Modèle d’obstruction urétérale unilatérale pour l’étude de la fibrose interstitielle rénale

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’induction d’une obstruction urétérale unilatérale (UUO) chez la souris afin d’étudier la progression de la fibrose tissulaire dans la néphropathie obstructive. Il comprend les procédures chirurgicales, les soins postopératoires et les méthodes d’évaluation de la fibrose.

Résumé

La fibrose rénale est le résultat pathologique final de l’insuffisance rénale chronique (IRC) progressive. Le modèle de l’obstruction urétérale unilatérale (UUO) est largement utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la fibrose interstitielle rénale et pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Ce modèle est établi chez la souris par la ligature chirurgicale d’un uretère unilatéral, une procédure relativement simple et facile à réaliser. Cependant, le modèle de souris UUO est connu pour présenter une variabilité et une incohérence importantes, influencées par des facteurs tels que la tension de la souris, l’âge, le sexe, le type d’anesthésie, la durée de la chirurgie, la température corporelle pendant la procédure, les compétences chirurgicales de l’opérateur, les conditions d’alimentation et l’état de santé général des souris. Les variations dans les techniques chirurgicales, la mise en place des sutures et la durée de l’obstruction contribuent à la variabilité des résultats. De plus, un échantillonnage incohérent des reins obstrués augmente encore la variabilité dans l’évaluation de la fibrose rénale. Cette étude décrit le processus de développement du modèle murin UUO et d’évaluation de la fibrose interstitielle, discute des défis techniques contribuant à l’imprévisibilité du modèle et propose des solutions potentielles. Ces connaissances visent à établir une approche plus standardisée et universellement applicable pour l’étude de la fibrose rénale.

Introduction

L’insuffisance rénale chronique (IRC) touche plus de 10 % de la population mondiale et sa prévalence augmente¹. Diverses affections des voies urinaires, y compris les anomalies anatomiques congénitales, la néphrolithiase, l’hyperplasie de la prostate et les tumeurs de la vessie, peuvent entraîner une obstruction urétérale². Par conséquent, le modèle murin d’obstruction urétérale unilatérale (UUO) est un outil clé pour identifier de nouveaux mécanismes de fibrose interstitielle rénale, comprendre la progression de la maladie et évaluer les stratégies de traitement potentielles. Il a été largement utilisé pour étudier l’origine des myofibroblastes, des sous-groupes de (myo)fibroblastes, du métabolisme des cellules tubulaires et de l’arrêt du cycle cellulaire, de la transition épithélio-mésenchymateuse partielle et d’autres processus connexes 3,4,5,6,7,8.

En plus de la fibrose interstitielle rénale induite par l’UUO, d’autres modèles de fibrose interstitielle rénale couramment utilisés chez les rongeurs comprennent des modèles induits par des toxines, tels que ceux utilisant de l’acide aristolochique, de l’acide folique et de l’adénine, ainsi que des modèles induits chirurgicalement comme la néphrectomie 5/6 et les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI). Le modèle UUO offre plusieurs avantages par rapport aux modèles alternatifs de fibrose rénale. Par exemple, la fibrose rénale induite par des toxines nécessite une période de modélisation relativement longue (environ 1 à 2 mois), et ses effets secondaires toxiques sur d’autres organes peuvent compliquer l’investigation des mécanismes de fibrose ^9,10,11. Les modèles induits chirurgicalement, tels que la néphrectomie 5/6, peuvent entraîner des saignements et des infections rénales importants, augmentant ainsi le risque de mortalité postopératoire. De plus, l’étendue de la fibrose interstitielle induite est directement corrélée au volume de tissu rénal réséqué, ce qui rend difficile la reproduction constante du même degré de fibrose chez chaque souris¹².

Le modèle IRI rénal est une méthode primaire pour induire une lésion rénale aiguë à l’IRC et présente une pertinence clinique significative. La gravité de la fibrose peut être modulée en ajustant le temps ischémique et la température corporelle ; cependant, par rapport au modèle UUO, il est plus complexe chirurgicalement et l’induction de la fibrose interstitielle nécessite une durée plus longue¹³. Par rapport à ces modèles, le modèle UUO présente plusieurs avantages, notamment une courte durée de modélisation, une variabilité minimale, une répétabilité et une procédure chirurgicale relativement simple. Le modèle murin UUO, qui n’implique pas de toxines, est créé par la ligature d’un uretère, conduisant à une néphropathie obstructive en deux semaines. Il en résulte une hydronéphrose, une dilatation tubulaire et une fibrose interstitielle, ressemblant étroitement au processus pathologique observé chez l’homme¹⁴. La gravité de la fibrose - légère, modérée ou sévère - peut être contrôlée en ajustant la durée de l’expérience.

Bien que le modèle murin UUO soit plus simple à réaliser que d’autres modèles induits par l’agression pour l’étude de l’IRC, plusieurs facteurs peuvent affecter de manière significative sa stabilité. Ces facteurs comprennent la souche de la souris, l’âge, le sexe, le type d’anesthésie, la durée de l’opération, la température corporelle pendant l’opération, les compétences chirurgicales de l’opérateur, les conditions d’alimentation et l’état de santé des souris^15,16.

Minimiser le stress chirurgical et l’infection tout en effectuant la procédure de manière régulière et organisée sous anesthésie est essentiel pour créer un modèle de souris UUO reproductible. De plus, la recherche sur les mécanismes et les cibles thérapeutiques potentielles de l’IRC peut être compromise par des opérateurs inexpérimentés, ce qui entraîne une augmentation de la perte de souris et une plus grande hétérogénéité des modèles. Pour relever ces défis, les principaux aspects techniques du processus chirurgical - avant, pendant et après l’intervention - sont décrits, mettant en évidence les problèmes critiques qui nécessitent une attention particulière. De plus, la méthodologie d’évaluation du modèle murin UUO est détaillée afin de fournir aux chercheurs une approche cohérente et fiable.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux sont menées conformément aux directives de l’agence et approuvées par le comité institutionnel d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing. Afin d’éliminer les différences entre les sexes et les souches et d’assurer la comparabilité des résultats, seules des souris CD1 mâles âgées de 8 à 10 semaines et pesant de 22 à 25 g sont utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des animaux et des instruments

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie.
2. Pesez et anesthésiez les souris (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Connectez correctement l’appareil d’anesthésie par inhalation et placez les souris dans la chambre d’induction avec 2 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène à 1-2 L/min. Ensuite, placez le nez de la souris dans le cône nasal avec un apport constant d’anesthésie. Confirmez le niveau de sédation approprié en évaluant l’absence de réponse à un pincement de l’orteil.
   REMARQUE : Vérifiez régulièrement la fréquence respiratoire et évaluez le niveau d’anesthésie à l’aide du réflexe de pédale des souris. Ajustez l’isoflurane au besoin.
3. Placez la souris sur un coussin chauffant électronique en position couchée, la tête et le cou étendus pour garder les voies respiratoires ouvertes. Fixez les pattes avec du ruban adhésif peu adhésif.
4. Utilisez un thermomètre pour surveiller la température ambiante et maintenez-la à 37-38 °C. Insérez une sonde rectale et maintenez la température corporelle centrale des souris autour de 36,5-37 °C pendant la procédure.
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir les lésions dues à la xérose cornéenne.
6. Rasez les poils sur la zone chirurgicale avec de la crème dépilatoire et désinfectez-les trois fois avec une solution de bétadine.

2. Intervention chirurgicale

REMARQUE : Une fois que la température corporelle se stabilise au point de consigne et que le réflexe de pincement de l’orteil est absent, lancez les procédures chirurgicales suivantes.

1. Utilisez une lame chirurgicale pour faire une incision chirurgicale verticale d’environ 1 à 1,5 centimètre de la vessie au bord inférieur gauche des côtes pour exposer la cavité abdominale.
2. Déplacez l’intestin vers le côté droit de la cavité abdominale à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline normale stérile pour exposer le rein gauche, situé sous l’arrière de la rate et adjacent à la colonne vertébrale.
3. Utilisez une pince à iris incurvée pour dégager la graisse et le tissu conjonctif entourant l’uretère gauche. Après une isolation douce, ligaturez l’uretère gauche près du pôle inférieur du rein à l’aide d’une suture tressée en soie 3/0. Effectuez une deuxième ligature de l’uretère gauche entre la première ligature et la vessie.
   REMARQUE : Pour minimiser la variabilité entre les souris, assurez-vous que la position de ligature reste cohérente chez tous les sujets. À l’aide de la pince de gauche, placez la suture dans les pointes de la pince de droite et glissez la suture sous l’uretère¹⁷. Évitez d’inclure un excès de graisse et de tissu conjonctif dans la ligature, car cela pourrait entraîner une obstruction rénale incomplète. Pour ce faire, caressez doucement l’uretère avec des cotons-tiges secs.
4. Repositionnez soigneusement les intestins dans la cavité péritonéale. Suturez les couches musculaires et cutanées séparément à l’aide d’une suture tressée en soie 3/0.
   REMARQUE : Suturer les couches cutanées et musculaires peut provoquer la rupture de la plaie de suture et des lésions des viscères abdominaux.
5. Lorsque vous opérez sur plusieurs souris, nettoyez les instruments chirurgicaux avec de l’eau courante et de l’éthanol à 75 % avant de passer à la souris suivante.

3. Soins post-chirurgicaux et surveillance

1. Injecter 0,5 mL de solution saline normale chaude par voie intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation.
2. Remettez les souris dans une cage propre jusqu’à ce qu’elles retrouvent leur pleine conscience.
3. Administrer la buprénorphine (50 μg/kg) par injection sous-cutanée pendant 3 jours. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter des signes de manque de toilettage, de diminution de l’alimentation et de posture anormale.

4. Évaluations postopératoires

1. Histologie
   1. Euthanasier les souris avec une surdose d’isoflurane (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Prélever les reins obstrués et controlatéraux non obstrués¹⁸ après l’euthanasie.
   2. Utilisez la plus grande section transversale de la section rénale pour l’examen histologique.
   3. Fixer les tissus rénaux dans du paraformaldéhyde à 4 % et découper les échantillons obtenus en sections de 4 μm.
   4. Colorez les coupes rénales avec un Schiff acide périodique (PAS), une coloration trichrome de Masson (MTS) ou une coloration rouge Sirius pour détecter les lésions tubulaires rénales et la fibrose rénale.
   5. Sélectionnez dix champs aléatoires de coupes rénales au microscope optique à un grossissement de 200×.
   6. Calculez la proportion de la zone bleue positive au collagène à l’aide du logiciel ImageJ.
2. Transfert Western
   1. Extraire environ 20 mg de tissu rénal du même pôle de reins UUO à l’aide du tampon¹⁸ du test de radio-immunoprécipitation (RIPA).
   2. Quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique¹⁹.
   3. Chargez des quantités égales d’échantillons de protéines sur des gels Bis-Tris à 4 % à 10 % pour l’électrophorèse et transférez-les sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF).
   4. Bloquez les membranes PVDF avec du lait à 5 % dans du Tris-Buffered Saline Tween (TBST) et incubez-les avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.
   5. Lavez les membranes PVDF avec du TBST et incubez-les avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 h.
   6. Détectez les niveaux de protéines à l’aide d’une méthode de chimiluminescence améliorée (ECL) et analysez-les à l’aide du logiciel ImageJ, avec la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme contrôle de charge.
3. Fonction rénale
   1. Anesthésez les souris avec de l’isoflurane inhalé (voir étape 1.2).
   2. Prélever des échantillons de sang rétro-orbitaire après l’anesthésie.
   3. Centrifuger des échantillons de sang à 3 000 x g pendant 15 min à température ambiante.
   4. Mesurez la créatinine sérique et l’azote uréique du sang (BUN) à l’aide d’un analyseur automatique de produits chimiques secs pour surveiller la fonction rénale.

Résultats

Histologie
La coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) a révélé une dilatation tubulaire, une perte des bords de la brosse, la formation de plâtres et un gonflement épithélial tubulaire. Les colorations trichromes de Masson et rouge Sirius ont montré une fibrose interstitielle après UUO, contrairement aux tubules compacts normaux avec des lumières discernables observés dans le groupe placebo. Le degré de fibrose interstitielle rénale, indiqué par des zones bleues dans la coloration trichrome de...

Discussion

Une procédure complète pour établir le modèle UUO, une approche largement utilisée pour l’étude de la fibrose interstitielle rénale, est fournie. De plus, l’identification et l’évaluation du modèle, y compris les évaluations de la fonction rénale et des altérations histologiques, sont démontrées. Les variables contribuant à l’hétérogénéité du modèle et les facteurs techniques modifiables sont discutés.

La sensibilité à l’UUO varie considérablement en fonction ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 ml	Mingankang	/
4/0 suture chirurgicale	Jinhuan Medical	F401
75 % Ethanol	Lircon	6303060031
Pompe à air d’anesthésie	RWD Life Science	R510-29
Chambres d’induction d’anesthésie	RWD Life Science	V102-V
Tondeuse à poils d’animaux	Jinke	/
Solution de bétadine	Lircon	6303030036
Buprénorphine (analgésique)	RWD Life Science	/
Pince à iris incurvée	jinke	/
Coussin chauffant électronique	Reptizoo	AHM23
pince fine droite	Jinke	/
Cartouche de filtre à gaz	RWD Life Science	R510-31-6
Coussinets de gaze	Winner Medical	601-026576
Ciseaux à iris	Jinke	/
Isoflurane (anesthésique)  ;	RWD Life Science	R510-22-10
Machine d’anesthésie animale à sorties	multiples RWD Life Science	R550IE
Porte-aiguille	jinke	/
Pommade ophtalmique	Dechra NDC  ;	17033-211-38
Coton-tige stérile	Winner Medical	601-015213
Saline stérile	Shimen	H20066533