Article de méthode

Analyse unilatérale du volume pulmonaire à l’aide de la micro-tomodensitométrie pour une évaluation améliorée de la fibrose pulmonaire dans des modèles précliniques

DOI :

10.3791/67837

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20 juin 2025

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la micro-tomodensitométrie (micro-TDM) pour quantifier les régions ventilées dans un modèle de fibrose pulmonaire unilatéralement induite par la bléomycine via une instillation intratrachéale du côté lésionnel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrose pulmonaire (FP) est une maladie pulmonaire interstitielle progressive et irréversible caractérisée par un mauvais pronostic et des options de traitement limitées. Le modèle murin traditionnel de fibrose pulmonaire induite par l’instillation intratrachéale de bléomycine peut entraîner une distribution inégale des médicaments et des taux de mortalité élevés. La méthode d’instillation intratrachéale unilatérale raffinée pour l’administration de bléomycine chez la souris permet de créer un modèle de fibrose pulmonaire plus uniforme et contrôlé, offrant une meilleure simulation de la maladie chez l’homme. Nous présentons ici un protocole permettant d’utiliser la micro-tomodensitométrie (micro-TDM) pour quantifier les régions ventilées dans un modèle de fibrose pulmonaire unilatérale induite par la bléomycine via une instillation intratrachéale du côté lésionnel. Cette approche permet de quantifier le volume pulmonaire global et les régions pulmonaires ventilées, fournissant une mesure sensible et précise de la progression de la maladie et de la réponse au traitement. Cette étude implique une anesthésie, une administration précise de médicaments, un micro-tomodensitométrie et un post-traitement à l’aide du logiciel 3D Slicer pour l’analyse d’images. L’analyse unilatérale du volume pulmonaire après un traitement à la bléomycine a démontré une réduction significative du volume pulmonaire par rapport aux témoins. La coloration trichrome de Masson a confirmé la présence et le dépôt accru de collagène chez les souris traitées au BLM. Dans ce document, nous avons évalué la fibrose pulmonaire dans des modèles précliniques en effectuant une analyse volumétrique pulmonaire unilatérale à l’aide de la micro-TDM, fournissant aux chercheurs une méthode d’évaluation précise et approfondie pour évaluer les interventions thérapeutiques dans les études de PF.

Introduction

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La fibrose pulmonaire (FP) est une maladie pulmonaire dévastatrice et irréversible dont les méthodes de traitement sont limitées. L’incidence mondiale de la FP varie de 1 à 13 pour 100 000 individus, avec une augmentation significative de la prévalence observée avec l’âge de1 an. Malgré des efforts importants au cours des dernières décennies, le paysage thérapeutique de la FP reste limité, avec seulement deux agents antifibrotiques, le nintedanib et la pirfénidone, actuellement approuvés pour le traitement de la PF2. La pathogenèse sous-jacente de la fibrose pulmonaire est très complexe et englobe divers aspects de la physiologie moléculaire et cellulaire3. Les modèles animaux expérimentaux in vivo , induits par divers agents, sont aujourd’hui des outils essentiels pour étudier les mécanismes pathogènes et les phénotypes des maladies.

Le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, administré par instillation intratrachéale, est largement reconnu pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents et pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles4. Cependant, la distribution asymétrique et non sélective de la bléomycine instillée par voie intratrachéale peut entraîner des taux de mortalité élevés, principalement en raison d’une fibrose inhomogène et de lésions pulmonaires bilatérales 5,6. Pour résoudre ce problème, nous avons proposé une approche unilatérale d’administration intratrachéale afin d’assurer une administration uniforme des agents expérimentaux dans le poumon gauche et de mieux imiter le processus pathologique observé chez les patients atteints de FP 7,8,9. En outre, la technique d’administration unilatérale peut également être utilisée pour évaluer des médicaments nécessitant une distribution localisée ou pour d’autres interventions expérimentales ciblant un poumon spécifique.

Dans les modèles précliniques, la microtomodensitométrie (micro-TDM) est devenue de plus en plus précieuse pour l’étude des pathologies pulmonaires et s’est avérée être un outil puissant pour les études longitudinales, capable de fournir des données qualitatives et quantitatives pour suivre la progression de la maladie ainsi que la réponse aux interventions thérapeutiques10. La micro-tomodensitométrie a été utilisée pour évaluer le volume total, les régions ventilées et non ventilées, la morphologie bronchique et la densité tissulaire. Sur la base de nos études précédentes, nous avons développé une nouvelle méthode d’imagerie dans laquelle la micro-TDM a été utilisée pour analyser le volume pulmonaire unilatéral et évaluer les niveaux de fibrose dans un modèle murin de fibrose pulmonaire 7,8,9. Cette méthode permet de quantifier les régions pulmonaires aérées, ce qui permet de mesurer plus précisément et plus sensiblement la progression de la maladie et la réponse au traitement.

Cette étude présente une méthode unilatérale d’analyse du volume pulmonaire ventilé dérivée de micro-tomodensitogrammes chez des souris traitées à la bléomycine. Cette méthode innovante offre une évaluation plus précise et plus complète de la fibrose pulmonaire, ce qui pourrait transformer la façon dont nous évaluons l’efficacité des interventions thérapeutiques dans les études précliniques. Cette étude apporte un excellent raffinement dans l’analyse des modèles précliniques de fibrose pulmonaire, fournissant une méthode d’analyse quantitative puissante pour évaluer les effets du traitement parallèlement à la progression de la maladie.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Guangzhou. Les expériences ont été menées sur des souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines, âgées de 25 à 30 g. Les souris ont été logées sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures (lumière : 25 lux) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et ont été assignées au hasard à des groupes témoins et BLM.

1. Instillation intratrachéale pulmonaire unilatérale

  1. Anesthésier les souris mâles C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines, 25 à 30 g) par injection intrapéritonéale de 1 % de pentobarbital sodique (50 mg/kg).
  2. Surveillez le niveau d’anesthésie en observant la fréquence respiratoire et le réflexe de retrait du membre.
  3. Fixez la souris en position couchée sur une planche en plastique inclinée à 70°-90°, en la retenant par les incisives et les membres.
  4. Utilisez une pince stérile à bout émoussé pour rétracter doucement la langue.
  5. Insérez une aiguille contondante personnalisée de 22 G dans la trachée à l’aide d’un laryngoscope pour petit animal afin de visualiser les structures de l’épiglotte et de l’oropharynx. Tournez la planche dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à -70° pour aligner la bronche principale gauche parallèlement à la bronche principale. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’une résistance se fasse sentir.
    REMARQUE : Pré-mesurez la longueur du cathéter à l’aide d’une souris d’entraînement de taille similaire pour assurer une longueur d’insertion optimale.
  6. Tournez rapidement jusqu’à un angle de 30° et perférez 40 μL de solution de bléomycine (0,02 mg). Retirez l’aiguille.
  7. Maintenez la souris en position pendant au moins 30 secondes pour assurer une bonne distribution du médicament.
  8. Laissez la souris récupérer en position couchée sur une couverture chauffante.

2. Micro-tomodensitométrie (micro-TDM)

REMARQUE : Les souris ont été scannées à l’aide du système micro-CT conformément aux instructions du fabricant.

  1. Effectuer une micro-tomodensitométrie sur des souris pendant 3 semaines après l’instillation de la bléomycine.
  2. Ajoutez une quantité appropriée d’isoflurane dans le vaporisateur de l’appareil d’anesthésie des gaz de petits animaux, allumez le vaporisateur, ajustez la concentration d’induction à 3 % et placez les souris dans la boîte d’induction jusqu’à ce qu’elles perdent le réflexe de bascule et présentent une respiration lente et profonde.
  3. Retirez les souris de la boîte d’induction et placez-les en décubitus dorsal dans la table de balayage afin que les souris aient leurs membres étendus et leurs corps alignés le long de la ligne médiane.
  4. Réglez la concentration d’isoflurane de maintenance dans la table de balayage sur 1 %.
  5. Réglez le mode de balayage Micro-CT : champ de vision transversal 43 mm, résolution 2K x 2K, taille de pixel 0,042 mm, épaisseur de tranche 0,042 mm.
  6. Après le balayage, placez les souris sur une couverture chauffante jusqu’à ce qu’elles se réveillent.

3. Post-traitement Micro-CT : segmentation sélective unilatérale des poumons et analyse du volume

REMARQUE : Le traitement d’image et l’analyse quantitative ont été effectués à l’aide du logiciel gratuit et open source 3D Slicer (http://www.slicer.org), en suivant les instructions du fabricant. Des plages cliniques de l’unité de Hounsfield (HU) pour la fenêtre pulmonaire ont été appliquées pour normaliser les images HU, segmentant le parenchyme pulmonaire en régions normo-aérées ([-1000, -350] HU) comme indiqué précédemment 8,9,11. La procédure de traitement d’image est décrite comme suit :

  1. Ouvrez 3D Slicer. L’interface opérationnelle est illustrée à la figure 1.
  2. Cliquez sur Charger pour importer les données d’imagerie au format DICOM. Les images axiales, coronales et sagittales seront affichées dans l’interface principale (Figure 2).
  3. Ajustez les paramètres liés à la vue sagittale comme indiqué sur la figure 3 (facultatif). (1 : afficher les options cachées ; 2 : choisir de renommer le volume actuel ; 3 : entrer un nouveau nom).
  4. Dans le module Éditeur de segments , cliquez sur Ajouter pour créer une segmentation pour l’analyse pulmonaire sélective (poumon droit) (Figure 4) (1 : Volumes ; 2 : Éditeur de segments ; 3 : Ajouter un segment ; 4 : Définir le seuil ; 5 : Ajuster la plage de seuil ; 6 : Utiliser pour le masquage ; 7 : Définir le pinceau sphérique).
  5. Réglez la plage de seuil sur [-1000, -350] HU et activez l’option Utiliser pour le masquage .
  6. Utilisez l’outil Peinture avec un pinceau sphérique pour segmenter les régions pulmonaires souhaitées.
  7. Sélectionnez l’outil Îlot , puis choisissez Conserver l’îlot sélectionné. Mettez en surbrillance le poumon droit, puis cliquez sur Afficher la 3D pour afficher le modèle 3D dans le panneau de visualisation (Figure 5) (1 : Modifier les îlots (composants connectés) ; 2 : Choisissez « Conserver l’îlot sélectionné » ; 3 : Afficher le modèle 3D).
  8. Dans le panneau Terminologie , remplacez la couleur du modèle 3D par le bleu (facultatif).
  9. Répétez les étapes 3.4 à 3.6 pour le poumon gauche. Traitez les images de tomodensitométrie thoracique axiale couche par couche pour calculer le volume pulmonaire gauche ventilé et créer un modèle 3D (Figure 6).
  10. Changez la couleur du modèle 3D du poumon gauche en jaune (facultatif).
  11. Réglez l’opacité de la segmentation pulmonaire droite sur 0,2.
  12. Exportez le modèle 3D selon vos besoins (Figure 7).
  13. Capturez des captures d’écran de la vue 3D ou découpez des images et enregistrez-les (Figure 8) (1 : Capture d’écran d’annotation ; 2 : Choisissez le format de l’image ; 3 : Modifiez le chemin d’enregistrement).
  14. Utilisez le module Statistiques de segment pour calculer le volume pulmonaire (mm3) de chaque segment et effectuer une analyse quantitative des régions normo-aérées (Figure 9).

figure-protocol-1
Figure 1 : L’interface du logiciel 3D Slicer. La figure présente l’interface opérationnelle principale du logiciel 3D Slicer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-2
Figure 2 : Images TDM de la fibrose pulmonaire induite par instillation intratrachéale unilatérale chez la souris. Vues axiale, coronale et sagittale, ainsi que reconstruction pulmonaire 3D post-instillation de bléomycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-3
Figure 3 : Réglage des paramètres de la vue sagittale. La figure illustre l’ajustement des paramètres, ce qui permet une visualisation et une analyse précises. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-4
Figure 4 : Édition de la segmentation et ajustements des paramètres. La figure illustre le processus d’édition de la segmentation et les ajustements de paramètres correspondants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-5
Figure 5 : Segmentation 3D du poumon droit. Le processus comporte trois étapes séquentielles : modification des composants connectés pour la segmentation pulmonaire (étape 1), sélection de Conserver l’îlot sélectionné pour isoler le poumon droit (étape 2) et clic sur Afficher la 3D pour afficher le modèle dans le panneau de visualisation (étape 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-6
Figure 6 : Reconstruction 3D du poumon gauche basée sur l’analyse micro-CT. Les images de tomodensitométrie axiale thoracique ont été traitées couche par couche pour segmenter les régions aérées, quantifier le volume ventilé et reconstruire un modèle 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-7
Figure 7 : Reconstruction pulmonaire 3D basée sur l’analyse micro-CT du volume pulmonaire ventilé dans un modèle de fibrose pulmonaire unilatérale. Les modèles reconstruits ont été exportés dans des formats spécifiés vers des répertoires prédéfinis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-8
Figure 8 : guide d’enregistrement des images. La figure décrit les étapes séquentielles de l’enregistrement des images, en commençant par le lancement de la fonction d’enregistrement via le menu Capture d’écran d’annotation, en passant par la sélection des formats et la définition des chemins de stockage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-9
Figure 9 : Analyse statistique basée sur la micro-tomodensitométrie dans un modèle de fibrose pulmonaire unilatérale. Des données quantitatives dérivées de régions normo-aérées ont été analysées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Coloration des trichomes de Masson

  1. Fixez l’échantillon pulmonaire avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante (RT) pendant la nuit, déshydratez-le à l’aide d’une série d’éthanol graduée et incorporez-le dans de la paraffine. Préparez des tranches d’une épaisseur de 5 μm à l’aide d’un microtome rotatif.
  2. Effectuez la coloration trichrome de Masson sur les sections comme suit.
    1. Rincer les parties déparaffinisées et réhydratées à l’eau distillée, puis appliquer un traitement au mordant dans le Fluide de Bouin préchauffé à 56-60 °C pendant 1 h ou une nuit à RT.
    2. Après le lavage, colorez les sections avec la solution d’hématoxyline de fer de Weigert pendant 10 min, rincez à l’eau chaude du robinet pendant 10 min et immergez-les dans la solution de fuchsine d’acide écarlate de Biebrich pendant 10 à 15 min.
    3. Réalisez la différenciation à l’aide d’une solution d’acide phosphomolybdique-phosphotungstique pendant 10 à 15 minutes et surveillez jusqu’à ce que les régions riches en collagène passent du rouge au clair.
    4. Ensuite, transférez directement les lames dans une solution de bleu d’aniline pendant 5 à 10 min, rincez à l’eau distillée et différenciez dans une solution d’acide acétique à 1 % pendant 2 à 5 min.
    5. Après la déshydratation à l’éthanol gradué (95 % jusqu’à l’alcool absolu) et la clarification du xylène, montez les sections avec un milieu résineux.

5. Analyse de l’apprentissage automatique de la coloration trichrome de Masson

  1. Évaluer histopathologiquement l’analyse de la composition en collagène dans des poumons témoins et traités à la bléomycine à l’aide de la coloration trichrome de Masson.
  2. Pour réduire les biais dépendants de l’observateur, acquérez des images numériques haute résolution de coupes pulmonaires colorées à l’aide d’un scanner d’images de lames entières.
  3. Ensuite, analysez quantitativement les zones de collagène avec un logiciel automatisé d’analyse d’image orbitale 8,9,12. Le processus de formation est brièvement décrit ci-dessous.
    1. Délimitez manuellement plusieurs annotations représentatives pour chaque catégorie de tissus (par exemple, collagène, tissu normal et tissu fibreux). Utilisez les caractéristiques pixel par pixel extraites des régions d’entraînement annotées pour construire l’ensemble d’entraînement pour la machine à vecteurs de support (SVM).
    2. Pour les coupes colorées par Masson, définissez la classification des tissus en trois catégories : collagène, tissu normal et arrière-plan.
      REMARQUE : Le modèle d’apprentissage automatique subit un entraînement itératif sur des images de lames entières (WSI) par le biais d’annotations et d’affinages répétés jusqu’à ce que les évaluations validées par le pathologiste confirment la catégorisation précise des tissus. Une fois que la précision de classification satisfaisante est atteinte, le processus devient entièrement automatisé : les caractéristiques sont extraites de chaque pixel dans les régions d’intérêt valides (ROI), et la SVM prédit ensuite la catégorie de tissu correspondante avec une grande précision.

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Résultats

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La figure 10A-D montre les résultats des changements de volume pulmonaire et de l’analyse de la coloration.

Pour évaluer l’impact de la bléomycine (BLM) sur le tissu pulmonaire, nous avons effectué une analyse comparative des volumes pulmonaires entre les groupes traités au sérum physiologique (Ctrl) et les groupes traités au BLM à l’aide de techniques d’imagerie 3D. Le volume du poumon gauche est significativement réduit dans le ...

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Discussion

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La fibrose pulmonaire est une maladie dévastatrice caractérisée par la cicatrisation progressive du tissu pulmonaire, entraînant un déclin de la fonction pulmonaire et, finalement, une insuffisance respiratoire1. Le modèle murin de fibrose pulmonaire, induit par divers agents pharmacologiques et méthodes d’administration, est un outil essentiel pour comprendre la progression de la maladie et évaluer l’efficacité de thérapies potentielles, en particulier dans l’ins...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82300092) et de la recherche indépendante du laboratoire clé d’État des maladies respiratoires (SKLRD-Z-202302) et du financement du projet de renforcement des capacités d’innovation des instituts de recherche provinciaux du Guangdong (KD032024001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % de solution salineHopebioHBPP008-100
Aiguille émoussée 22GBD383922
Trancheuse 3D  ; Plate-forme de calcul d’imagesTrancheuse 3D  ;https://www.slicer.org/
BléomycineMCEHY-17565
L’isofluraneRWDRéférence R510-22
Kit de teinture MassonOuiRéférence 60532ES58
Micro-CTPinsengSNC-100
OrbiteAnalyse de l’image orbitalehttps://www.orbit.bio/
Pentobarbital sodiqueSigmaRéf. P3761
Laryngoscope pour petits animauxYuyan InstrumentsCG-02M
SPSSIBMVersion 19.0
Couverture chaudeLab Anim TechLAT-16-0323

Références

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