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Article de méthode

Modèle murin de parodontite avancée induite par la ligature en nylon dans la deuxième molaire supérieure

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DOI :

10.3791/67848

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30 mai 2025

 ,  , 
1Undergraduate Program of Dental Surgeon, Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala), Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Innate Immunity Laboratory, Biomedicine Research Unit (UBIMED), FES-Iztacala, UNAM, 3Doctoral Program in Biological Sciences, UNAM

Dans cet article

Résumé

Cette étude décrit une méthode modifiée de ligature du nylon 6-0 pour induire la parodontite chez la souris, qui est hautement reproductible et représente une alternative pour les chercheurs pour étudier la maladie parodontale de son développement à ses conséquences pathologiques.

Résumé

La maladie parodontale (MP) est un trouble inflammatoire affectant les tissus de soutien des dents et est l’une des maladies les plus répandues dans le monde. Sa forme sévère, la parodontite, entraîne la destruction des tissus mous, des dents et des os. Des modèles animaux de parodontite ont été développés à l’aide de primates, de chiens, de porcs miniatures et de souris. Parmi ceux-ci, le modèle murin induit par la ligature offre des avantages tels que la progression rapide de la maladie, la reproductibilité, la prévisibilité et le faible coût tout en reproduisant efficacement les aspects clés de la parodontite humaine. Des modèles murins utilisant des ligatures ont fourni des informations précieuses sur les microenvironnements microbiologiques et immunologiques du tissu parodontal, mettant en évidence le rôle critique des biofilms dans les réponses immunitaires et leur association avec les maladies systémiques. Cette étude présente une méthode modifiée de ligature du nylon pour induire la parodontite chez la souris. La modification consiste à utiliser une suture en nylon au lieu d’une suture en soie et à la placer sous la zone de contact interproximale plutôt que de la faire passer à travers le point de contact. Cette approche simplifie la technique tout en induisant efficacement la parodontite. La méthodologie détaillée de pose des sutures est illustrée graphiquement, et la progression de la parodontite est démontrée par des analyses histologiques et histométriques.

Introduction

La maladie parodontale (MP) est un trouble inflammatoire des tissus de soutien des dents et fait partie des maladies les plus répandues dans le monde1 ; l’incidence de la MP varie de 20 % à 50 % dans le monde2. La MP a différents degrés de progression ; sa forme bénigne, appelée gingivite, n’affecte que les tissus mous, et sa forme sévère, appelée parodontite (TP), affecte les tissus durs tels que l’os3. Étant donné que la physiothérapie est une maladie inflammatoire, elle doit être considérée comme une réponse immunitaire complexe qui peut être modifiée par plusieurs facteurs de risque qui peuvent modifier le processus de la maladie4, tels que le diabète sucré5, les maladies cardiovasculaires6, les interactions hormonales telles que les issues défavorables de la grossesse7 ou la prééclampsie8, les maladies inflammatoires9 et même les altérations oculaires10 ou la démence11.

Par conséquent, pour comprendre l’étiologie associée au développement ou à la prévalence de la physiothérapie, pour tester des stratégies thérapeutiques nouvelles ou plus efficaces, ou pour identifier une corrélation entre les maladies systémiques et la physiothérapie ou le microbiote parodontal, des modèles animaux sont nécessaires12.

Le choix d’une méthode de recherche efficace est crucial pour comprendre le développement de la physiothérapie et répondre adéquatement aux questions de recherche13. Au fil des ans, différents modèles animaux ont été développés pour l’étude de la physiothérapie ; Cependant, les modèles tels que les primates, les chiens, les lapins et les cochons miniatures sont coûteux et complexes à utiliser 14,15,16. Les modèles murins de TP, en particulier le modèle de PT induit par la ligature, présentent de nombreux avantages, notamment un développement rapide, une reproductibilité, une prévisibilité et un faible coût 17,18,19.

Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour induire la TP, telles que l’inoculation bactérienne orale, l’injection de lipopolysaccharides et l’induction de ligature 10,20, chacune présente des avantages et des inconvénients 17, le modèle murin de PT induit par la ligature en nylon ressemble au mécanisme humain pour son développement 20,21,22,23. Le PT se produit par la rétention du microbiote résident, provoquant une inflammation et entraînant une perte de tissus. De plus, les souris peuvent être génétiquement modifiées pour étudier différentes populations cellulaires ou molécules d’intérêt pour l’étude de la physiothérapie.

La ligature dentaire peut être réalisée à l’aide de différents matériaux, tels que des fils orthodontiques, des sutures en soie24,25 ou des sutures en nylon26. Le matériau le plus courant pour induire le PT par ligature chez la souris est la soie ; cette méthodologie a été expliquée par différents auteurs, tels que Marchesan et al.18, Abe et al.27 et Chadwick et al.22, chacun avec ses propres modifications, et toutes ces méthodes ont été utilisées avec succès par plusieurs chercheurs28. Cependant, la mise en place d’une suture en soie autour des molaires supérieures chez la souris peut être complexe. Marchesan et al. ont suggéré l’utilisation d’un « porte-ligature » ; Abe et al. et Chadwick et al. ont placé la suture à travers le point de contact, bien que Chadwick et al. l’aient placée autour des molaires M1 et M2.

Des sutures en nylon de différentes épaisseurs ont été utilisées pour le développement de la PT dans différents modèles animaux 29,30,31. Lima et coll.31 ont utilisé des sutures en nylon 5-0 ; Dans des études précédentes, nous avons utilisé des sutures en nylon 6-0 avec des résultats similaires28.

Par rapport aux sutures multifilaments, les sutures en nylon sont synthétiques monofilaments non résorbables et présentent une réponse tissulaire inflammatoire plus faible32 ; de plus, les sutures en nylon permettent également l’accumulation microbienne33,34, et il existe des preuves de l’adhésion de Fusobacterium nucleatum et de Porphyromona intermedia35,36, ainsi que des bactéries anaérobies facultatives dans les sutures en nylon 12,14,17,19,24,27,35,37 (Tableau 1).

Ces caractéristiques peuvent permettre à la réponse inflammatoire de se concentrer principalement sur l’accumulation bactérienne plutôt que sur l’accumulation de matériaux. De plus, le nylon a de meilleures propriétés mécaniques, telles que la résistance à la traction, que la soie38.

Par conséquent, dans la présente étude, la suture en nylon 6-0 placée autour de M2 sous la zone de contact interproximale a induit le développement d’une parodontite à un stade avancé chez la souris. Cette approche permet le placement de ligatures avec une pince à épiler ordinaire, et les résultats sont cohérents. Après 30 jours, le développement du PT peut être confirmé par une analyse histométrique et histologique.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux de laboratoire ont été menées dans le strict respect du « Cadre éthique pour la recherche biomédicale sur des animaux de laboratoire », conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala) selon le protocole CE/FESI/072024/1765. Les souris ont été logées dans des chambres d’animaux avec un accès libre à la nourriture et à l’eau dans un environnement exempt d’agents pathogènes à l’animalerie FES-Iztacala. Ce protocole est une modification de la méthode précédemment décrite par Abe et al.27. Des souris femelles BALB/c âgées de six à huit semaines (pesant 16 g) ont été divisées en groupes témoins (CTL) et en groupes de parodontite (PT). La parodontite a été induite par la mise en place d’une suture en nylon 6-0 le jour 0 pour favoriser une adhésion bactérienne soutenue et déclencher une progression grave et chronique de la maladie. Après 30 jours, toutes les souris ont été euthanasiées (selon les protocoles approuvés par l’établissement) afin d’évaluer les lésions tissulaires et la perte d’attachement (LA) au moyen d’une analyse histométrique (figure 1). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation à l’anesthésie

  1. Préparez une dilution de xylazine et de kétamine (1:10) avec de l’eau injectable (stock). Conserver à 4 °C et utiliser dans les 4 semaines.
  2. Identifiez et pesez chaque souris. Préparez une dose de xylazine (1 mg/kg) et de kétamine (2 mg/kg) en fonction du poids pour une application intramusculaire à l’aide d’une seringue à insuline.
  3. Injecter 50 % de la dose totale de la solution anesthésique dans l’arrière-train. Répétez la procédure du côté opposé.
  4. Placez les souris dans une boîte profonde (10 cm³) et laissez-les s’endormir, ce qui prend environ 3 à 5 min.
  5. Prévenez la sécheresse oculaire et les lésions de la cornée dues à l’anesthésie en appliquant une goutte d’hypromellose sur chaque œil toutes les 15 minutes jusqu’à ce que les souris soient complètement réveillées et puissent cligner des yeux normalement.
    REMARQUE : Les souris doivent être gardées en observation pendant 45 min, la durée approximative de l’anesthésie. Si une souris se réveille avant la fin de la procédure, celle-ci doit être suspendue et la souris doit être remplacée.

2. Positionnement des animaux

  1. Une fois la souris endormie, placez-la sur une table de travail face vers le haut, la tête vers l’opérateur. Tirez doucement chaque jambe sans tension et fixez-les avec du ruban adhésif microporeux pour éviter les mouvements involontaires soudains. Couvrez la souris avec une couverture ou une gaze pour maintenir la chaleur corporelle.
  2. Pour garder le museau ouvert, placez une extrémité d’un élastique orthodontique autour des incisives supérieures et fixez l’autre extrémité à un support supérieur sans tension. Placez un deuxième élastique orthodontique autour des incisives inférieures et fixez-le à un support inférieur avec un élastique.
  3. Placez les séparateurs de joues et déplacez délicatement la languette d’un côté pour une meilleure visibilité.
  4. Positionnez le microscope de manière à permettre une visualisation adéquate des molaires supérieures, en commençant par l’objectif de grossissement le plus bas. Une fois localisé, ajustez le grossissement pour assurer un confort et une mise au point optimaux pour l’opérateur.

3. Placement de la ligature

  1. Une fois que l’image est claire, identifiez les trois molaires supérieures : la plus grande molaire proximale (M1), la molaire suivante (M2) et la plus petite molaire distale (M3). Placez une suture en nylon 6-0, car son diamètre facilite la mise en place de la ligature et cause moins de dommages mécaniques aux tissus que les sutures plus larges.
    1. Localisez la face distale de M2, tenez l’extrémité de la suture en nylon 6-0 à l’aide d’une pince à épiler et placez l’extrémité à la base de la papille palatine. Appliquez une légère pression à travers la base de l’espace palatin interproximal vers la surface buccale (Figure 2A).
    2. Une fois que la suture en nylon 6-0 se croise, tirez-la à travers l’espace interproximal vers le côté buccal (Figure 2B).
  2. Placez l’extrémité de la suture en nylon 6-0 à la base de la zone interproximale à la surface mésiale de M2 du côté buccal. Poussez doucement l’extrémité de la suture pour la faire passer sous l’espace interproximal et passez-la à travers l’espace buccal jusqu’au palatin (Figure 2C).
  3. Tirez doucement sur la suture en nylon 6-0, tenez l’extrémité à l’aide d’une pince à épiler, ajustez-la autour de M2 et fixez la suture avec trois nœuds simples.
  4. Coupez la suture en nylon 6-0 avec des ciseaux fins (figure 2D).

4. Récupération des animaux

  1. Pour libérer la souris, retirez les séparateurs de joues, le ruban adhésif microporeux des jambes et les élastiques orthodontiques. Tout d’abord, retirez l’élastique autour des incisives inférieures, puis retirez l’élastique autour des incisives supérieures.
    1. Retirez la souris de la table de travail, enveloppez-la dans de la gaze ou un chiffon et placez-la face vers le haut. Maintenez la langue sur le côté pour garder les voies respiratoires ouvertes et éviter le blocage.
  2. Gardez l’animal au chaud, recouvert d’un chiffon ou d’une gaze, et sous observation jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé. Ensuite, placez-les dans leurs cages habituelles.
  3. Appliquez une goutte d’hypromellose dans chaque œil jusqu’à ce que la souris puisse cligner normalement.
  4. Gardez l’animal dans des conditions standard.

5. Contrôle de la ligature

  1. Vérifiez la permanence de la ligature en nylon chaque semaine (Figure 3A,B).
  2. Prenez la souris, tenez fermement la tête et le corps et utilisez une pince à épiler pour ouvrir le museau. Observez la suture en nylon 6-0 autour de M2 à la lumière d’une lampe.
  3. Établir le développement de la maladie parodontale basée sur l’accumulation de biofilm et l’irritation mécanique. Vérifiez cela par une analyse histologique.

6. Histologie

  1. Après 30 jours, euthanasier les souris dans une chambre de CO2 (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Récoltez les maxillaires comme indiqué précédemment39. Lavez les tissus récoltés dans une solution de NaCl à 0,9 % et placez-les dans de nouveaux tubes de microcentrifugation étiquetés.
  2. Fixer les échantillons dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h en agitant.
  3. Lavez les échantillons à l’eau du robinet pendant 2 h.
  4. Pour éliminer les minéraux de l’os et préparer des coupes de paraffine de haute qualité, détartrez les échantillons en vingt volumes d’une solution d’EDTA à 4 % (pH 7,3) pendant 20 jours dans des tubes de microcentrifugation, changez l’EDTA tous les 4 jours40.
  5. Intégrez les échantillons dans de la paraffine. Coupez des sections de 5 μm de la zone M2 et colorez-les avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E)41.

7. Analyse des données

  1. Observez les coupes histologiques colorées au microscope optique pour effectuer une analyse descriptive des changements dans la configuration de l’épithélium du sillon, des fibres gingivales, des fibres parodontales, de la hauteur et de l’intégrité de la crête alvéolaire.
  2. Déterminez la perte d’attachement (LA) en mesurant la distance entre la jonction cémento-émail (CEJ) et le point le plus élevé de la crête osseuse. Tracez une ligne entre ces deux points à l’aide d’un programme d’édition numérique. Effectuer une analyse histométrique sur les surfaces buccale et palatine selon la méthodologie décrite par Semenoff et al.42 (Figure 4).

8. Analyse statistique

  1. Analyser les données obtenues des groupes CTL et PT à l’aide du test U de Mann-Whitney. Considérons p < 0,05 comme statistiquement significatif. Utilisez des statistiques et des logiciels graphiques pour l’analyse.

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Résultats

Cette méthodologie permet aux souris induites de développer une parodontite (TP) à partir de la deuxième semaine. Les souris ont été surveillées chaque semaine pour vérifier la présence de la ligature. L’euthanasie a été pratiquée le 30e jour. Les caractéristiques cliniques de tous les groupes ont été évaluées. Le groupe témoin a maintenu des caractéristiques normales, telles que la couleur et la structure de la gencive marginale, au fil du temps. Par rapport à ceux du groupe CTL, les tissus du groupe PT ont montré une i...

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Discussion

Plusieurs modèles animaux de parodontite ont été utilisés pour évaluer différents aspects, tels que les réponses microbiologiques et immunitaires, et présentent certaines similitudes avec la maladie humaine43. Ces résultats fournissent des preuves du cadre de la maladie parodontale, comme le rôle des biofilms, la réponse immunitaire et les interactions avec les affections systémiques44,45.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Ce travail a été financé en partie par le Conseil pour la science et la technologie de l’État de Mexico (COMECYT) numéro de subvention [FICDTEM-2021-072] et le Programme de soutien aux projets de recherche et d’innovation technologique (PAPIIT)-UNAM, numéro de subvention [IN-217021]. Nous remercions le programme de spécialisation en endoperiodontología, FES Iztacala, UNAM pour les installations fournies pour réaliser cette vidéo et Rosalba Yañez Ortiz, DDS, pour son soutien dans la réalisation de cette vidéo. Certaines figurines ont été créées avec le programme Biorender (numéro d’entente ME282NWCI1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de NaCl à 0,9 %  ;PiSARinçage maxillaire  ;
Suture en nylon 6-0Atramat, Internacional Farmacé ; uticaPE1946-N Placement deligature
Amscope 3.7 programme pour appareil photo numériqueAmscope  ;x64, 4.11.21973.20230107
Solution EDTA de collecte de données  ;Sigma&ndash ; AldrichE5134Décalcification  ;
Ciseaux finsgénériquePour couper la suture en nylon 6-0
Pince à tissus finsgénériqueSuture en nylon 6-0
Tampon de gazegénériquePour garder la température corporelle  ;
GraphPad Prisme  ;GraphPad Prisme  ;Version 8.3.0Analyse des données  ;
Hypromellosegénérique  ;Lubrifiant pour les yeux
Eau injectablePiseDilution de la solution anesthésique
KétamineAnesket, PisaAnesthésique
Micro tubes à centrifuger  ;Cellpro801501Pour contenir les tissus durin décalcification  ;
Micropores3M  ;1533Pour fixer souris
Microscope appareil photo numériqueAmscope  ;MU1603Histologie  ;
MicrotubesAxygenMCT-150-CStocker la dilution anesthésique
Microscope optique  ;UNICOSerie G380Histologie  ;
Élastiques orhodontiquesTP Orthodintics, Inc  ;bleuPour garder le museau ouvert  ;
Solution de paraformaldéhydeSigma&ndash ; Aldrich158127Fixation tissulaire  ;
Paraplast  ;Leica39601006Histologie  ;
Microscope chirurgical  ;Carl Zeiss GmbH Berlin6-0 Suture en nylon
Seringues à insuline ultra fines 6mm U-100, 0,3 mLBD326385Pour injecter la solution anesthésique  ;
Élastiques universels  ;génériquePour garder le museau ouvert  ;
Table de travailgénérique  ;Base en bois pour soutenir les souris
XylazinePorcin, PisaPréanesthésique

Références

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Modèle murin de parodontite avancée induite par la ligature en nylon dans la deuxième molaire supérieure
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