Etablissement et évaluation d’un modèle avancé de fibrose pulmonaire in vitro basé sur l’homme

Summary

Une méthode d’imagerie a été mise au point pour évaluer l’activation des fibroblastes dans des coupes de poumon humain coupées avec précision à l’aide de la protéine d’activation des fibroblastes (FAP). Cette méthodologie établit une plate-forme robuste et reproductible pour la stadification de la progression fibrotique, faisant progresser les modèles translationnels in vitro pour le développement thérapeutique tout en maintenant la fidélité du microenvironnement tissulaire humain.

Abstract

La fibrose pulmonaire se caractérise par une destruction irréversible de la structure alvéolaire et un dépôt excessif de matrice extracellulaire. Bien que les modèles animaux aient été largement utilisés dans la recherche sur la fibrose pulmonaire, aucun des modèles actuellement disponibles ne récapitule complètement la nature progressive de la FPI ou ses caractéristiques histologiques déterminantes, telles que les foyers fibroblastiques. Les modèles in vitro avancés, y compris les tranches de poumon découpées avec précision (PCLS), sont souvent considérés comme le système de test pulmonaire le plus pertinent sur le plan physiologique et ont été utilisés avec succès pour le dépistage de drogues. Néanmoins, l’incapacité à différencier le degré de fibrose dans le poumon de la FPI a entraîné une mise en aveuglement et une incertitude dans le PCLS obtenu. Des recherches antérieures ont démontré que la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) pouvait évaluer l’activité pro-fibrotique de la MPI, contribuant potentiellement à un diagnostic précoce et à la sélection de fenêtres thérapeutiques appropriées. Dans cette étude, une PCLS de 600 μm sera obtenue à partir de donneurs sains et de patients atteints de FPI à l’aide d’un trancheur à choc et évaluée à l’aide de sondes moléculaires ciblant la FAP pour déterminer le degré d’activité des fibroblastes en fonction de l’intensité du signal fluorescent. Cette approche fournit un modèle in vitro avancé et une technique d’évaluation pour la recherche sur la fibrose pulmonaire, améliorant la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie et d’évaluer les interventions thérapeutiques.

Introduction

La fibrose pulmonaire (FP) est une forme fréquente dont l’étiologie est inconnue et dont le pronostic est particulièrement sombre, avec un taux de survie médian à cinq ans de seulement 25 %¹. Le modèle d’administration intratrachéale de bléomycine est actuellement le modèle animal le plus largement utilisé pour les études précliniques². Cependant, la fibrose induite par la bléomycine est transitoire et disparaît avec le temps, ce qui contraste fortement avec le caractère irréversible de la^FPI3. De plus, le modèle de bléomycine intratrachéale présente des défis importants en raison de la sévérité hétérogène de la fibrose résultant de l’administration endotrachéale, qu’elle soit chirurgicale ou non chirurgicale. Ces limites des modèles animaux actuels contribuent au taux d’échec élevé des essais cliniques ciblant la FPI⁴.

Les coupes pulmonaires découpées avec précision (PCLS) ont été utilisées dans une variété de maladies parce qu’elles préservent fidèlement les réseaux de diaphonie cellulaire spécifiques à la maladie et le microenvironnement ^5,6,7. Dans la fibrose pulmonaire, le PCLS des poumons IPF conserve l’architecture tissulaire native et l’hétérogénéité cellulaire, permettant l’observation de divers types de cellules et d’interactions cellule-matrice extracellulaire ^8,9, les établissant comme un modèle ex vivo représentatif pour l’étude de la physiopathologie pulmonaire. Cependant, comme la fibrose pulmonaire est caractérisée par des lésions fibrotiques hétérogènes dans les poumons, le prélèvement PCLS est intrinsèquement aveugle. Il n’est pas possible de distinguer visuellement si les coupes obtenues représentent des zones fibrotiques en phase quiescente, en phase active ou en tissu pulmonaire normal. Cette limitation souligne la nécessité d’outils d’évaluation visuelle et de dépistage. Des recherches antérieures ont révélé que la protéine d’activation des fibroblastes (FAP) était fortement et spécifiquement exprimée dans le tissu pulmonaire des patients atteints de FPI, indiquant que la FAP pouvait évaluer l’activité pro-fibrotique de l’ILD¹⁰.

Dans cette étude, un anticorps à chaîne unique contre la FAP a été marqué au vert d’indocyanine (ICG) pour développer une sonde d’imagerie moléculaire ciblée avec une pénétration tissulaire améliorée. La PCLS de 600 μm obtenue à partir de donneurs sains et de patients atteints de FPI a été imagée à l’aide de cette sonde, et l’activité des fibroblastes a été évaluée en fonction de l’intensité du signal fluorescent. Cette modalité d’imagerie surpasse les techniques conventionnelles d’évaluation de la fibrose (Western blot, qPCR, coloration trichrome de Masson ou immunofluorescence) par sa simplicité d’utilisation, préservant l’intégrité et la viabilité cytoarchitecturales tout en permettant un suivi longitudinal de la progression pathogène. Plus important encore, il est facile à utiliser et ne nécessite que 90 min. Il s’agit d’un outil de dépistage avancé pour le modèle in vitro PCLS, facilitant la recherche sur la fibrose pulmonaire.

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital de l’Université de médecine de Guangzhou (2021G-29). La FPI a été diagnostiquée sur la base de l’examen physique et des résultats de la tomodensitométrie thoracique à haute résolution, conformément aux critères diagnostiques établis par ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Tous les échantillons de patients atteints de FPI ont été obtenus à partir d’une transplantation pulmonaire ou d’une biopsie pulmonaire. Des échantillons de tissus pulmonaires sains ont été prélevés sur des donneurs d’organes diagnostiqués avec une mort cérébrale10. Le consentement écrit pour le prélèvement de tissus a été obtenu de chaque patient ou de sa famille avant le prélèvement. Pour plus de détails concernant tous les matériaux, solutions et instruments utilisés dans ce protocole, reportez-vous à la Table des matériaux.

1. Préparation du PCLS humain

REMARQUE : Les patients sont systématiquement dépistés pour des virus tels que le VIH, le VHC ou la syphilis avant la transplantation pulmonaire ou la biopsie, et doivent obtenir un résultat négatif avant de procéder à des expériences ultérieures afin d’assurer la sécurité au travail du personnel de laboratoire.

1. Préparation des solutions
   1. Préparez une solution tamponnée au phosphate (1× PBS) et pré-refroidissez à 4 °C.
   2. Préparez une solution d’agarose à 2 %. Pesez 2 g d’agarose et transférez-le dans un erlenmeyer. Ajouter 100 ml de PBS, bien mélanger et chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que le mélange atteigne une ébullition vigoureuse (≥95 °C), devenant complètement clair, homogène et exempt de particules ou de stries visibles. Agitez le ballon de temps en temps pendant le chauffage pour éviter une ébullition excessive. Placez la solution dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à utilisation.
2. Tranches de poumon coupées avec précision
   1. Lavez la surface externe du tissu pulmonaire avec du PBS pour éliminer l’excès d’impuretés et de sang.
   2. À l’aide d’une seringue de 20 ml (aiguille de 1,2 mm), aspirez un volume approprié d’agarose et insérez-le dans la trachée. Injectez lentement l’agarose dans les lobes pulmonaires jusqu’à ce qu’il soit complètement gonflé. Cesser l’injection en cas de résistance marquée pour éviter les fuites d’agarose.
      REMARQUE : Environ 10 ml d’agarose sont nécessaires pour chaque bloc de tissu de 5 × 2 × 1 cm, afin d’éviter les débordements. Pour les petits morceaux de tissu, utilisez une seringue de 5 ml et des moules d’enrobage (par exemple, des moules en silicone, des plateaux en plastique ou des tubes à centrifuger coupés à la bonne taille) pour faciliter l’enrobage. Versez une couche de base d’agarose de 1 à 2 mm d’épaisseur dans le moule et laissez-la se solidifier à moitié. Placez doucement le tissu pulmonaire sur l’agarose semi-solide, puis versez lentement de l’agarose supplémentaire pour couvrir complètement le tissu, en évitant les bulles. Laissez l’agarose se solidifier complètement.
   3. Placez les poumons sur de la glace pendant environ 30 minutes pour permettre la polymérisation de l’agarose. Vérifiez la dureté et la fraîcheur de la plèvre pour confirmer la polymérisation ; Continuez à refroidir si nécessaire.
   4. Coupez le tissu pulmonaire en plaques de 1 à 2 cm à l’aide d’une lame tranchante.
   5. Centrez le bac à glaçons sur le banc de découpe et remplissez-le de glaçons à l’avance pour le pré-refroidissement.
   6. Allumez l’interrupteur d’alimentation et maintenez enfoncé le bouton UP pour élever la platine d’échantillonnage dans une position appropriée.
   7. Chargez soigneusement la lame sur le porte-couteau.
      REMARQUE : Manipulez la lame avec précaution pour éviter de vous blesser. Jetez les lames usagées dans des contenants pour objets tranchants désignés.
   8. Coupez un morceau de ruban adhésif d’environ 3 cm de long et 1 cm de large. Fixez le côté collant au plateau et enduisez uniformément le côté non collant d’un adhésif cyanoacrylate.
   9. Prélevez un morceau de tissu pulmonaire à l’aide d’une pince. Séchez la surface avec du papier absorbant et placez-la sur le ruban adhésif enduit de colle. Appuyez doucement pour assurer une adhérence ferme.
   10. Une fois que la colle a pris, chargez le plateau sur le plateau de bain de glace. Remplissez de PBS pré-refroidi jusqu’à ce que le bloc de tissu soit immergé.
   11. Réglez la fréquence de vibration sur « 10 » et la vitesse de coupe sur « 2 ». Appuyez sur le bouton FWD pour commencer à trancher. Une fois la première tranche complètement coupée, appuyez sur le bouton STP pour arrêter, puis appuyez sur le bouton RVE pour rétracter la lame. Jetez la première tranche.
   12. Faites pivoter manuellement le plateau tournant 6 fois pour régler l’épaisseur de la section à 600 μm. Appuyez sur le bouton FWD pour reprendre le tranchage et appuyez sur le bouton STP une fois la section coupée. Appuyez sur RVE pour rétracter le couteau et récupérer la tranche pulmonaire à l’aide d’une pince à épiler. Placez la tranche dans du PBS contenant 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et conservez-la sur de la glace.
   13. Répétez les étapes de tranchage ci-dessus pour obtenir des PCLS supplémentaires, chacun d’environ 600 μm d’épaisseur.
   14. Lorsque le bloc tissulaire actuel est presque épuisé, remplacez-le par un nouveau bloc tissulaire et répétez les étapes 1.2.4 à 1.2.13.

2. Purification de l’anticorps FAP

REMARQUE : Générez l’anticorps monodomaine spécifique à la FAP contenant une balise C-terminal His comme décrit précédemment^11,12.

1. Effectuez un affichage de phage pour permettre une sélection à haut débit de fragments d’anticorps spécifiques à la FAP (scFv) en effectuant de manière répétitive des banques combinatoires contre des cibles immobilisées ou en phase solution. Récupérez les phages liés grâce à un lavage et une élution stricts. Amplifiez les phages en réinfectant E. coli et enrichissez les liants cibles sur 3-4 cycles. Valider les clones à l’aide de l’ELISA des phages et du séquençage de l’ADN pour identifier les anticorps de haute affinité¹².
2. Cloner la séquence d’ADN codant pour le fragment variable à chaîne unique anti-FAP dans le vecteur pET-28a(+) fusionné avec un marqueur His pour l’expression chez E. coli¹³.
3. Transformer le plasmide recombinant en cellules E. coli BL21 (DE3). Induire l’expression de protéines à l’aide de l’isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans des cultures en flacon agité incubées pendant une nuit à 20 °C¹⁴.
4. Purifier l’anticorps FAP du surnageant à l’aide de billes d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA). Effectuez un échange de tampon avec PBS pour les applications en aval.
5. Évaluer la pureté des anticorps par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). Une seule bande dominante à la masse moléculaire attendue indique une grande pureté.

3. Évaluation de l’affinité des anticorps contre la PAF

1. Cultiver des cellules embryonnaires humaines de rein 293T (HEK 293T) dans le milieu modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Ajouter la protéine d’activation des fibroblastes humains (hFAP) de lentivirus à 293 cellules T à 90 % de confluence. Incuber pendant 96 h pour générer une lignée cellulaire stable de 293T-hFAP.
3. Digérez les cellules 293T et 293T-hFAP avec 0,25 % de trypsine-EDTA et collectez les cellules.
4. Lavez les cellules avec du PBS et incubez avec un anticorps FAP suivi d’IgG anti-His conjugués à Alexa Fluor 488.
5. Analysez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux NovoCyte^15,16.

4. Marquage de la sonde moléculaire scFv-FAP-ICG

1. Ajuster la concentration de FAP-scFv à 2 mg/mL à l’aide de PBS.
2. Ajouter de l’ester NHS vert d’indocyanine (ICG-NHS) pour obtenir un rapport molaire de 5:1 (ICG-NHS :FAP-scFv).
3. Bien mélanger en tourbillonnant et en secouant.
4. Incuber la réaction dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.
5. Retirez le colorant non lié à l’aide d’une colonne de dessalage. Conservez le produit conjugué final à 4 °C dans l’obscurité.

5. Sonde moléculaire scFv-FAP-ICG pour évaluer le degré d’activité des fibroblastes dans le PCLS

1. Après avoir coupé le PCLS, placez une section par puits dans une plaque à 12 puits. Rincez bien chaque puits deux fois avec 1 mL de PBS pour éliminer le sang résiduel et les débris.
2. Immergez le PCLS dans 1 mL de DMEM sans FBS. Ajouter scFv-FAP-ICG à une concentration finale de 5 μg/mL. Incuber sur un agitateur à température ambiante pendant 1 h en secouant doucement, à l’abri de la lumière.
3. Lavez les échantillons avec du PBS trois fois, chacune pendant 5 min.
4. Acquérez des images de fluorescence ICG de PCLS à l’aide du système d’imagerie animale in vivo avec les paramètres suivants : longueur d’onde d’excitation à 785 nm et longueur d’onde d’émission à 810 nm.
5. Évaluer l’activité de fibrose du PCLS en fonction de l’intensité de la fluorescence. Définissez les régions d’intérêt (ROI) à l’aide d’un logiciel compatible, avec une radiance de fluorescence exprimée en photons/s/cm²/sr.
   1. Cliquez sur le bouton Sélectionner le retour sur investissement pour permettre au logiciel de délimiter automatiquement la zone pseudo-colorée. Si le placement du retour sur investissement est inexact, ajustez-le manuellement. Cliquez sur Calculer pour déterminer l’intensité du signal dans la région. Si plusieurs sous-régions sont sélectionnées, additionnez les valeurs de toutes les sous-régions.

Results

La procédure de préparation du tissu pulmonaire humain pour le PCLS est illustrée à la figure 1. Du tissu pulmonaire humain a été noyé dans de l’agarose, puis coupé en blocs de tissu d’environ 1 cm³ à l’aide d’une lame de rasoir. Des tissus parés et aplatis ont été fixés à une plate-forme de coupe à 600 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome (figures 1A et B). Les PCLS ont été incubés dans des plaques de 12 puits (figure 1C

Discussion

Grâce aux méthodes de recherche ci-dessus, des PCLS provenant de donneurs sains et de patients atteints de FPI ont été préparés. Simultanément, des cellules de mammifères ont été utilisées pour exprimer des fragments variables à chaîne unique de FAP, et leur pureté et leur spécificité ont été vérifiées. Une sonde moléculaire ciblant la PAF et marquée avec de l’ICG a été utilisée pour détecter les niveaux d’expression de la PAF, reflétant le degré d’activation des fibroblastes. Cette appr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % trypsine-EDTA	Gibco	15050-057
2&fois ; Couleur SYBR Vert qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
Seringue de 20 ml	Winner	V532159
293T cell	Beyotime	C6008
502 colle	Zhuolide	D-40
Agarose, basse température de gélification	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anti-Collagen I anticorps	abcam	ab138492
Anticorps anti-fibronectine	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Color Reverse Transcription Kit (avec suppresseur d’ADNg)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Solution de coloration	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Erlenmeyer flask	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Rabbit mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Forceps	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
microbalance	Secura	Secura225D-1CN
micro-ondes	Mideo	PM2002
Multi-Mode In Vivo Système d’Imagerie Animale	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte Cytomètre en flux	ACEA  ; Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Purification universelle de l’ARN	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
&beta ;-actine Rabbit pAb	Yeasen	30102ES
Primer
&beta ;-actin primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
&beta ;-actin primer-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech
Collagen-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Collagen-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronectin primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronectin primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA