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Culture et cueillette monoclonales microbiennes automatisées et à haut débit à l’aide du système omique de culture de gouttelettes de microlitres à cellule unique

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DOI :

10.3791/67925

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14 mars 2025

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1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser le système omiques de culture de gouttelettes de microlitres unicellulaires (cellule MISS) pour effectuer l’isolement, la culture et la cueillette monoclonales microbiennes. La cellule MISS réalise un flux de travail intégré basé sur la technologie microfluidique des gouttelettes, qui offre une excellente monodispersité des gouttelettes, une culture parallèle élevée et une détection de la biomasse à haut débit.

Résumé

Les cultures bactériennes pures sont essentielles pour l’étude de la culturomique microbienne. Les méthodes traditionnelles basées sur des plaques solides, des plaques de puits et des microréacteurs sont entravées par des procédures lourdes et un faible débit, ce qui entrave les progrès rapides de la recherche sur la culturomique microbienne. Pour relever ces défis, nous avons réussi à développer le système omiques de culture de gouttelettes de microlitres à cellule unique (cellule Miss), une plateforme automatisée à haut débit qui utilise la technologie microfluidique des gouttelettes pour l’isolement, la culture et le criblage des monoclonaux microbiens. Ce système peut générer un grand nombre de gouttelettes unicellulaires et cultiver, cribler et collecter des colonies monoclonales en peu de temps, facilitant ainsi un processus intégré allant de l’isolement microbien à la cueillette. Dans ce protocole, nous avons démontré son application en utilisant l’isolement et la culture du microbiote intestinal humain comme exemple et avons comparé l’efficacité de l’isolement microbien, les performances de la culture monoclonale et le débit de criblage à l’aide de la méthode de culture sur plaque solide. Le flux de travail expérimental était simple et la consommation de réactifs était très faible. Par rapport aux méthodes de culture sur plaque solide, la cellule MISS pourrait cultiver une plus grande diversité d’espèces de microbiote intestinal, offrant un potentiel et une valeur significatifs pour la recherche sur la culturomique microbienne.

Introduction

La culturomique microbienne a de nombreuses applications dans la recherche sur les microbes bénéfiques dans l’industrie alimentaire, la diversité des microbes environnementaux, le dépistage de nouveaux composés antimicrobiens et le microbiome humain en relation avec la maladie 1,2,3,4. Les méthodes traditionnelles, principalement basées sur des plaques solides, des plaques de puits ou des micro-réacteurs pour obtenir et prélever des colonies monoclonales, sont faciles à utiliser mais souffrent d’un faible débit en raison de leurs multiples étapes. Cette limitation entrave des applications telles que le criblage de mutagénèse microbienne, les études de culturomique microbienne et la sélection de colonies à haut rendement, qui nécessitent toutes un criblage monoclonal approfondi.

Récemment, divers dispositifs de détection et de distribution de cellules uniques ont été conçus pour améliorer considérablement la vitesse de traitement des échantillons microbiens, tout en réduisant la main-d’œuvre et en minimisant les erreurs de manipulation manuelle5. Cependant, ces instruments ne traitent généralement que des étapes spécifiques dans le cadre des méthodes traditionnelles, nécessitant souvent une intégration poussée de l’équipement, occupant un espace important et engageant des coûts élevés. Par conséquent, il était urgent de développer une plate-forme de culture et de criblage microbiens peu coûteuse et universellement applicable pour compenser les lacunes mentionnées ci-dessus.

Dans le cadre de nos travaux précédents, nous avons développé avec succès une plateforme de criblage automatisée à haut débit, connue sous le nom de Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell, ci-après dénommée « le système Omics »)6. Cette plate-forme utilise la technologie microfluidique des gouttelettes, qui promet d’atteindre l’automatisation et l’intégration dans l’isolation, la culture et la cueillette microbiennes 7,8,9,10. Le système Omics comprend plusieurs modules clés, notamment un module d’échantillonnage, une puce microfluidique, un système de détection et de collecte de gouttelettes, permettant l’isolement, la culture, le criblage monoclonal et la collecte efficaces de cellules uniques dans la recherche en microbiologie. Nous avons déjà utilisé le système Omics pour réaliser un criblage par mutagénèse à haut débit de Corynebacterium glutamicum6.

En raison de l’automatisation et des capacités de criblage à haut débit du système omique, son application à la culturomique microbienne devrait permettre d’obtenir rapidement une grande quantité de données microbiennes. Dans ce protocole, nous avons introduit la procédure opérationnelle détaillée de la cellule MESL, avec l’isolement et la culture du microbiote intestinal humain comme exemple pour démontrer le processus d’isolement, de culture, de détection monoclonale et de criblage de cellules uniques microbiennes. Le fonctionnement du système Omics est simple, et les chercheurs n’ont qu’à suivre les instructions du logiciel pour l’installation séquentielle des microtubes et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes, le réglage des paramètres et la préparation des échantillons.

Dans l’interface de fonctionnement du logiciel, le système Omics est divisé en trois fonctions principales : l’isolation, la culture et le dépistage. Les chercheurs peuvent sélectionner différentes étapes en fonction de l’expérience. De plus, lors de l’étape de criblage des gouttelettes, les chercheurs peuvent choisir entre deux modes de détection : le signal fluorescent ou la densité optique. Le logiciel permet de visualiser en temps réel le processus de dépistage des gouttelettes. Enfin, les chercheurs ont la possibilité de configurer des paramètres tels que les conditions de culture, la longueur d’onde détectée et le nombre de puits de collecte en fonction de leurs demandes expérimentales spécifiques, et ils peuvent mettre l’instrument en pause à tout moment pour effectuer d’autres opérations. La cellule MISS est une plate-forme de criblage monoclonal à haut débit, respectueuse des microbes, avec un fonctionnement simple et une consommation minimale de réactifs.

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Protocole

Toutes les procédures d’étude sont conformes à toutes les réglementations éthiques en vigueur. Les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique des sciences et des technologies de l’Université Tsinghua. Pour l’étude du microbiote intestinal humain, des échantillons de selles ont été prélevés chez un adulte en bonne santé sans condition médicale importante, qui a donné un consentement éclairé écrit.

1. Installation de l’instrument

  1. Placez l’instrument du système Omics dans un environnement propre ou stérile (comme une salle stérile ou un banc anaérobie). L’instrument est un appareil de précision, et lorsque vous le placez dans l’installation, tenez compte de ce qui suit :
    1. Maintenez l’instrument à une pression et une température normales.
    2. Gardez l’instrument à l’écart des champs électriques puissants, des champs magnétiques et des sources de rayonnement thermique.
    3. Assurez-vous que la zone de placement de l’instrument dépasse les dimensions de 2 500 mm (P) x 1 500 mm (L) x 2 000 mm (H).
    4. Maintenez l’humidité ambiante de l’instrument en dessous de 60 %.

2. Préparatifs

  1. Mettez séquentiellement sous tension le système Omics, l’ordinateur et le logiciel d’exploitation du système Omics.
  2. Installation de micro-tubes de cellules MISS et de puces microfluidiques de génération de gouttelettes :
    1. Ouvrez la porte de la chambre de génération et de culture des gouttelettes (Figure 1A) et retirez verticalement le couvercle de protection de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes. À l’aide d’une seringue jetable, ajoutez 10 ml d’eau distillée stérile dans l’humidificateur à l’intérieur de la chambre de culture des gouttelettes (figure 1C) et réinstallez le couvercle de protection du microtube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes.
    2. Ouvrez l’emballage stérile de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes et placez-le verticalement directement au-dessus de la chambre de culture (Figure 1C).
    3. Sur l’interface du logiciel, cliquez sur Installation (Figure 2A). À ce stade, une fenêtre contextuelle s’affiche avec l’invite Confirmer le remplacement du micro-tube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes ? Cliquez sur Oui pour démarrer l’installation.
    4. Sortez l’extracteur de bulles d’air et fixez-le à l’envers sur le dissolvant d’air placé dans la chambre de génération de gouttelettes et de culture. Veillez à ne pas appuyer sur les tubes d’entrée et de sortie des gouttelettes de l’extracteur de bulles d’air (Figure 1E).
    5. Fixez le tube de sortie des gouttelettes de l’extracteur de bulles d’air à la vanne de serrage située en dessous de celui-ci et laissez-le passer à travers le trou qui est dirigé vers la chambre de détection et de collecte des gouttelettes (Figure 1B).
    6. Ouvrez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes, insérez verticalement le tube de détection, déjà connecté au tube de sortie des gouttelettes, dans la prise de détection et assurez-vous que le tube de détection est complètement inséré (Figure 1D).
      REMARQUE : Lors de l’insertion du tube de détection, insérez-le verticalement sans aucun coude sur le tube.
    7. Serrez la vis qui fixe le tube de détection dans le sens des aiguilles d’une montre. Après avoir vérifié que le tube de détection est complètement inséré et sécurisé, fermez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes.
    8. À partir de la puce microfluidique de génération de micro-tubes et de gouttelettes, il existe 10 tubes en silicone, chacun étiqueté avec un numéro (L01-L10). Connectez chaque tube étiqueté à la vanne de serrage numérotée correspondante (01-10) (Figure 1C).
    9. Connectez le connecteur rapide du micro-tube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes au port correspondant sur le système Omics : C1 à O1, C2 à O2, C4 à O4 et CF à OF.
      REMARQUE : L’installation du micro-tube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes est terminée. C3 n’a pas besoin d’être connecté à O3.
    10. Une fois l’installation de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes terminée, une fenêtre contextuelle s’affiche et indique que la vanne de serrage du tube de gouttelettes est ouverte. Cliquez sur OK lorsque l’installation de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes est terminée. Après vous être assuré que tous les tubes en silicone du micro-tube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes sont fixés à la vanne de serrage correspondante, cliquez sur OK.
  3. Initialisation de l’instrument
    1. Avant d’effectuer l’initialisation, cliquez sur l’interface de réglage (Figure 2B) pour configurer les paramètres pertinents : mode de détection (détection basée sur OD ou par fluorescence ; CO ici), la température d’incubation (37 °C) et le temps (30 jours = 720 h), la vitesse de l’agitateur (20 tr/min), la longueur d’onde de détection de la DO (600 nm) et la longueur d’onde d’excitation et d’émission de la détection de fluorescence.
      REMARQUE : Les paramètres utilisés pour l’isolement et la culture du microbiote intestinal humain dans ce protocole sont indiqués entre parenthèses. Lors du réglage des paramètres, la température de culture doit être comprise entre 5 °C et 50 °C. Lors de la sélection du mode de détection, la fibre optique doit être remplacée si la fibre du module de détection de gouttelettes n’est pas la même (voir étape 2.3.2). Lors de la configuration des paramètres, la valeur de référence de la phase huileuse (spectrale de base) est automatiquement identifiée par le logiciel, ce qui élimine le besoin de réglages manuels.
    2. Le remplacement de la fibre optique détectée
      1. Retirez la fibre détectée du support de fibre (dévissez la vis dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) et desserrez la vis de fixation de la fibre sur le module de gouttelettes (Figure 1D).
      2. Si la fibre optique ne sera pas utilisée, retirez-la du module, insérez-la dans le support de fibre et serrez-la. Insérez la fibre détectée dans le port de détection et serrez la vis de fixation de la fibre sur le module. Le remplacement de la fibre optique est terminé.
    3. Tournez-vous vers l’interface d’accueil et cliquez sur Initialiser pour laisser le système Omics effectuer une auto-vérification de ses composants, y compris la pompe d’injection, les paramètres de température, le test de décharge des déchets liquides, le module de dépistage et le module de détection de gouttelettes.
      1. Lors de l’initialisation, effectuez un test de décharge des déchets liquides à partir du module de détection des gouttelettes en injectant 1 mL d’alcool à 75 % dans l’orifice des déchets liquides et en observant si le liquide s’écoule normalement.
      2. Pour le test du module de criblage, placez une plaque à 96 puits sur le placement de la plaque et observez si le mouvement de la plaque est normal.

3. Génération de gouttelettes

  1. Collecte et traitement d’échantillons de microbiote intestinal humain
    1. Préparez un pot de chambre et des récipients pour les selles, lavez-vous les mains et portez des gants pour prélever des échantillons de selles fraîches.
      REMARQUE : Lorsque vous prélevez des échantillons de selles, évitez autant que possible la contamination de l’urine. Il est préférable d’uriner au préalable et de placer les selles dans un récipient propre et sec.
    2. Prélever de manière aseptique la quantité appropriée de selles du segment médian et les sceller dans des flacons cryogéniques stérilisés (environ 3 à 5 g par flacon). Placez immédiatement les flacons sur de la glace pour l’aliquotage et l’étiquetage.
      REMARQUE : Si l’échantillon de selles est volumineux ou ne peut pas être prélevé immédiatement, il doit être prélevé dans les 2 heures au maximum.
    3. Dans la paillasse anaérobie, utilisez un écouvillon stérile ou un outil de prélèvement de selles pour prélever un échantillon du segment médian.
      REMARQUE : La couche superficielle des selles contient des cellules de la muqueuse intestinale éliminées et est sujette à la contamination externe ; après l’exposition à l’air, une partie de l’ADN microbien commence à se dégrader.
    4. Transvaser les échantillons de selles prélevés dans des tubes de microcentrifugation stériles de 2 mL ou des cryoflacons stériles, chaque tube contenant de 0,5 à 2,0 g de selles. Préparez deux aliquotes pour la congélation par échantillon.
    5. Remettre en suspension l’échantillon de selles fraîches dans une solution saline physiologique stérile, avec chaque 100 mg de selles dilué dans 1 mL de solution. Mélangez soigneusement les selles jusqu’à ce qu’aucune grosse particule ne soit visible.
    6. Après une sédimentation naturelle de 10 min, filtrez séquentiellement le surnageant à travers des filtres à mailles stériles avec des pores de 200 mailles (0,075 mm), 400 mailles (0,038 mm) et 800 mailles (0,018 mm) pour éliminer les aliments non digérés et les particules plus petites. Enfin, collectez le filtrat dans des tubes à centrifuger stériles.
    7. Prélever 10 μL de suspension fécale filtrée et déterminer la concentration microbienne à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope à fluorescence inversée.
      REMARQUE : Après avoir filtré le surnageant de l’échantillon fécal à travers différentes tailles de mailles, il reste des particules fécales plus petites. Par conséquent, lors de la détermination de la concentration microbienne, les particules actives observées au microscope sont considérées comme des micro-organismes, ce qui ne permet qu’un calcul approximatif de la concentration microbienne.
    8. Transférez la suspension fécale dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 mL et étiquetez-le avec la date, la concentration microbienne et le nom de l’échantillon. Réservez-en une partie pour les expériences ultérieures et conservez le reste à 4 °C pour une utilisation future.
      REMARQUE : Consigner rapidement les renseignements sur l’échantillon (nom de l’échantillon, heure de prélèvement) pour s’assurer que les échantillons sont prélevés en même temps (compte tenu des changements du rythme temporel microbien intestinal des mammifères). L’ensemble de la collecte et du traitement des échantillons doit être effectué dans un environnement anaérobie.
  2. Préparation à la suspension fécale initiale
    1. Préparez le milieu du bouillon cerveau-cœur (BHI) selon le protocole du fabricant et stérilisez-le en autoclave à 121 °C pendant 15 min.
    2. Prendre la suspension fécale de l’étape 3.1.8 et effectuer des dilutions en série avec un milieu BHI pour obtenir une concentration de ~50 cellules/mL.
      REMARQUE : Pour remplir le flacon d’échantillon, préparez au moins 40 ml de suspension fécale.
    3. En vous assurant qu’une petite barre d’agitation magnétique se trouve au fond, versez la suspension fécale diluée dans le flacon d’échantillon jusqu’à la position d’ajout de l’échantillon. Vissez le capuchon et serrez-le. Ensuite, insérez le connecteur rapide A dans le connecteur rapide B pour terminer le processus de chargement de l’échantillon (Figure 3A).
    4. Placez le flacon d’échantillon dans la position désignée et séparez les raccords rapides A et B du flacon d’échantillon. Connectez le connecteur rapide A de la bouteille d’échantillon à l’orifice O3 du système Omics, et le connecteur C3 de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes se connecte au connecteur rapide B. Fermez la porte de la chambre de génération de gouttelettes et de culture (Figure 3B).
  3. Génération de gouttelettes
    1. Sélectionnez le nombre de tubes de gouttelettes à générer sur l’interface d’accueil du logiciel (Figure 2A).
      REMARQUE : Chaque cycle peut produire jusqu’à 10 tubes de gouttelettes, chaque tube générant environ 5 000 gouttelettes.
    2. Cliquez sur Produire dans l’interface d’accueil du logiciel pour démarrer la génération de gouttelettes à cellule unique.
      REMARQUE : Confirmez si le refoulement de la pompe de vidange de liquide fonctionne ou non. Au cours de la génération de gouttelettes, chaque gouttelette a un volume de 2,0 μL. Voir la section de discussion pour une description de la génération de gouttelettes.
    3. Attendez que l’alarme sonore indique que la génération des gouttelettes est terminée. Fermez la pince du connecteur C3 (Figure 1E) et retirez le flacon d’échantillon.

4. Culture de gouttelettes

  1. Sélectionnez le même numéro de tube de gouttelettes que lors de la génération des gouttelettes sur l’interface d’accueil du logiciel, cliquez sur Culture, confirmez le temps et la température de culture et commencez le processus. Surveillez la barre de progression sur l’interface d’accueil qui indique la progression de la culture et le temps restant.
  2. Attendez que l’alarme sonore indique que la culture des gouttelettes est terminée. Si le temps de culture doit être prolongé, ajustez le temps directement sur l’interface de réglage .

5. Criblage de gouttelettes

  1. Appuyez sur le bouton UV du système Omics pour allumer la lumière ultraviolette (UV) (Figure 1A), irradier la chambre de détection et de collecte des gouttelettes pendant 30 min, puis éteindre la lumière UV.
    REMARQUE : Avant d’allumer la lumière UV, assurez-vous que la porte de détection des gouttelettes et la chambre de collecte sont fermées.
  2. Dans un banc super propre, ouvrez toutes les plaques à 96 puits utilisées pour recueillir les gouttelettes et empilez-les les unes sur les autres sans couvercles, en les numérotant séquentiellement de bas en haut. Assurez-vous que la plaque supérieure est recouverte d’un couvercle.
    REMARQUE : Chaque cycle peut accueillir jusqu’à dix plaques de 96 puits, et le nombre de plaques dépend du nombre total de gouttelettes.
  3. Ouvrez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes, placez les plaques de puits dans les positions désignées (Figure 1D), retirez le couvercle de la plaque de puits supérieure et fermez la porte de la chambre.
  4. Allumez la lumière UV du système Omics pendant 30 minutes pour effectuer la stérilisation secondaire.
  5. Installation de l’extracteur de bulles d’air
    1. Retirez l’extracteur de bulles d’air de sa position de placement, dévissez le capuchon et retirez la vis en forme de papillon du capuchon (Figure 3C).
    2. Versez 200 ml d’huile d’élimination des bulles d’air dans l’extracteur de bulles d’air, vissez fermement la bouteille avec le bouchon de l’extracteur de bulles d’air sur le système Omics, puis fixez le dissolvant à l’envers sur l’emplacement de l’extracteur de bulles d’air. L’installation de l’extracteur de bulles d’air est terminée.
      REMARQUE : Lors de la fixation du dissolvant de bulles d’air sur le placement, assurez-vous qu’aucune fuite d’huile ne s’échappe. En cas de fuite, serrez le couvercle.
  6. Sélectionnez le tube de gouttelettes à trier sur l’interface d’accueil , cliquez sur Tri, entrez le nombre de plaques de puits à collecter, puis démarrez le processus. Une fois le criblage des gouttelettes commencé, observez la zone d’affichage du processus, qui montre les mesures en temps réel de la densité optique des gouttelettes (DO) ou des valeurs de fluorescence.
  7. Analysez environ 20 à 30 gouttelettes pour vérifier la valeur OD. Par exemple, si la majorité d’entre eux ont une valeur de DO de ~0,2, ce qui correspond à la valeur de DO des gouttelettes vides, sur la base de la distribution de Poisson, définissez le seuil de DO inférieur à 0,5 et le seuil de DO supérieur à 4,0. Les gouttelettes à l’intérieur de cette plage seront automatiquement collectées en plaques de 96 puits (Figure 4A).
    REMARQUE : Selon la loi de Beer-Lambert, la valeur de DO des gouttelettes vides est déterminée par la composition du milieu de culture à l’intérieur des gouttelettes. En règle générale, le seuil de DO inférieur est supérieur de 0,2 à 0,3 unité à la valeur de DO des gouttelettes vides afin d’assurer une distinction claire entre les gouttelettes vides et les gouttelettes contenant des micro-organismes.
  8. Attendez que l’alarme sonore indique que le dépistage et la collecte des gouttelettes sont terminés. Ouvrez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes, placez le couvercle de la plaque de puits sur la plaque de puits supérieure, puis sortez toutes les plaques de puits de la chambre ensemble pour effectuer le séquençage et la sauvegarde ultérieurs.

6. Exportation des données et affichage des cartes thermiques

  1. Cliquez sur Exporter les données pour enregistrer les données de signal de gouttelettes collectées (Figure 4A,B).
  2. Cliquez sur Carte thermique, sélectionnez le fichier de données de collecte des gouttelettes et observez les valeurs de DO des gouttelettes collectées dans la microplaque affichée par le logiciel. Visualisez ces valeurs de DO sous la forme d’une carte thermique, où l’intensité de la couleur correspond à la distribution de DO dans les puits, fournissant une représentation claire et intuitive des valeurs de DO monoclonales collectées (Figure 4A,C).

7. Nettoyage de la cellule MISS

  1. Une fois l’expérience terminée, sélectionnez le tube de gouttelettes à nettoyer, puis cliquez sur Nettoyer pour commencer le nettoyage de l’instrument.

8. Sauvegarde monoclonale microbienne et préparation de l’échantillon de séquençage

  1. Séquençage de la préparation des échantillons
    1. Dans la paillasse anaérobie, ajoutez 100 μL de milieu BHI dans chaque puits de la plaque de gouttelettes collectée, mélangez bien par pipetage, puis prélevez 10 μL de chaque puits et transférez le tout dans un tube stérile de 15 mL. Vortex pour obtenir une suspension microbienne mixte.
    2. Ajouter 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate dans la suspension microbienne mixte, centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min, retirer le surnageant et placer la pastille microbienne dans de l’azote liquide pour une congélation rapide. La préparation de l’échantillon de séquençage est terminée.
    3. Utilisez des méthodes de séquençage d’amplicon d’ADNr 16S ciblant le domaine V3 et V4 de l’ADNr 16S. Les amorces de séquençage spécifiques utilisées sont les suivantes : 341F : ACTCCTACGGGAGGCAGCA et 806R : GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. Cryoconservation d’échantillons monoclonaux microbiens :
    1. Après avoir prélevé 10 μL de l’échantillon de chaque puits dans les plaques de gouttelettes (à l’étape 8.1.1), ajoutez 30 μL de glycérol dans chaque puits. Placez les plaques à une température inférieure à -80 °C pour préserver les souches microbiennes.

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Résultats

On estime que le microbiote intestinal humain, qui constitue la communauté microbienne prédominante, abrite environ 4 ×10 13 micro-organismes dans l’intestin, ce qui met en évidence son grand nombre et sa composition complexe11. Dans cette étude, nous avons cherché à isoler et à cultiver le microbiote intestinal et avons utilisé la méthode de la plaque solide comme contrôle pour démontrer les performances à haut débit de la cellule MISS.

Tout d’abord, nous av...

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Discussion

Ce protocole décrit le fonctionnement de la cellule MISS pour l’isolement, la culture, la détection et la collecte monoclonaux microbiens automatisés et à haut débit. Par rapport aux méthodes traditionnelles par lesquelles seulement ~20 à 30 % du microbiote intestinal pouvait être isolé et cultivé 2,12, le nombre de clones monoclonaux obtenus à l’aide du système omiques était 1,97 fois plus élevé que ceux obtenus à partir de plaq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par les projets de recherche et développement dans des zones clés de la province du Guangdong (2024B1111130002), les projets de recherche et développement de la province du Hebei (22375503D) et le projet d’ouverture du laboratoire d’ingénierie de l’Anhui pour la sélection moléculaire de microbiologie industrielle (subvention ELMB-07).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri 100 mmMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneP5731-500EAPour la préparation de plaques solides
30 mL Stool ContainersBoen Healthcare Co., Ltd611101Pour la collecte des échantillons de selles
37 ° ; C incubateur à température constanteShanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150Cultiver la plaque solide dans l’incubateur
Polystyrène transparent à fond plat 96 puits Microplaques traitées TCCorning3599Pour la détection du mouvement des plaques de puits et la collecte des gouttelettes
AgarBecton, Dickinson and Company214010Pour la préparation des plaques solides
Huile d’élimination des bulles d’airLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oilL’huile dans le dissolvant de bulles d’air lors du dépistage des gouttelettes
Dissolvant de bulles d’airLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-SExclure la phase gazeuse entre les gouttelettes avant d’effectuer la détection et la collecte des gouttelettes
Banc anaérobie Argonet azote Équipement spatial Département commercial, ville de Haiyu, ville de ChangshuVGB-4CM  ;Pour le fonctionnement aseptique et la stérilisation UV dans des conditions anaérobies
AutoclavePuhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.MLS-830LPour l’autoclave du milieu BHI, du tube EP, etc.
Bouillon d’infusion cerveau-cœur (BHI) Parcindustriel de haute technologie de Qingdao Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1Composants du BHI medium
La liste des ingrédients :
38,5 g/L BHI Bouillon dans de l’eau distillée
Cell SpreaderMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneHS8151Inoculer la solution microbienne sur la plaque solide
Tube à centrifuger, 15 mLBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397Pour la préparation de solutions microbiennes
OrdinateurLenovoE450Installation de logiciels et contrôle de cellules MISS
CryovialThermo Fisher2.0 mLPour la conservation des selles
Eau distilléeBeijing Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100mlAjouter dans l’humidificateur pour maintenir l’humidité dans la chambre de culture des gouttelettes
Tube EP ThermoFisher2.0 mLPour le prélèvement des échantillons de selles
Microscope inversé fluorescentOlympus Life Science (LS)CKX53Vérifiez et calculez la concentration microbienne
GlycérolGENERAL-REAGENTG66258APour la conservation
des souchesHémocytomètreAcmecAYA0810-1eaCalculer la concentration microbienne
KClAmbeedA442876Composants d’une solution saline tamponnée au phosphate (solution PBS)La liste des ingrédients : 8 g/L de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO<>4, 0,24 g de KH2PO4 dans de l’eau distillée
KH2PO4MACKLINP815661Composants d’une solution saline tamponnée au phosphate (solution PBS)La liste des ingrédients : 8 g/L de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 dans de l’eau distillée
Filtre à maillesAnping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd200 mailles (0,075 mm), 400 mailles (0,038 mm), 800 mailles (0,018 mm)Retirez les aliments non digérés et les petites particules des échantillons de selles
Puce microfluidique de génération de micro-tubes et de gouttelettesLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2Pour la génération de gouttelettes et l’incubation de gouttelettes
Huile cellulaire MISSLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-BOS-BLa phase huileuse pour la microfluidique en gouttelettes
Logiciel de cellule MISSLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.Cellule MISS V3.2.4Effectuer des opérations expérimentales sur l’instrument de la cellule MISS
Na2HPO4SolarbioD7292Composants de la solution saline tamponnée au phosphate (solution PBS)La liste des ingrédients : 8 g/L de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO<>4, 0,24 g de KH2PO4 dans de l’eau distillée
NaClGÉNÉRAL-RÉACTIFG81793JComposants de la solution saline physiologique
La liste des ingrédients :
9 g/L de NaCl dans de l’eau distillée
Pipetteeppendorf2.5 &mu ; L, 10 &mu ; L, 100&mu ; L, 1000&mu ; LPour la manipulation de liquides
Tube en polytétrafluoroéthylèneShenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.3401000141Pour l’incubation des gouttelettes. Ce matériau était déjà inclus dans la puce microfluidique de génération de micro-tubes et de gouttelettes
Bouteille d’échantillonLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.Flacon cellulaire MISSÉchantillonnage d’une solution microbienne
Système omique de culture de gouttelettes d’un microlitre (cellule MISS)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3fRéalisation de l’isolement, de la culture, de la détection et de la collecte monoclonales microbiennes
CentrifugeuseSuperspeed Thermo FisherSorvall Lynx 4000  ;Préparer la solution microbienne pour le séquençage
SeringueJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 mLPrélevez l’eau distillée et injectez-la dans l’humidificateur dans la chambre de culture de gouttelettes
Réfrigérateur à ultra basse températureSANYO Ultra-low  ;MDF-U4086S  ;Pour la conservation de la souche (-80 ° ; C)
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Références

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

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Culturomique microbiennemicrofluidique en gouttelettesisolement monoclonalcriblage haut d bitmicrobiote intestinalgouttelettes cellule uniqueculture automatis ediversit microbiennecomparaison avec plaques solidesd tection par densit optique

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