus grande doit être envisagée pour les stades de développement ultérieurs (par exemple, 24 hpf) ainsi que des paramètres appropriés des intervalles z et t pour permettre des étapes de détection multispectrales lors de l’acquisition d’images spectrales FRET.
   1. Allumez le contrôleur de l’incubateur au moins 1 h avant de commencer l’acquisition et réglez la température à 28 °C pour maintenir les embryons de poisson-zèbre dans un état sain. Une fois que la température de l’incubateur s’est stabilisée, placez la boîte d’imagerie avec l’embryon sur le porte-échantillon et utilisez un objectif 10x/sec (ouverture numérique de 0,4) pour visualiser rapidement l’échantillon.
   2. Dans la configuration laser du logiciel référencé, allumez le laser argon-ion et utilisez le curseur pour régler la puissance laser à 50 %. Dans les paramètres matériels, choisissez une résolution de profondeur de 8 bits à laquelle les images seront acquises.
   3. Sélectionnez le mode de balayage de détection spectrale XYλZ dans le panneau d’acquisition et réglez les paramètres d’acquisition suivants : format de l’image : 512 x 512 px ; vitesse de balayage de 400 Hz ; zoom optique de 0,75.
   4. Activez la ligne laser 458 nm du laser argon-ion et réglez sa valeur d’intensité, normalement <10 % (ici 8,5 %).
   5. Sélectionnez un détecteur HyD et ajustez la sensibilité du détecteur (gain) en saisissant la valeur souhaitée (ici 500).
      REMARQUE : Pour les échantillons en direct faiblement fluorescents et pour accumuler moins de bruit de fond, il est conseillé d’utiliser des détecteurs hybrides plutôt que des tubes photomultiplicateurs (PMT).
      Dans le logiciel référencé, l’affichage du spectre d’émission d’un colorant nécessite l’activation d’un détecteur.
   6. Pour commencer, activez le premier détecteur (HyD) et sélectionnez la protéine de fluorescence cyan (CFP) pour afficher sa courbe d’émission. Ouvrez le menu déroulant de la barre du détecteur du logiciel pour ouvrir la liste de sélection de la courbe d’émission CFP. Maintenant, activez un deuxième détecteur pour afficher la courbe d’émission de la deuxième protéine de fluorescence jaune colorant (YFP). Pour afficher également la courbe d’émission Ypet , activez un deuxième détecteur, puis sélectionnez la courbe d’émission YFP qui apparaîtra dans l’image du spectre, après avoir éteint le deuxième détecteur.
      REMARQUE : Une fois cette étape terminée, le deuxième détecteur doit être désactivé, car un seul détecteur est utilisé en mode d’acquisition spectrale.
   7. Pour démarrer les acquisitions en direct, positionnez le curseur de détection dans la plage d’émission du signal le plus intense (dans ce cas, celle de YFP) pour visualiser l’échantillon, décider et définir les positions de début et de fin de l’épaisseur de l’échantillon dans la fenêtre LAS X de la pile z.
   8. Pour les propriétés de plage λ-scan, définissez les paramètres suivants : début (460 nm) et fin (570 nm) de la plage de détection ; Largeur de la bande de détection : 5 nm ; Pas de balayage λ : 5 nm. Lancez l’acquisition de z-stack.
      REMARQUE : Les paramètres indiqués permettent aux utilisateurs d’obtenir une imagerie relativement rapide avec une résolution acceptable, mais différents paramètres peuvent être utilisés. Dans les paramètres du disque fluorificateur, le filtre NOTCH inséré automatiquement peut être désélectionné pour éviter une perte d’intensité unique.
   9. Pour évaluer les changements de signal en temps réel lors de l’exposition à MEKi, montez un seul embryon mutant (ici Shp2^D61G) dans une boîte en verre et imagez avant et après le traitement médicamenteux. Pour ces expériences en direct, effectuer directement le traitement médicamenteux par immersion dans le bain pendant la séance d’imagerie avec un maximum de 2 mL de la solution contenant le médicament dissous.
3. Post-traitement d’images et séparation multispectrale des colorants pour obtenir des images FRET ratiométriques (Jour 5) (Graphique 2C)
   1. Pour séparer l’émission donneuse (CFP) et l’émission accepteuse (Ypet), assurez-vous d’éliminer la contribution de l’émission de fluorescence des deux molécules dans le canal FRET, appelé saignement spectral (SBT).
      1. Reportez-vous aux bases de données publiques sur les protéines colorantes/fluorescentes pour afficher et télécharger le fichier .cvs relatif à un spectre d’émission CFP standard (spectres d’excitation et d’émission).
      2. Dans le panneau Données du fichier .cvs, choisissez l’option Texte en colonnes et divisez les données en colonnes à l’aide d’une virgule comme délimiteur. Le fichier qui en résultera comprendra des informations supplémentaires (par exemple, excitation CFP, CFP 2P) qui devraient être supprimées. Ne conservez que les données de la colonne relatives à la longueur d’onde et à l’émission.
      3. Dans la colonne d’émission CFP, supprimez toutes les données d’intensité à partir de 501 nm.
      4. Enregistrer le fichier adapté du spectre d’émission CFP de 460 à 500 nm dans .xls format (appelé « eCFP modifié » dans la figure 2C).
      5. Répétez la même procédure pour télécharger et traiter le spectre d’émission de protéines YFP et ne conservez que les données de la colonne relatives à la longueur d’onde et à l’émission. Supprimez toutes les valeurs d’émission jusqu’à 524 nm. Enregistrez le fichier de spectre d’émission YFP adapté de 525 à 650 nm in.xls format (appelé « Ypet à partir de 525 nm » dans la figure 2C).
      6. Pour permettre l’exclusion du saignement spectral (SBT) dans la base de données de colorants disponible dans la fenêtre de configuration du logiciel, insérez et enregistrez deux spectres d’émission de référence adaptés pour CFP et YFP.
   2. Sélectionnez le fichier d’image spectrale obtenu dans la session d’imagerie, ouvrez la fenêtre Processus , puis sélectionnez Séparation spectrale des colorants dans l’outil Séparation des colorants. Configurez les paramètres de séparation des colorants comme suit : dans les listes déroulantes sur le côté gauche de la boîte de dialogue, sélectionnez le nouveau spectre d’émission CFP (eCFP modified) en première position et le nouveau spectre d’émission YFP (Ypet à partir de 525 nm) dans la base de données de spectre.
   3. Sous Redimensionner, sélectionnez Par canal pour mettre à l’échelle les canaux individuellement puis, dans le λ-scan des images, choisissez celui avec la plus grande intensité de signal (correspondant à l’étape 14 du balayage spectral au niveau du pic d’émission du canal FRET, indiqué par une flèche blanche dans le panneau montrant les étapes de détection à droite de la figure 2B). Ensuite, déplacez-vous le long du balayage Z de l’échantillon et choisissez la section optique qui met en évidence la zone d’intérêt sur la zone de marge.
   4. Utilisez le mode de sélection ROI sur la zone de marge du poteau d’animal pour définir la zone avec le meilleur spectre. Cliquez sur ROICrosshair indiqué en haut de la fenêtre d’affichage pour appeler le réticule et ajuster la taille du retour sur investissement de référence en saisissant la valeur de 40 voxels dans la zone de mesures. Définissez précisément la zone d’intérêt par le ROICrosshair. Dans le diagramme d’image, choisissez la normalisation des données, puis cliquez sur Appliquer pour effectuer la séparation des colorants avec les paramètres configurés.
   5. Ouvrez ce fichier nouvellement généré obtenu avec les deux canaux séparés et produisez une image de projection bidimensionnelle à partir de la série d’images tridimensionnelles (projection d’intensité maximale) pour la visualisation des données.
   6. Dans la fenêtre Processus , sélectionnez Recadrer pour séparer les canaux en deux fichiers distincts, les canaux CH1 et CH2 (ou FRET).
   7. Dans la fenêtre Processus , sélectionnez Combiner les images, sélectionnez le fichier CH2 et insérez-le dans la première option, puis sélectionnez le fichier CH1 et insérez-le dans la deuxième option. Définissez une redimensionnement avec le facteur 5 et choisissez l’opération Ratio. Ensuite, cliquez sur Appliquer pour générer le nouveau fichier contenant l’image ratiométrique (YFP/CFP). Enregistrez le fichier pour l’analyse ultérieure des données.
4. Analyse quantitative des signaux FRET et rendu d’image (Jours 5-6) (Figure 2D)
   1. Pour des mesures quantitatives des signaux FRET à partir d’images ratiométriques FRET/CFP, réaliser l’expérience sur N>2 embryons (réplicats), en fonction d’une évaluation statistique a priori basée sur l’effet attendu. Utilisez un progiciel de traitement d’images tel que le logiciel open source Fiji. Importez les fichiers d’image obtenus à partir de l’imagerie spectrale et de la séparation des colorants dans un progiciel d’analyse d’images tel que l’open source Fiji.
   2. Avant de commencer la sélection du retour sur investissement sur les images de gastrulae, définissez les paramètres en tant que mesures de lecture à l’aide de la fonction Analyze | Définir les mesures | sélectionnez les paramètres d’intérêt tels que Surface, Densité intégrée et Valeur de gris moyenne.
   3. Sélectionnez la région d’intérêt (dans cette étude spécifique : la marge de gastrula) à l’aide de l’outil de sélection de polygones de la barre d’outils. Enregistrez les spécifications ROI x,y en cliquant sur Analyser | Outils | Responsable ROI.
   4. Pour effectuer des mesures dans un retour sur investissement sélectionné, cliquez sur Analyser | Mesurer. Répétez ces étapes pour chaque retour sur investissement et image/condition.
      REMARQUE : Si nécessaire, enregistrez l’image sous le nom . format TIFF. Il est possible d’enregistrer toutes les mesures de retour sur investissement dérivées de plusieurs images dans un seul fichier de retour sur investissement. Renommez chaque mesure dans la liste du gestionnaire de retour sur investissement avec le nom correct relatif à chaque échantillon/image.
   5. Pour chaque condition (mutant et mutant + traitement ici), extrayez toutes les valeurs du rapport FRET/CFP pour chaque ROI sélectionné obtenu et organisez-les dans une feuille de travail en organisant, par exemple, les groupes expérimentaux en colonnes et chaque valeur brute en lignes.
   6. Utiliser tout logiciel approprié pour évaluer les différences statistiques des signaux FRET entre différentes conditions expérimentales et pour la génération de graphiques et la visualisation de données.
      REMARQUE : Des logiciels open source et sous licence sont disponibles pour l’analyse de données et les solutions graphiques.
   7. Organiser un projet spécifique pour l’évaluation statistique en tenant compte de toutes les mesures brutes et du nombre de répétitions pour chaque condition expérimentale. Pour l’analyse statistique d’une seule réplication biologique, créez une table de colonnes avec une variable de regroupement, chaque groupe étant défini par une colonne. Pour l’analyse statistique de plus d’une répétition biologique, créez des tables groupées comportant au moins deux variables de regroupement, l’une définie par des colonnes (p. ex., conditions expérimentales) et l’autre définie par des rangées (p. ex., valeurs moyennes des répétitions).
   8. Après avoir organisé de manière appropriée les groupes expérimentaux dans la feuille de travail, évaluez la distribution des données (test de normalité, par exemple, D’Agostino-Pearson, Anderson-Darling) et, en fonction du résultat, choisissez le test statistique le plus approprié.
      1. Effectuer une ANOVA à un facteur pour les données paramétriques (selon la distribution gaussienne) et un test de Kruskal-Wallis pour les données non paramétriques. Si d’autres facteurs sont présents (concentrations génétiques et de médicaments), envisagez une ANOVA à deux facteurs. Comparez la valeur FRET moyenne de chaque condition les unes par rapport aux autres (comparaisons multiples) et corrigez les comparaisons multiples à l’aide d’un test post-hoc (par exemple, le test de Tukey et celui de Dunn pour les données paramétriques et non paramétriques, respectivement).

3. Validation IHC des résultats du FRET et analyse morphométrique corrélative des défauts de gastrulation

1. Préparation des solutions et fixation et montage de l’embryon pour l’IHC contre tERK et pERK (Jour 7) (Figure 3A)
   1. Préparer les solutions de travail requises pour l’IHC.
      1. Préparez une solution mère de 10x PBS en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na₂HPO₄ et 2,4 g de KH₂PO₄ dans 1 L d’eau DD. Autoclavez la solution pour la maintenir stérile.
      2. Préparez une solution de PBS-Triton à 0,8 % (PBSTr) en dissolvant 8 mL de Triton X-100 à 10 % dans un volume final de 100 mL de 1x PBS.
      3. Préparez des solutions de glycérol à 20 %, 50 % et 80 % en diluant 3 ml, 7,5 ml et 12 ml de glycérol à 100 %, respectivement, dans un volume final de 15 ml de 1x PBS.
   2. Préparez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % / PBSTr à 0,25 % (solution fixative) en mélangeant 2,5 mL de PFA à 16 % dans 250 μL de Triton X-100 à 10 % préalablement dissous dans un volume final de 10 mL de 1x PBS. Utilisez cette solution pour fixer les embryons à 6 hpf pendant la nuit à 4 °C. Utilisez des tubes de 2 ml et un maximum de cinq embryons par tube pour permettre une fixation et des lavages efficaces.
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer un nouveau fixateur pour chaque tour de fixation. ATTENTION : Lorsque vous manipulez du formaldéhyde à 16 %, portez un équipement de protection individuelle (EPI) et sous une cagoule chimique.
   3. Lavez les embryons dans les tubes de 2 ml en remplissant les tubes avec 1,5 ml de PBSTr à 0,8 % pendant quelques fois. Transférez les embryons dans de nouveaux tubes de 2 ml et conservez les embryons dans 1x PBS jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Si vous n’êtes pas familier avec la manipulation des embryons précoces de poisson-zèbre, travaillez au stéréomicroscope pour éviter la perte d’embryons pendant le pipetage. Utilisez de la vaisselle en plastique à faible liaison pour réduire l’adhérence possible des embryons à la paroi du tube.
2. Perméabilisation tissulaire et IHC contre pERK et tERK (jours 7-9)
   REMARQUE : Les résultats de l’IHC dépendent de plusieurs variables qui peuvent différer d’un laboratoire à l’autre et une optimisation spécifique des protocoles peut être nécessaire.
   1. Laver les embryons de poisson-zèbre fixés dans 1 mL de PBSTr à 0,8 % pendant 3 x 10 min à RT.
   2. Perméabiliser les échantillons avec 2 μL de protéinase K diluée dans 0,8 % de PBSTr (1:1 000) pendant 2 min à RT.
   3. Arrêtez la perméabilisation du tissu en lavant les échantillons dans 1 mL de PBSTr à 0,8 % pendant 3 x 10 min, et postfixez les échantillons dans 500 μL de PFA à 4 % / 1x PBS pendant 20 min à RT. Ensuite, laver les échantillons dans 1 mL de PBSTr à 0,8 % pendant 3 x 10 min.
      REMARQUE : La méthode et le temps utilisés pour la perméabilisation des tissus sont des étapes critiques qui peuvent être influencées par le type d’antigène, la qualité de la préservation des tissus et les facteurs environnementaux. Optimisez le protocole avant de l’appliquer sur des échantillons précieux.
   4. Incuber les échantillons avec 1 tampon bloquant (BB) contenant 5 % de sérum de chèvre normal (NGS), 1 % d’albumine sérique bovine (BSA), 1 % de DMSO, préparé comme suit : 75 μL de 100 % NGS, 150 μL de 10 % de BSA et 15 μL de 100 % de DMSO dans un volume final de 1,5 ml de PBSTr à 0,8 %. Utilisez 200 μL de la solution par tube et incubez les embryons pendant 20 à 30 min à RT dans la solution.
   5. Retirez le 1x BB de l’étape précédente et incubez les échantillons dans une solution contenant un mélange des anticorps primaires souhaités (ici : dilution de 1 μL d’anticorps monoclonal primaire de souris p44/42 MAPK, ERK total, tERK, + 1 μL de phospho-p44/42 MAPK polyclonal de lapin, ERK phosphorylé, pERK) dans 250 μL de solution 1x BB fraîchement préparée. Utilisez 200 μL de solution par tube et incubez les embryons dans la solution pendant la nuit à 20 °C.
   6. Pour éliminer les liaisons non spécifiques, laver les échantillons avec 1 mL de PBSTr à 0,8 % plusieurs fois (d’abord toutes les 10 minutes, puis toutes les 30 minutes).
   7. Incuber les échantillons dans 1x BB fraîchement préparés pendant 20 min à RT. Utilisez 200 μL par tube.
   8. Retirez le 1x BB de l’étape précédente et incubez les échantillons avec un mélange d’anticorps secondaires (1 μL d’anti-souris de chèvre conjugué 488 par fluorescence, + 1 μL d’anti-lapin 633 conjugué par fluorescence dans 600 μL de solution de 1x BB). Laissez les embryons agiter doucement pendant la nuit à 20 °C.
      REMARQUE : Nous avons effectué l’IHC sur des poissons adolescents négatifs (non transgéniques) du même lot que celui utilisé pour l’imagerie FRET. Alternativement, les poissons Teen⁺ peuvent également être utilisés, mais dans ce cas, des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores qui ne chevauchent pas les spectres d’émission de CFP ou YFP doivent être utilisés à la place.
   9. Éliminez les liaisons non spécifiques comme décrit ci-dessus.
   10. Laver les échantillons dans un gradient de glycérol/1x solutions PBS (20 %, 50 %, 80 %) pendant 15 min pour chaque solution à RT. Stocker les échantillons dans 90 % de glycérol/1x PBS à 4 °C.
       REMARQUE : Pour minimiser la décroissance de la fluorescence possible, stockez les échantillons dans l’obscurité.
3. Microscopie confocale du tissu immunocoloré et analyse quantitative (jours 10-11) (Figure 3B-E)
   1. Montez les embryons comme décrit précédemment.
   2. Réglez les paramètres d’acquisition de la microscopie confocale comme suit : laser blanc à 80 %, plage d’émission de fluorescence à 507 - 551 nm pour la chèvre anti-souris conjuguée par fluorescence (dans ce cas avec le spectre d’émission de 488 nm, utilisé pour le tERK), 644 - 740 nm pour la chèvre anti-lapin conjuguée par fluorescence (dans ce cas avec le spectre d’émission de 633 nm, utilisé pour le pERK). Sélectionnez le mode d’acquisition séquentiel , un balayage de format de 512 x 512 px et une vitesse de 400 Hz. Définissez le début et la fin du balayage avec une épaisseur de pas z de 4 à 5 μm et un zoom numérique standard de 1. Utilisez l’objectif à immersion dans l’eau 25x (avec une ouverture numérique de 0,05) pour acquérir la gastrula entière à 6 hpf
      ATTENTION : Ce protocole comprend l’application de lasers qui peuvent être nocifs ; Par conséquent, elle nécessite une formation du personnel en fonction des exigences nationales spécifiques.
   3. Après l’acquisition confocale de l’image, inspectez le fichier d’image brute obtenu à l’aide d’un logiciel de traitement d’image tel que le logiciel open source Fidji.
      1. Aux Fidji, utilisez la commande Diviser les canaux du menu Image et du sous-menu Couleur pour obtenir une image de canal unique (total ERK : canal = 0, C = 0 ; pERK : canal =1, C = 1) et générez une image de projection z d’intensité maximale pour les deux canaux en cliquant sur Image | Piles | Projet Z.
      2. Répétez la procédure pour les mesures d’intensité du retour sur investissement comme décrit précédemment et extrayez les données dans une feuille de calcul.
      3. Pour déduire les changements d’intensité du signal p-ERK dans le ROI souhaité parmi les groupes expérimentaux, calculez le rapport p-ERK/t-ERK en divisant les valeurs de densité intégrée brute de la coloration p-ERK par la densité intégrée brute du signal t-ERK. Passez à l’évaluation de la signification statistique comme à l’étape 2.4.
         REMARQUE : Les paramètres d’imagerie peuvent être modifiés en fonction des besoins spécifiques et en tenant compte de la durée de chaque échantillon, de la qualité d’image souhaitée et du nombre de plans à acquérir.
4. Mesures d’axes chez 11 embryons hpf (Jour 4 pour la fixation de l’embryon, Jour 12 pour l’acquisition et l’analyse des données) (Figure 4A-D)
   1. A la fin de la gastrulation (11 hpf), fixer les embryons avec 4 % de PFA dans 1x PBS pendant 20 min à RT, laver plusieurs fois dans 1x PBS, et stocker à 4 °C jusqu’à l’acquisition de l’image.
   2. Orientez les embryons latéralement à l’aide d’une pipette Pasteur dans un seul puits d’une plaque à 12 puits contenant 1x PBS frais.
   3. Pour évaluer la présence d’une forme ovale (rapport des axes embryonnaires Y/X > 1), un phénotype caractéristique de la rasopathie chez le poisson zèbre et le rapport de sauvetage morphologique des axes embryonnaires en raison de l’efficacité du traitement, acquérez des images d’embryons entiers à l’aide d’un stéréomicroscope avec un objectif de grossissement de 3,4x (objectif de balayage de 0,63x x facteur de zoom de 8,60) en capturant simplement des images en mode fond clair.
   4. Importez le fichier image dans un progiciel d’analyse d’images tel que l’open source Fiji.
      1. Mesurez la longueur des axes des embryons (x, petit axe ; y, grand axe) en sélectionnant l’outil droit dans la barre d’outils et en cliquant sur Analyser | Mesurer. Après avoir effectué les mesures sélectionnées, ajoutez-les à la liste du gestionnaire de retour sur investissement et enregistrez le fichier ROI comme expliqué ci-dessus pour l’analyse d’imagerie FRET.
         REMARQUE : Répétez ces étapes pour chaque image d’embryon.
   5. Procédez à l’exportation des données dans une feuille de calcul et calculez le rapport des axes en divisant la longueur du grand axe (y) par la longueur du petit axe (x). Calculez la moyenne, l’écart-type de la moyenne ou l’erreur-type de la moyenne des différentes répétitions.
   6. Procédez à l’analyse statistique des données comme à l’étape 2.4.

Résultats

Ce protocole présente un flux de travail simple pour générer rapidement des modèles RASopathies transitoires dans les embryons de poisson-zèbre et évaluer les fluctuations d’ERK chez les mutants précoces avec une méthode d’imagerie FRET en direct standard appliquée à un capteur de poisson-zèbre ERK récemment établi ^6,9. Comme l’a récemment montré ^6,7 dans le même flux de ...

Discussion

Malgré des décennies de recherche et des myriades de mutations conduisant à des formes très hétérogènes de RASopathies maintenant cartographiées, des variantes génétiques dont la signification est inconnue continuent d’émerger des efforts de séquençage sur des patients non diagnostiqués. En effet, dans de nombreux cas, le diagnostic basé uniquement sur les caractéristiques cliniques peut être difficile et les approches génomiques fonctionnelles pour valider les résultats du séquençage re...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plastique
Aquarium d’élevage 1,7 L - Design de style plage	Tecniplast	1,7L INCLINÉ	Bac d’élevage
Capillaires GC100F-10	Appareil de Harvard	30-0019	Microinjection embryonnaire à un stade cellulaire
Plaques de culture cellulaire et tissulaire - 12 puits	BIOFIL	TCP011012	Collecte et traitement des embryons
Plaques de culture cellulaire et tissulaire - 6 puits	BIOFIL	TCP011006	Collecte et traitement des embryons
Plat de culture cellulaire	SPL Sciences de la vie	20100	Collecte d’embryons & nbsp ;
Plats en verre Nunc 12mm	Thermo Fisher	150680	Imagerie spectrale des FRET embryonnaires
Pipette Pasteur	Corning	357524	Transfert d’embryons
Tubes Lobind Protéinés 2 ml	Eppendorf	30108450	Analyse IHC
< fort> réactifs et autres
Caviar 500-800 & micro ; m	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Nourriture sèche pour poissons
Kystes d’artémie bleu du Grand Lac Salé	Sanders	00004727	Nourriture pour poissons vivants
Sel instantané de l’océan	Tecniplast	XPSIO25R	Sel de mer déshydraté pour la préparation d’aliments vivants
Tg(EF1a :ERK Biosensor-nes) (Adolescent)	Contacts pour commander* : National BioResource Project Zebrafish, Support Unit for Animal Resources Development, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japon. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *sur la signature MTA.  ;	-	Fournisseur de la ligne ERK Reporter pour poisson-zèbre. Les embryons de poisson peuvent être obtenus grâce à la signature MTA du National BioResource Project du Japon pour le poisson-zèbre (RIKEN, Japon). La lignée de poisson-zèbre est déposée par l’Institut de science et de technologie de Nara (Takaaki Matsui) et l’Institut national de génétique (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, brevet pour le système Tol2) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto et Ishioka, 2010).
6x colorant de chargement	Signalisation cellulaire	B7024S	Écrophorèse en gel
Échelle d’ADN à 100 pb	NEB	N3231S	Écrophorèse en gel
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Écrophorèse en gel
Agarose, température de gélification basse	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Montage de l’embryon pour l’imagerie spectrale FRET et le test IHC
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Analyse IHC
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	223506	Composant moyen E3
Nitrate de calcium	Sigma-Aldrich	237124	Composant de solution de Danieau
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Analyse IHC
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Composant tampon TBE pour la préparation du gel
Éthanol 99 %+	Fisher Scientific	10048291	Purification in vitro de l’ARN
Formaldeide 16 %	Thermo Fisher	28908	Fixation embryonnaire
Formamide  ;	Sigma-Aldrich	F9037	Écrophorèse en gel
Tampon de chargement gel II (PAGE de dénaturation)	Thermo Fisher	AM8546G	Transcription in vitro ARN
Acide acétique glaciaire	Sigma-Aldrich	695092	Composant tampon TBE pour la préparation du gel
Glycérol   ;	Sigma-Aldrich	G6279-1L	Analyse IHC
Anti-souris Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Analyse IHC
Anti-lapin pour chèvres Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	Analyse IHC
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Composant de solution de Danieau
KpnI - HF (Enzyme + tampon rCutSmart)	NEB	R3142	Linéarisation plasmidique   ;
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	230391	Composant moyen E3/composant de solution Danieau
Marqueurs ARN du Millénaire	Thermo Fisher	AM7150	Écrophorèse en gel
Kit de purification de l’ADN génomique Monarch	NEB	T3010L	Linéarisation plasmidique   ;
Mouse monoclonal p44/42 MAPK	Signalisation cellulaire	4696S	Analyse IHC
Kit de transcription mMACHINE SP6 & nbsp ;	Thermo Fisher	AM1340	Transcription in vitro ARN
Sérum normal de chèvre (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Analyse IHC
Ambion d’eau sans nucléase	Thermo Fisher	AM9937	Transcription in vitro ARN
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	Inhibiteur MEK
Solution rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P0290	Composant du mélange microinjection & nbsp ;
Kit de dégagement PolyA	Thermo Fisher	AM1350	Transcription in vitro ARN
Chlorure de potassium bioxtra  ;	Sigma-Aldrich	P9333	Composant moyen E3/composant solution Danieau/composant solution stock PBS
Phosphate de dihydrogène de potassium	Sigma-Aldrich	P0662	Composant de solution stock PBS
Protéinase K	Sigma-Aldrich	P2308	Analyse IHC
Phospho-p44/42 polyclonal de lapin MAPK  ;	Signalisation cellulaire	4695S	Analyse IHC
Coloration en gel ADN sûre pour SYBR	Thermo Fisher	S33102	Écrophorèse en gel
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	31434-M	Composant moyen E3/composant solution Danieau/composant solution stock PBS
Dibase phosphate de sodium	Sigma-Aldrich	71643	Composant de solution stock PBS
Base de Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Composant tampon TBE pour la préparation du gel
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Composant tampon PBSTr
Équipement
Alliance Mini HD9 & nbsp ;	Uvitec	-	Système d’imagerie
Centrifugeuse 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifugeuse
Thermomélangeur Eppendorf C	Eppendorf	-	Montage embryonnaire   ;
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Système de microinjection
Infinite M Plex  ;	Tecan	-	Lecteur de plaques multimode
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Microscope stéréoscopique à fluorescence
Leica TCS-SP8X équipé d’incubateur (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Microscope confocal
Mini-sous-cellule GT Système d’électrophorèse horzionale   ;	Bio-Rad	1704406	Écrophorèse en gel
PC-100 Extracteur vertical	Narishige	-	Extracteur d’aiguille
Alimentation universelle PowerPac	Bio-Rad	1645070	Écrophorèse en gel
Stellaris 5  ;	Leica Microsystems	-	Microscope confocal
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Préparation des plasmides
Logiciels
Biorender	Biorender	Licence CC-BY 4.0	Élaboration de dessins animés pour les figures
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Analyses de données
Logiciels fidjiens	ImageJ	15,3t	Rendu d’imagerie et analyses quantitatives (mesures des signaux FRET, intensité de fluorescence ERK dans l’analyse IHC, longueur des axes embryonnaires)
GraphPad Prism  ;	GraphPad Software LLC	v. 9	Analyses statistiques des données
Logiciel de spectrophotomètre iControl	Tecan	v. 2.0	Quantification de l’ARN
Illustrateur	Adobe	26.0.3 (64 bits)	Assemblage de figures
Logiciel LASX	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Acquisition d’imagerie pour les expériences sur les FRET spectrales et imagerie embryonnaire pour les mesures de longueur des axes
Logiciel Q9 Mini 18.02-SN	Uvitec	-	Acquisition d’image gel