Article de méthode

Prédiction et validation de la régulation des lésions podocytaires et traitement de l’insuffisance rénale diabétique par Yinhuo Tang

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DOI :

10.3791/67939

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20 juin 2025

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

À l’aide de la pharmacologie en réseau et de la validation expérimentale, ce protocole révèle le mécanisme d’action de Yinhuo Tang (YHT) dans le traitement de la maladie rénale diabétique (DKD) et comment YHT réduit les dommages aux podocytes chez les souris DKD grâce à l’inhibition de la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB.

Résumé

La néphropathie diabétique (MRD) est une maladie rénale chronique caractérisée par une protéinurie massive et une diminution du débit de filtration glomérulaire. La principale caractéristique pathologique de la DKD est la microangiopathie rénale, et ~40 % des patients diabétiques développeront une DKD. Les protéines CD2AP et WT-1 associées aux podocytes jouent un rôle crucial dans le maintien du fonctionnement normal des podocytes et de l’intégrité de la barrière de filtration glomérulaire. Lorsque la structure ou la fonction des podocytes est perturbée en raison d’une inflammation, d’un stress oxydatif ou d’autres agressions pathologiques, le diaphragme fendu et le cytosquelette d’actine sont endommagés, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la barrière de filtration glomérulaire et une protéinurie. Yinhuo Tang (YHT) est une prescription de médecine traditionnelle chinoise qui a pour fonction de réduire la protéinurie et de retarder la détérioration de la fonction rénale ; cependant, le mécanisme de la YHT dans le traitement de la DKD n’est pas clair. Dans cet article, basé sur la pharmacologie en réseau et des expériences sur des animaux, nous avons examiné la glycémie, la fonction hépatique, la fonction rénale, les lipides sanguins, la pathologie rénale, les niveaux d’expression des protéines marqueurs de podocytes CD2AP et WT-1, ainsi que la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB chez des souris db/db après l’administration de YHT pendant 8 semaines. Nos résultats montrent que YHT réduit les niveaux d’expression des facteurs inflammatoires en inhibant la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB, réduisant ainsi les dommages aux podocytes pour jouer un rôle dans le retard de la progression de la DKD.

Introduction

La néphropathie diabétique (MRD) est une complication fréquente et grave du diabète, et elle reste la principale cause d’insuffisance rénale terminale dans le monde1. La maladie progresse par une série de processus pathologiques complexes, tels que l’hypertrophie glomérulaire, l’expansion mésangiale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’accumulation excessive de composants de la matrice extracellulaire 2,3. Malgré les améliorations apportées à la gestion du diabète, les thérapies actuelles visent principalement à contrôler la glycémie et la pression artérielle, ce qui ne fait que ralentir la progression de la DKD plutôt que d’inverser ses changements pathologiques sous-jacents. Cela souligne le besoin pressant d’options de traitement plus complètes et plus efficaces 4,5.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est apparue comme une thérapie alternative prometteuse dans le traitement des maladies chroniques telles que la DKD 6,7,8. La MTC met l’accent sur une approche de traitement holistique, qui peut aborder la nature complexe et multicible de la DKD. Parmi les différentes formulations de MTC, il a été démontré que le Yinhuo Tang (YHT) possède de multiples fonctions physiologiques, telles que nourrir le yin (pour compléter le volume sanguin), tonifier le rein (pour améliorer la fonction rénale), évacuer la chaleur (pour supprimer l’inflammation) et maîtriser le yang (pour abaisser la tension artérielle)9,10,11. Cependant, une compréhension complète des mécanismes par lesquels YHT atténue la DKD fait toujours défaut.

La protéine CD2AP liée aux podocytes est une protéine clé du podocyte, cruciale pour le maintien de l’intégrité de la barrière de filtration, tandis que WT-1 joue un rôle essentiel dans le développement rénal et la fibrose 12,13,14,15,16. Par conséquent, le fonctionnement normal de ces deux protéines est vital pour le fonctionnement normal de la filtration glomérulaire. La littérature existante suggère que ces cibles sont impliquées dans la progression de la DKD, et nous émettons l’hypothèse que les composants actifs de YHT peuvent interagir avec ces cibles pour exercer des effets thérapeutiques. Cette étude vise à confirmer ces interactions et à fournir des informations plus approfondies sur la façon dont YHT module les voies pathologiques de la DKD.

Dans cette étude, nous utilisons une combinaison de pharmacologie en réseau et d’expériences sur des animaux pour explorer les mécanismes thérapeutiques de la YHT dans la DKD. La pharmacologie en réseau, qui intègre des outils bioinformatiques pour analyser les interactions complexes entre les composés actifs et les cibles biologiques, nous permet d’explorer la nature multi-cibles et multi-voies de l’action de YHT 17,18,19. Les méthodes traditionnelles de découverte de médicaments mettent souvent l’accent sur les interventions à cible unique. En revanche, la pharmacologie en réseau sert d’outil prédictif qui aide à identifier les voies potentielles et les cibles moléculaires, offrant des informations préliminaires sur les mécanismes d’action possibles des thérapies complexes. Bien qu’elle ne remplace pas les étapes expérimentales et réglementaires rigoureuses requises pour le développement de médicaments, la pharmacologie en réseau peut guider la génération d’hypothèses et rationaliser la recherche à un stade précoce20.

En fin de compte, cette étude vise à combler le fossé entre la médecine traditionnelle et la médecine moderne, en fournissant des preuves scientifiques de l’intégration de la MTC dans le traitement de la DKD. Les résultats de cette recherche pourraient aider à développer des stratégies de traitement plus efficaces et plus sûres pour la DKD, offrant une alternative aux soins standard qui sont souvent limités par les effets secondaires. En élucidant les mécanismes moléculaires de la YHT et en validant son potentiel thérapeutique, nous espérons démontrer la large applicabilité de la MTC dans le traitement de la DKD.

Protocole

Au total, trente souris mâles spontanées de 6 semaines atteintes de diabète de type II (C57BL/Ksj db/db) et six souris mâles non diabétiques (db/m) ayant le même patrimoine génétique ont été sélectionnées pour cette étude. Les souris ont été hébergées pendant 2 semaines dans un environnement stérile de qualité SPF au Centre d’expérimentation animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Changchun (numéro de licence : SYXK (JI) 2023-0014). Pendant cette période, ils ont reçu un régime d’entretien régulier et de l’eau stérile. La glycémie à jeun a été mesurée chez les souris db/db au début et à la fin de la période de 2 semaines, et seules celles dont les résultats dépassaient 11,1 mmol/L dans les deux tests ont été incluses dans l’expérience. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Changchun (numéro d’identification : 2024147).

1. Préparation du médicament

  1. Préparation de l’YHT (tableau 1)
    1. Sélectionnez Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) et Schisandra chinensis (6 g), et rincez les herbes à l’eau pour éliminer les impuretés et la poussière de la surface. Ensuite, mélangez 71 g d’herbes crues avec 710 ml d’eau distillée et faites tremper dans des pots en céramique pendant 60 min
    2. Après ébullition à 100 °C, abaissez la température de la décoction à 80 °C pendant 60 minutes, puis filtrez la lie à travers deux couches de gaze médicale. Conservez le liquide au réfrigérateur à 4 °C.
    3. Ajouter 710 ml d’eau distillée à la lie ci-dessus et répéter le trempage à partir des étapes 1.1.1 et 1.1.2 une fois ; Conservez le liquide au réfrigérateur à 4 °C.
    4. Mélangez les deux liquides médicinaux ci-dessus des étapes 1.1.2 et 1.1.3 et placez-les dans le bac à matériaux du lyophilisateur sous vide. Démarrez la pompe à vide pour évacuer l’air de la chambre de lyophilisation, réglez la température à -40 °C et maintenez-la pendant 6 h pour geler l’eau de la solution médicamenteuse à l’état solide. Ensuite, ajustez la température à -20 °C pendant 36 h pour sublimer l’eau sous forme de cristaux de glace en gaz. Enfin, réglez la température à 40 °C, maintenez-la pendant 24 h pour éliminer l’humidité restante de la solution médicamenteuse, éteignez la pompe de chauffage et à vide et retirez la poudre lyophilisée (poudre YHT).
    5. Peser 0,4615 g, 0,923 g et 1,846 g de poudre lyophilisée de YHT, mettre en suspension dans 1 mL de solution saline et faire la suspension de YHT à des concentrations de 0,4615 g/mL, 0,923 g/mL et 1,846 g/mL, respectivement.
  2. Préparation du valsartan
    1. Ajouter le valsartan (10,29 mg) dans 50 mL de PEG300 et bien agiter pour le dissoudre complètement.
    2. Ajouter 50 mL de solution saline à la solution de l’étape 1.2.1 et bien agiter pour homogénéiser et obtenir une solution de valsartan avec une concentration de 10,29 mg/mL.

2. Traitements médicamenteux

REMARQUE : L’expérience a été divisée en six groupes : le groupe témoin normal (CON), le groupe modèle (MOD), le groupe témoin positif au valsartan (POS), le groupe à faible dose du YHT (YH-L), le groupe à dose moyenne du YHT (YH-M) et le groupe à forte dose du YHT (YH-H). Les humains adultes ont besoin de 71 g de YHT par jour. Selon la formule de conversion de la dose expérimentale de médicament chez la souris et chez l’homme, la dose quotidienne pour la souris était de ~9,23 g/kg :

Dose expérimentale équivalente pour la souris (g/kg) = dose humaine (g)/poids corporel (70 kg) × 9,1

  1. Saisissez fermement le dos des souris avec la main non dominante de manière à ce que leur tête, leur cou et leur corps soient en ligne droite (pour éviter de se débattre) et positionnez l’aiguille de gavage de 1 ml de manière appropriée à un angle similaire à la courbure physiologique de l’œsophage des souris. Poussez l’aiguille de gavage dans le coin de la bouche des souris, appuyez dessus sur la langue, pressez-la contre le palais et poussez-la doucement vers l’intérieur de l’estomac.
  2. Enfoncez lentement le médicament à l’aide de l’index de la main dominante et retirez l’aiguille verticalement pour terminer l’opération de gavage.
    REMARQUE : La dose du médicament était de 10 mL/kg pendant un total de 4 semaines.
    1. Administrer 10 ml∙kg-1∙jour-1 solution saline par gavage à des souris CON et MOD.
    2. Administrer 10,29 mg∙kg-1∙jour-1 suspension de valsartan par gavage aux souris du groupe POS.
    3. Administrer les doses suivantes du YHT par gavage à ces groupes : 4,615 g∙kg-1∙jour-1 au groupe YH-L ; 9,23 g∙kg-1∙jour-1 pour le groupe YH-M ; 18,46 g∙kg-1∙jour-1 pour le groupe YH-H.

3. Évaluation de l’efficacité de YHT

  1. Détection des indices biochimiques sanguins et urinaires
    1. Après 8 semaines d’administration continue du médicament, prélever 24 heures d’urine de souris à l’aide d’une cage métabolique, centrifuger l’urine recueillie à 7 992 × g pendant 10 minutes, retirer le surnageant et mesurer le taux de protéines urinaires à l’aide du kit de test de protéines urinaires.
    2. Saisissez le dos de la souris avec la main non dominante pour fixer la souris et utilisez l’auriculaire et l’annulaire de la même main non dominante pour fixer la queue de la souris. Stérilisez le bout de la queue de la souris avec des boules de coton à la vapeur d’iode. Avec la main dominante, tenez une aiguille de prélèvement sanguin pour percer rapidement le bout de la queue de la souris, pressez de la racine de la queue de la souris jusqu’au bout de la queue et déposez le sang sur le papier de test de glycémie.
    3. À l’aide de la main non dominante, saisissez la queue de la souris, tout en sécurisant la zone scapulaire avec le pouce et l’index, en vous assurant que l’abdomen de la souris est tourné vers le haut. Avec la main dominante, tenez une seringue de 1 mL remplie de phénobarbital sodique. Insérez l’aiguille (3 à 5 mm de profondeur) dans la cavité abdominale à un angle de 30 à 45°, en ciblant la région entre le nombril et les membres postérieurs, avec l’aiguille dirigée vers la tête. Retirez lentement le piston de la seringue pour vérifier s’il y a du sang ; Si du sang est aspiré, repositionnez l’aiguille en conséquence.
    4. Injectez lentement la solution de pentobarbital sodique pour assurer une administration uniforme, puis retirez la seringue une fois l’injection terminée. Attendez 10 min, puis avec une pince dans la main dominante, pincez doucement les orteils de l’arrière de la souris pour vérifier s’il y a une réponse. Si une réponse est toujours observée, administrer une petite dose supplémentaire (10 mg/kg) au besoin.
      REMARQUE : En supposant qu’une souris pèse 60 g et que la solution de phénobarbital est à 1 % p/v, 0,06 mL est la dose supplémentaire à administrer en cas de réponse.
    5. Utilisez des ciseaux pour couper les moustaches et les poils autour des yeux des souris, en utilisant la main non dominante pour appuyer sur la peau autour des yeux dont les globes oculaires doivent être retirés afin que les globes oculaires dépassent. Stérilisez la peau autour des globes oculaires avec de l’éthanol, utilisez une pince à épiler pour retirer rapidement les globes oculaires afin que le sang s’écoule dans les tubes de la microcentrifugeuse (1,5 à 2 ml), incubez les tubes à température ambiante pendant 10 min, centrifugez les tubes pendant 10 min à 7 992 × g et extrayez la solution surnageante.
    6. Mesurez les niveaux d’expression de la créatinine sérique (Scr), de l’azote uréique du sang (BUN), de l’albumine (ALB), de l’alanine aminotransférase (ALT), de l’aspartate aminotransférase (AST), des triglycérides (TG) et du cholestérol total (TC) dans le sérum selon les instructions du kit.
  2. Séparation des tissus rénaux
    1. Après le prélèvement sanguin, fixez les souris sur la plaque chirurgicale en position couchée, coupez les poils de la région thoracique antérieure des souris, stérilisez la région thoracique antérieure à l’éthanol, coupez la peau abdominale avec des ciseaux et écartez l’intestin grêle et le gros intestin pour exposer les reins.
    2. Retirez le tissu rénal de la souris, utilisez une pince hémostatique pour séparer brutalement le périoste et placez le rein gauche dans un congélateur à -80 °C pour le stockage et le rein droit dans un tube de 20 ml contenant une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixer le rein.
    3. Retirez les reins droits du formaldéhyde après 24 h, rincez brièvement à l’eau distillée pendant 5 min, déshydratez à l’aide d’un gradient d’éthanol anhydre (100 % → 95 % → 85 % → 75 %, 5 min chacun), transparentisez à l’aide de xylène dégradé (2 x 10 min), incorporez-le dans de la cire de paraffine et laissez les blocs de cire se solidifier à température ambiante21. Ensuite, mettez-le au congélateur à -20 °C pendant la nuit.
    4. Retirez le bloc de cire, coupez-le en tranches sur une épaisseur de 3 μm, placez-le dans l’eau pour le déplier, puis pêchez-le à l’aide d’une lame, et placez-le dans un four à température constante à 40 °C pour cuire pendant 30 min puis stockez-le pour une analyse ultérieure
  3. Analyse histopathologique rénale
    1. Retirez le rein droit, effectuez un déparaffinage au xylène dégradé et une déshydratation à l’éthanol anhydre comme ci-dessus (étape 3.2.3) et lavez à l’eau distillée.
    2. Effectuez la coloration selon les instructions des kits de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), de coloration périodique à l’acide-Schiff (PAS) et de masson.
    3. Effectuez à nouveau la déshydratation à l’éthanol anhydre par gradient et la transparence du xylène comme à l’étape 3.2.3.
    4. Après séchage à température ambiante, montez les sections de tissu sur les lames à l’aide d’une lamelle en utilisant de la gomme neutre comme support de montage. Observez les lames et imagez-les au microscope optique à un grossissement de 400x.
  4. Analyse immunohistochimique du tissu rénal
    1. Retirez le rein droit, déparaffinez et déshydratez les sections comme décrit à l’étape 3.2.3, placez-les dans une solution tampon de citrate de sodium de 10 mM (pH 6,0) et faites-les chauffer (125 °C, 103 kPa) pendant 5 minutes pour la réparation de l’antigène. Après 10 min, retirez les sections, refroidissez-les à température ambiante et lavez-les 3 x 5 min dans 1x PBS.
    2. Placez les sections dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes pour bloquer la peroxydase endogène et lavez 3 x 5 minutes dans du PBS.
    3. Ajoutez 10 % de sérum de chèvre goutte à goutte sur les sections, en vous assurant que le sérum de chèvre couvre uniformément toute la section. Placez les sections dans une boîte humide, incubez à 37 °C pendant 30 min et lavez-les 3 x 5 min avec du PBS.
    4. Ajouter les anticorps primaires COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) goutte à goutte (voir le tableau des matières) et incuber dans une boîte humide à 4 °C au réfrigérateur pendant la nuit.
    5. Retirez la section, lavez avec du PBS 3 x 5 min, ajoutez l’anticorps secondaire (1:3 000) goutte à goutte, incubez à 37 °C pendant 60 min et lavez avec du PBS pendant 3 x 5 min.
    6. Ajouter la solution de développement de couleur 3,3'-diaminobenzidine (DAB) pendant 10 min, laver la solution de développement de couleur avec de l’eau distillée, incuber avec 100 μL d’hématoxyline pendant 5 min à température ambiante et rincer à l’eau distillée pendant 5 min.
    7. Déshydrater, rendre transparent et sceller comme décrit à l’étape 3.2.3, et recueillir les images à l’aide d’un microscope optique.
  5. Analyse quantitative de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR)
    1. Prenez ~100 mg de tissu rénal congelé dans un tube homogénéisateur de 10 ml, broyez-le soigneusement avec un pilon jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de masse tissulaire évidente, puis ajoutez 1 ml de réactif d’extraction d’ARN pour l’homogénéisation.
    2. Ajouter 250 μL de chloroforme, agiter dans un mélangeur vortex pendant 10 s, l’incuber sur de la glace pendant 5 min, le centrifuger à 15 984 × g pendant 10 min à 4 °C et pipeter la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
    3. Ajouter 500 μL d’isopropanol à la phase aqueuse, bien mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 10 s et incuber le mélange sur de la glace pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 15 984 × g pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et lavez la pastille d’ARN avec 1 ml d’éthanol à 75 %. Après un bref vortex, centrifuger à nouveau à 15 984 × g pendant 10 min. Jetez l’éthanol et laissez la pastille d’ARN sécher à l’air libre à température ambiante.
    4. Ajouter 30 μL d’eau de pyrocarbonate de diéthyle pour dissoudre l’ARN et mesurer l’absorbance de la solution d’ARN à 260 nm et 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre pour calculer la concentration d’ARN.
      REMARQUE : La pureté de l’ARN est évaluée par le rapport A260/A280 . Un rapport idéal A260/A280 doit être compris entre 1,8 et 2,0, indiquant une bonne pureté de l’ARN. Si le rapport est inférieur à 1,8, cela peut suggérer la présence d’une contamination par des protéines ou des phénols, et une purification supplémentaire est nécessaire, comme une extraction supplémentaire de phénol-chloroforme ou une précipitation d’éthanol pour éliminer les contaminants.
    5. Mélanger 3 μg d’ARN total, 4 μL de 4 gDNA Wiper Mix et de la ddH2O sans RNase jusqu’à un volume final de 16 μL, centrifuger à 1 250 × g pendant 10 s et incuber à 42 °C pendant 2 min. Ajouter 4 μL de transcriptase inverse 5x à 16 μL de la solution ci-dessus, centrifuger à 1 250 × g pendant 10 s. Effectuez le programme de transcription inverse à 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min). Stockez l’ADNc synthétisé à -20 °C.
    6. Sortez la solution d’ADNc du congélateur et effectuez une pré-dénaturation à 90 °C (10 min), suivie de 40 cycles de 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s), et enfin de lyser de l’ordre de 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s, 60 °C augmenter progressivement jusqu’à 95 °C à un taux de 0,1 °C/s).
    7. Calculer l’expression relative de WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB et IL-1β à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt basée sur la valeur Ct de chaque échantillon avec Gapdh comme référence interne (ΔΔCt = valeur Ct du gène cible - valeur Ct du gène de référence interne) (voir le tableau 2).
  6. Analyse par transfert Western (WB)
    1. Prenez ~100 mg de tissu rénal congelé dans un tube d’homogénéisation de 10 ml, suivi de 500 μL de solution de lyse (inhibiteur de protéase :inhibiteur de phosphatase :RIPA= 1:1:100), et broyez-le suffisamment avec un pilon jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de masse tissulaire évidente.
    2. Incuber le tube sur de la glace pendant 30 min, centrifuger à 15 984 × g pendant 10 min et aspirer le surnageant.
    3. Déterminez la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide du dosage BCA. En fonction des concentrations mesurées, pipeter des quantités égales de protéines totales (p. ex., 30 μg) de chaque groupe dans de nouveaux tubes et ajuster le volume final à l’aide de PBS pour assurer l’uniformité. Ensuite, ajoutez 5 tampons de charge de protéines, faites bouillir à 100 °C pendant 10 min, puis retirez et laissez refroidir à température ambiante.
    4. Utilisez l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE à 12,5 % pour séparer les protéines. Tout d’abord, utilisez 80 V pour faire passer lentement l’échantillon à travers le gel de concentration, puis ajustez la tension à 120 V jusqu’à ce que l’échantillon s’écoule vers le bas du gel de séparation, puis éteignez l’appareil.
    5. Trempez le papier filtre dans un tampon de transfert de membrane, utilisez une pince à épiler pour tenir un coin de la membrane PVDF et plongez-le dans du méthanol pour l’activer. Retirez le gel, coupez le gel concentré et le fond du gel de séparation à l’aide d’une plaque en plastique, puis, selon la structure sandwich du papier filtre/gel/membrane PVDF/papier filtre pour mettre en place le dispositif de transfert de membrane (gel comme pôle négatif, membrane PVDF comme pôle positif), placez l’installation dans un réservoir de transfert de membrane rempli de tampon de transfert prérefroidi, entourez-le de glaçons pour maintenir une température basse, et effectuez le transfert à un courant constant de 200 mA.
      REMARQUE : Décidez du temps de transfert en fonction du poids moléculaire de la protéine (plus le poids moléculaire est grand, plus le temps de transfert est long).
    6. Placez la membrane PVDF dans le tampon de blocage, secouez le tampon de blocage pendant 90 min à température ambiante et lavez avec du TBST (50 ml de 20x TBS et 0,5 mL de Tween-20 par L de TBST) pendant 3 x 5 min.
    7. À l’aide d’un diluant d’anticorps primaire, l’anticorps primaire dilué : WT-1 (1:1 000), CD2AP (1:1 000), P-PI3K (1:1 000), P-AKT (1:1 000), P-NF-κB (1:1 000) et IL-1β (1:1 000), ajoutez l’anticorps primaire sur la membrane PVDF et incubez dans une boîte humide au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit (voir le tableau des matériaux).
    8. Retirez la membrane PVDF du réfrigérateur à 4 °C, lavez-la avec du TBST pendant 3 x 5 min, à l’aide d’un diluant d’anticorps secondaire, diluez l’anticorps secondaire (1:10000), ajoutez l’incubation de l’anticorps secondaire à température ambiante pendant 60 min, lavez avec du TBST pendant 3 x 5 min, placez la membrane PVDF dans l’imageur de chimiluminescence et ajoutez uniformément le liquide luminescent ECL dans le sens de la goutte à goutte (A : B = 1:1).

4. Analyse pharmacologique en réseau de la YHT pour le traitement de la MRD

  1. Criblage des principes actifs et des cibles de YHT
    1. Déterminer les ingrédients actifs de Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria et Schisandra Chinensis à l’aide de la base de données TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) et de Maitake à partir de la base de données BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Fixer la biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et la ressemblance au médicament (DL) ≥ 0,18 comme critères de dépistage pour identifier les ingrédients actifs.
    2. Recherchez dans la base de données des MTTC (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) les cibles d’action des ingrédients actifs des MTC ci-dessus.
    3. Mettez moins l’accent sur les cibles des ingrédients actifs ci-dessus et intégrez-les dans une liste pour une analyse plus approfondie. Normaliser les noms des cibles à l’aide de la base de données de protéines Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Construction du réseau cible des principes actifs de YHT
    1. Importez les ingrédients actifs et leurs cibles correspondantes dans theoftware : Construisez le réseau « ingrédient actif-cible » en sélectionnant Fichier | Importation | Réseau et chargement des données pertinentes.
    2. Effectuez une analyse de la topologie du réseau en accédant à Outils | Analyse de réseau | Analysez le réseau pour visualiser les relations entre les médicaments, les ingrédients actifs, les cibles et les maladies. Dans la visualisation du réseau, les nœuds représentent les ingrédients actifs, et les arêtes représentent les interactions entre les ingrédients actifs et les cibles.
  3. Dépistage des cibles liées à la DKD
    1. En utilisant l’insuffisance rénale diabétique comme terme de recherche et en définissant l’espèce comme humaine, dépister les cibles liées à la MRD à partir des bases de données suivantes : base de données GeneCards (https://www.genecards.org) ; base de données OMIM (http://www.omim.org) ; base de données TTD (https://www.ttd.cn) ; base de données DrugBank (http://www.drugbank.ca) ; Base de données DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Après avoir obtenu les résultats des cinq bases de données, fusionnez-les dans une feuille de calcul et supprimez les doublons à l’aide de la fonction Supprimer les doublons du menu Données , en veillant à ce que seuls les noms uniques des cibles liées à DKD soient conservés.
  4. Construction des IPP (interaction protéine-protéine) et criblage des cibles principales
    1. Utilisez un tableur pour identifier les cibles d’intersection de YHT et de DKD en entrant la liste des cibles YHT dans une colonne et la liste des cibles DKD dans une autre. Appliquez une mise en forme conditionnelle pour mettre en évidence les entrées communes dans les deux colonnes, identifiant ainsi les cibles d’intersection.
    2. Ouvrez le site Web de la base de données String (https://cn.string-db.org/), sélectionnez Entrée | Collez/Téléchargez pour importer les données par lots et définissez le seuil Degré ≥ 1 pour filtrer les cibles libres (cibles sans interactions) dans le réseau.
    3. Sélectionnez Fichier | Importation | en réseau et importez les cibles d’intersection filtrées dans le logiciel pour créer la visualisation finale.
    4. Accédez à Analyse de réseau | Analysez le réseau et filtrez les cibles principales de YHT-DKD en fonction de la valeur du degré.
  5. Analyse fonctionnelle de l’ontologie génétique (GO) et analyse de l’enrichissement de la voie de l’encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG)
    1. Ouvrez la plateforme Metascape en visitant http://metascape.org/gp/index.html, sélectionnez Démarrer l’analyse pour commencer, collez la liste des cibles pour YHT et DKD dans la zone de saisie de la section Analyse personnalisée , définissez l’espèce sur Homo sapiens dans le menu déroulant, choisissez Analyse personnalisée et définissez le seuil de valeur P sur <0,01, puis cliquez sur Soumettre pour exécuter l’analyse.
    2. Une fois les résultats renvoyés par Metascape, allez dans http://www.bioinformatics.com.cn/, sélectionnez Outils | terme GO d’enrichissement, collez les termes GO à partir des résultats et cliquez sur Soumettre pour générer des graphiques à bulles. Visualisez les 10 principaux termes GO en les triant en fonction de la valeur P.
    3. Triez les trajectoires KEGG en fonction de la valeur P des résultats de l’analyse Metascape. Rendez-vous sur le même site Web de microbiologie (http://www.bioinformatics.com.cn/), sélectionnez Enrichissement de la voie KEGG, collez les 10 principales voies KEGG sélectionnées, puis cliquez sur Soumettre pour visualiser les diagrammes à bulles KEGG.

5. Analyse statistique

  1. Si les données suivent une distribution normale et que les variances sont homogènes, utilisez l’ANOVA à un facteur. Si les variances ne sont pas homogènes, utilisez le test T3 de Dunnett ou un test t d’échantillon indépendant.
  2. Pour les données qui ne suivent pas une distribution normale, utilisez le test de somme de rang à partir de méthodes non paramétriques.
  3. Considérons que P < 0,05 est statistiquement significatif.

Résultats

Amélioration de la glycémie, de la fonction hépatique et rénale et des troubles du métabolisme des lipides chez les souris atteintes de DKD
Après 8 semaines d’administration, différentes doses de YHT ont considérablement réduit les taux de glucose sanguin aléatoire, d’UTP sur 24 h, de Scr et d’OUN, et amélioré la fonction rénale (Figure 1A-D) ; augmentation du taux d’ALB ; réduit les niveaux d’ALT et d’AST ; amélioration de la fonction hépatique (figure 1E-G) ; réduit les niveaux de CT et de TG ; et amélioré la régulation du métabolisme des lipides (Figure 1H,I). Les résultats ci-dessus ont indiqué que YHT avait des effets protecteurs sur la glycémie, la fonction hépatique et rénale et la régulation des lipides.

Amélioration des lésions histopathologiques rénales chez les souris atteintes de DKD
Pour tester si YHT pouvait améliorer les lésions rénales chez les souris atteintes de DKD, l’étendue des lésions pathologiques dans les tissus rénaux a été examinée à l’aide de la coloration H&E, PAS et Masson, ainsi que de l’IHC. La coloration H&E et PAS a révélé une atrophie glomérulaire, un élargissement de la région de la tunique albuginée, un gonflement et un détachement des cellules épithéliales tubulaires, une infiltration de cellules inflammatoires interstitielles et un dépôt évident de glycogène glomérulaire dans le groupe MOD (Figure 2A, B). La coloration Masson a montré une augmentation significative des fibres de collagène bleues dans les reins du groupe MOD par rapport au groupe CON (Figure 2C,D). L’IHC a montré que les pourcentages de zones positives pour le COI-I et le α-SMA étaient significativement plus élevés dans le groupe MOD que dans le groupe CON (figure 2E-G). En revanche, après l’utilisation de YHT et de POS, l’atrophie glomérulaire, l’élargissement de la zone attachée, l’enflure et l’excrétion des cellules épithéliales tubulaires, le degré d’infiltration des cellules inflammatoires interstitielles et le dépôt de glycogène glomérulaire ont été considérablement atténués ; la surface des fibres de collagène bleu a été considérablement réduite ; et les pourcentages de zones positives pour le COI-I et le α-SMA ont considérablement diminué. Les résultats ci-dessus ont indiqué que la YHT pourrait atténuer les lésions pathologiques rénales et la fibrose rénale chez les souris atteintes de DKD.

Atténuation des lésions podocytaires chez les souris atteintes de MRD
Les dommages aux cellules du pied chez les souris DKD ont été observés par IHC, PCR et WB. Les résultats de l’IHC ont montré que les niveaux d’expression des protéines marqueurs fonctionnels des cellules du pied, CD2AP et WT-1, étaient significativement diminués dans le groupe MOD par rapport au groupe CON, ce qui indique que les cellules du pied rénal étaient endommagées. Le traitement YHT a augmenté les niveaux d’expression de CD2AP et de WT-1 et a réduit les dommages aux cellules du pied (Figure 3A-C). Les résultats de la PCR et de la WB ont montré que les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm et des protéines marqueurs fonctionnels des cellules du pied, CD2AP et WT-1, étaient significativement diminués dans le groupe MOD par rapport au groupe CON, et que les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm et des protéines CD2AP et WT-1 étaient significativement augmentés après le traitement YHT (Figure 3D-H). Les résultats ci-dessus ont indiqué que YHT pourrait atténuer les lésions podocytaires chez les souris DKD.

Elucidation des cibles potentielles et des voies de signalisation liées aux effets de la YHT sur la DKD via la pharmacologie en réseau
Les principes actifs de YHT (291) ont été analysés dans les bases de données TCMSP et BATMAN-TCM, dont 39 principes actifs répondaient aux critères d’OB ≥ 30 % et de DL ≥ 0,18. Les matières actives ont fait l’objet d’une recherche dans la base de données afin d’identifier leurs cibles, et après fusion et suppression des valeurs en double, un total de 303 cibles ont été obtenues (figure 4A). Après avoir fusionné les résultats de cinq bases de données, dont GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank et DisGeNET, et supprimé les valeurs en double, 1 867 cibles liées à la DKD ont finalement été obtenues. Ensuite, http://www.bioinformatics.com.cn/ a été utilisé pour recouper les matières actives YHT tamisées avec les cibles DKD, ce qui a donné 84 cibles intersectionnelles (figure 4B). Ces 84 cibles ont été importées dans le logiciel Cytoscape pour dessiner un diagramme de réseau IPP, et des cibles clés potentielles pour le traitement YHT de la DKD ont été identifiées, notamment AKT, IL-1 β, CASP3, APOE et JUN (Figure 4C). L’analyse de l’enrichissement fonctionnel de GO a donné un total de 1 246 éléments, indiquant que YHT peut exercer des effets thérapeutiques sur la DKD en régulant les processus biologiques tels que la réponse à l’hormone et les fonctions moléculaires, y compris l’activité d’homodimérisation des protéines et l’activité de l’oxydoréductase, ainsi que les composants cellulaires tels que les radeaux membranaires et les microdomaines membranaires (Figure 4D). Au total, 263 résultats d’enrichissement en KEGG ont été obtenus, impliquant principalement la voie de signalisation AGE-RAGE dans les complexes diabétiques, les maladies hépatiques alcooliques, les lipides et la voie de l’athérosclérose. Sur la base de la valeur P, les 10 premiers résultats ont été sélectionnés pour dessiner un graphique à bulles de visualisation KEGG (Figure 4E). La voie de signalisation AGE-RAGE est fortement enrichie dans les complexes diabétiques, et plusieurs cibles centrales de l’IPP, telles que PI3K, AKT et IL-1β, sont enrichies dans cette voie. Par conséquent, cette voie de signalisation a été sélectionnée pour une validation ultérieure.

Atténuation des lésions podocytaires par inhibition de la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB
Les niveaux d’expression des gènes et des protéines liés à la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB ont été examinés plus en détail par PCR et WB. Les résultats de la PCR ont montré que les niveaux d’expression relatifs de l’ARNm de Pi3k, Akt, Nf-κb et Il-1β dans le groupe MOD étaient significativement élevés par rapport au groupe CON et étaient significativement diminués après l’administration de YHT (Figure 5A-D). Les résultats de l’étude WB ont montré que les niveaux relatifs de protéines P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB et IL-1β étaient également significativement élevés dans le groupe MOD par rapport au groupe CON, alors qu’ils étaient significativement diminués après l’administration de YHT (Figure 5E-I). Ces résultats suggèrent en outre que YHT pourrait inhiber la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB en atténuant les lésions podocytaires chez les souris DKD.

figure-results-1
Figure 1 : Amélioration de la glycémie, des fonctions hépatiques et rénales et des troubles du métabolisme des lipides chez les souris atteintes de DKD. Effets de la YHT sur (A) la glycémie aléatoire ; (B-D) la fonction rénale, y compris les protéines urinaires sur 24 heures, la créatinine sanguine et l’azote uréique ; (E-G) la fonction hépatique, y compris l’albumine sérique, l’alanine aminotransférase et l’aspartate aminotransférase ; et (H,I) la régulation du métabolisme des lipides, y compris le cholestérol total et les triglycérides. Les données sont exprimées sous forme de moyennes ± d’écarts-types de six échantillons indépendants, par rapport au groupe à blanc, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, et par rapport au groupe modèle, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ces notations statistiques sont utilisées de manière cohérente dans toutes les figures. Abréviations : YHT = yinhuo Tang ; DKD = maladie rénale diabétique ; ALB = albumine ; ALT = alanine aminotransférase ; AST = aspartate aminotransférase ; CT = cholestérol total ; TG = triglycérides ; CON = groupe témoin ; MOD = groupe de modèles ; POS = valsartan Groupe témoin positif ; YH-L = groupe à faible dose du YHT ; YH-M = groupe à dose moyenne du YHT ; YH-H = groupe à forte dose du YHT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Amélioration des lésions histopathologiques des reins chez les souris DKD. (A,B) Histologie rénale par coloration H&E et PAS (barre d’échelle = 20 μm) ; (C) coloration Masson pour observer le degré de fibrose rénale et (D) analyse semi-quantitative à l’aide du logiciel ImageJ ; (E-G) Analyse semi-quantitative des niveaux d’expression relatifs des COI-I et α-SMA dans les tissus rénaux à l’aide des logiciels IHC et ImageJ (barre d’échelle = 20 μm). Abréviations : YHT = yinhuo Tang ; DKD = maladie rénale diabétique ; H&E = coloration à l’hématoxyline et à l’éosine ; PAS = Coloration périodique à l’acide de Schiff ; COI-I = Collagène de type I ; α-SMA = actine musculaire α-lisse ; CON = groupe témoin ; MOD = groupe de modèles ; POS = valsartan Groupe témoin positif ; YH-L = groupe à faible dose du YHT ; YH-M = groupe à dose moyenne du YHT ; YH-H = groupe à forte dose du YHT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Atténuation des lésions podocytaires chez les souris DKD. (A-C) IHC a détecté les niveaux d’expression relatifs de CD2AP et WT-1 dans les tissus rénaux (barre d’échelle = 20 μm) ; (D, E) La PCR a détecté l’expression relative de l’ARNm de CD2AP et WT-1 dans les tissus rénaux, et une analyse semi-quantitative a été effectuée à l’aide du logiciel Image J ; (F-H) WB a détecté les niveaux d’expression protéique relatifs de CD2AP et WT-1 dans les tissus rénaux, et une analyse semi-quantitative a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ. analyse quantitative à l’aide du logiciel Image J. Abréviations : YHT = yinhuo Tang ; DKD = maladie rénale diabétique ; IHC = immunohistochimie ; WB = Western blot ; CD2AP = protéine associée à CD2 ; WT-1 = tumeur de Wilms 1 ; CON = groupe témoin ; MOD = groupe de modèles ; POS = valsartan Groupe témoin positif ; YH-L = groupe à faible dose du YHT ; YH-M = groupe à dose moyenne du YHT ; YH-H = groupe à forte dose du YHT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Analyse pharmacologique en réseau de YHT pour le traitement de la DKD. (A) Graphique cible de la maladie de YHT pour le traitement de la DKD. (B) Diagramme de Venn des cibles sécantes de YHT et DKD. La couleur orange représente le nombre de cibles pertinentes pour la DKD ; la couleur verte représente le nombre de cibles thérapeutiques des principes actifs YHT ; et la partie sécante représente le nombre de cibles sécantes (le nombre de cibles de YHT pour DKD). (C) Diagramme du réseau PPI des cibles croisées de YHT et DKD. (D) Analyse de l’enrichissement GO des 10 cibles les plus importantes de la YHT pour le traitement de la DKD. (E) Analyse de l’enrichissement KEGG des 10 cibles les plus importantes pour le traitement YHT de la DKD. Abréviations : YHT = yinhuo Tang ; DKD = maladie rénale diabétique ; IPP = Interaction Protéine-Protéine ; GO = Ontologie des gènes ; KEGG = Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes ; CON = groupe témoin ; MOD = groupe de modèles ; POS = valsartan Groupe témoin positif ; YH-L = groupe à faible dose du YHT ; YH-M = groupe à dose moyenne du YHT ; YH-H = groupe à forte dose du YHT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Atténuation des lésions podocytaires par inhibition de la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB. (A-D) PCR pour détecter l’expression relative de l’ARNm de Pi3k, Akt, Nf-κb et Il-1β dans les tissus rénaux. (E-I) WB pour détecter les niveaux d’expression protéique relatifs de P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB et IL-1β dans les tissus rénaux, et une analyse semi-quantitative a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de Yinhuo Tang. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Détails des amorces qRT-PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

L’une des étapes critiques de ce protocole est l’utilisation de la pharmacologie en réseau pour identifier les composants actifs de la YHT et prédire leurs interactions avec les cibles liées à la DKD. Cette étape consiste à analyser des données biologiques à grande échelle à l’aide d’outils bioinformatiques tels que des bases de données (p. ex., TCMSP, DrugBank et GeneCards) afin de cartographier les voies moléculaires et les réseaux biologiques potentiels touchés par le YHT. Cette prédiction a été suivie d’une validation expérimentale par des modèles animaux de la DKD, où les effets hypothétiques de la YHT sur ces voies ont été testés. L’intégration des prédictions informatiques aux données est un aspect crucial de notre approche, car elle améliore la fiabilité de nos résultats et comble le fossé entre les prédictions théoriques et les résultats pratiques. De plus, l’utilisation de modèles animaux est une autre étape essentielle dans la validation des effets thérapeutiques de la YHT. La DKD chez les animaux imite étroitement la progression de la maladie humaine, ce qui permet d’évaluer efficacement l’impact de la YHT sur les lésions glomérulaires et la fibrose rénale. Le suivi méticuleux des marqueurs de la fonction rénale tels que la Scr, l’BUN et la protéinurie, ainsi que les évaluations histopathologiques, sont essentiels pour évaluer l’efficacité thérapeutique de la YHT.

Bien que notre protocole combine de puissantes méthodes de calcul et expérimentales, il existe plusieurs limites. Premièrement, l’approche de pharmacologie en réseau repose fortement sur les données disponibles dans les bases de données publiques, et il peut y avoir des biais ou des informations manquantes concernant certains composants des voies liées à la YHT ou à la DKD. Bien que nous ayons croisé plusieurs bases de données pour atténuer ce problème, certaines interactions pertinentes peuvent encore être négligées. Deuxièmement, cette étude n’a exploré que le mécanisme de la YHT dans la réduction des lésions podocytaires au niveau des animaux de laboratoire, et des expériences cellulaires et des études cliniques sur de grands échantillons sont nécessaires pour valider les résultats expérimentaux. Enfin, la pharmacologie en réseau a montré que le traitement de la DKD par YHT était également associé à la maladie hépatique alcoolique, au métabolisme des lipides et à l’athérosclérose, ainsi qu’à la régulation de la lipolyse dans les adipocytes. Cette étude a uniquement vérifié si la modulation de la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB par YHT pouvait retarder la progression de la DKD ; Les résultats doivent être explorés plus avant.

La voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB est une voie de signalisation intracellulaire importante impliquée dans la régulation d’une variété de processus biologiques tels que la croissance cellulaire, la prolifération, la survie et les réponses inflammatoires22. Des études ont montré qu’il joue un rôle important dans la progression des lésions pédiculocytaires23,24. NF-κB est un composant important en aval de la voie PI3K/Akt et participe à la transmission d’une variété de signaux intracellulaires et à l’expression de plusieurs gènes. L’inhibition de la voie de signalisation PI3K/AKT conduit à la dégradation de la protéine inhibitrice de NF-κB IκB, qui à son tour conduit à la phosphorylation de NF-κB et à son entrée dans le noyau, et à la production d’une variété de chimiokines et de facteurs inflammatoires, conduisant à des lésions podocytaires et à une fibrose interstitielle rénale25. Certaines études ont montré que l’inhibition de l’activation de la voie de signalisation PI3K/AKT/NF-κB peut supprimer efficacement les réponses inflammatoires et la fibrose rénale, retardant ainsi la progression de la DKD26.

Des études ont montré que les troubles du métabolisme des lipides jouent un rôle important dans l’apparition et la progression de la DKD27,28. Les patients atteints de DKD présentent souvent un métabolisme lipidique anormal, notamment des taux élevés de LDL, de TG et d’accumulation d’acides gras. Ces anomalies sont étroitement liées à des changements pathologiques tels que la glomérulosclérose et la fibrose tubulo-interstitielle29,30. La recherche indique que les troubles du métabolisme des lipides peuvent favoriser la progression de la DKD par plusieurs voies de signalisation31,32. Tout d’abord, la voie de signalisation mTOR est une voie clé dans la régulation du métabolisme des lipides ; Sa suractivation entraîne des lésions des podocytes et une protéinurie33,34. Un environnement riche en graisses peut favoriser l’accumulation de lipides à travers l’axe PI3K/AKT/mTOR, induisant l’apoptose des podocytes et exacerbant finalement la détérioration de la fonction rénale 35,36,37. Deuxièmement, la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), un régulateur essentiel du métabolisme de l’énergie cellulaire, protège le rein des perturbations métaboliques en favorisant l’oxydation des acides gras, en inhibant la synthèse des lipides et en réduisant la lipotoxicité 38,39,40. L’inactivation de l’AMPK est considérée comme un mécanisme important dans la progression de la DKD. Les activateurs de l’AMPK, tels que la metformine, ont montré des effets rénoprotecteurs significatifs et représentent une cible thérapeutique prometteuse pour la DKD41.

Enfin, des études ont démontré que les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes α/γ (PPARα/γ) jouent un rôle essentiel dans la régulation du métabolisme des lipides et de la DKD42,43. L’activation de PPARα favorise l’oxydation des acides gras et réduit l’accumulation de lipides dans les reins, tandis que PPARγ améliore la sensibilité à l’insuline et exerce des effets anti-inflammatoires44,45. Les agonistes des PPAR, tels que les fibrates, ont montré des avantages cliniques potentiels dans la réduction de la protéinurie chez les patients atteints de DKD46. En conclusion, les troubles du métabolisme des lipides influencent la progression pathologique de la DKD par de multiples voies de signalisation. Les interactions entre ces voies forment un réseau pathologique complexe. Cibler le métabolisme des lipides pourrait fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la DKD.

La famille des caspases (CASP), une famille de protéases spécifiques de la cystéine, est un groupe de protéases que l’on trouve largement dans les cellules et qui sont principalement impliquées dans la régulation de l’apoptose et des réponses inflammatoires47,48. Les membres de la famille CASP partagent des similitudes structurelles et existent généralement sous forme de zymogènes, qui sont activés par une cascade de réactions, déclenchant ainsi l’apoptose, la pyroptose et d’autres processus de mort cellulaire programmés49. Parmi eux, CASP3, un membre de la famille des caspases (CASP) avec une structure conservée généralement présente sous forme de zymogène, est une protéase clé dans la phase d’exécution de l’apoptose qui catalyse le clivage de protéines cellulaires spécifiques, jouant ainsi un rôle essentiel dans la régulation de la croissance cellulaire normale et le maintien de l’homéostasie interne50,51. La caspase-8 agit comme initiateur des cascades apoptotiques et participe à la modulation des réponses inflammatoires par l’activation de la NPK, qui est un facteur clé dans la régulation de la croissance cellulaire. La caspase-8 agit comme initiateur de la cascade apoptotique et participe également à la régulation de la réponse inflammatoire en activant les vésicules inflammatoires telles que NLRP1 et NLRP3, déclenchant ainsi la pyroptose cellulaire52. Sur la base du rôle important de la voie de signalisation CASP dans la médiation de l’apoptose et de la pyroptose dans les cellules pédonculées, d’autres explorations approfondies de la relation entre YHT, CASP3/8, les cellules pédonculées et la DKD sont justifiées à l’avenir.

Par rapport aux approches conventionnelles de découverte de médicaments qui mettent généralement l’accent sur des mécanismes à cible unique bien définis pour la clarté et la prévisibilité réglementaires, notre stratégie basée sur la pharmacologie en réseau permet une exploration systématique des interactions multi-cibles inhérentes aux formulations de MTC comme YHT. Bien que cette complexité reflète la nature holistique de la MTC et son étendue thérapeutique potentielle, elle souligne également le défi des effets hors cible non intentionnels, qui nécessitent une validation et une interprétation minutieuses. En considérant la nature multi-cibles et multi-voies de l’action de YHT, nous fournissons une compréhension plus holistique de ses effets thérapeutiques dans le traitement de la DKD. De plus, la pharmacologie en réseau permet de prédire les interactions médicamenteuses potentielles et les effets secondaires, ce qui est crucial pour garantir l’innocuité et l’efficacité des thérapies à plusieurs composants. Les traitements actuels de la DKD se concentrent principalement sur la gestion des symptômes ou le ralentissement de la progression plutôt que sur les mécanismes sous-jacents de la maladie. En intégrant des outils bioinformatiques modernes à une validation expérimentale, cette étude souligne l’importance de la biologie des systèmes dans l’amélioration de l’efficacité de la MTC, en particulier dans les maladies chroniques comme la MRD.

À l’avenir, cette technique est très prometteuse pour l’élargissement de la portée de la pharmacologie en réseau dans la recherche en MTC, en particulier dans le traitement de maladies complexes comme la MRD. Notre approche pourrait être appliquée à l’exploration d’autres formules de MTC ou d’herbes individuelles pour leur potentiel thérapeutique dans le traitement des maladies rénales, des maladies cardiovasculaires et des troubles métaboliques. De plus, cette méthodologie pourrait être étendue pour étudier la réaffectation des médicaments en identifiant de nouvelles utilisations des médicaments existants dans le traitement de la DKD. Une autre application potentielle de notre approche réside dans la médecine personnalisée. En intégrant des données spécifiques au patient, la pharmacologie en réseau pourrait être utilisée pour adapter les stratégies de traitement de la MTC en fonction des profils moléculaires individuels, améliorant ainsi l’efficacité du traitement et minimisant les effets indésirables.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation provinciale des sciences naturelles du Jilin (n° 20210101201JC).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Éthanol anhydreChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Centre d’expérimentation animaleChangchun Université de médecine traditionnelle chinoiseSYXK (JI) 2023-0014
Base de données BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
Tampon de blocageBeyotimeP0023B
Pots en céramiqueMideaMD-DG30E103
Système d’imagerie par chimiluminescenceHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ChloroformChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 logiciel----
Kit de réactifs DABServicebioG1212-200T
souris db/dbNanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL substrate solutionaffinityKF8003
Bain d’eau électrique à température constanteFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Alimentation de l’instrument d’électrophorèseBeijing Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Homogénéisateur de verreSolarbioYA0852
Lame de verreNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Chèvre Anti-Lapin IgG HRP (anticorps secondaire)AffinitéS00011:3000 pour IHC, 1:10000 pour WB
HématoxylineWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse  ;Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix pour qPCR (+essuie-glace d’ADNg)VAZYMER223-01
Agitateur horizontalJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Système d’imagerieNikonNikon DS-U3
Agitateur magnétique magnétique numérique intelligentHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd80109218
marqueur (20-120KD)GenScriptM00521
Masson kit de colorationBASOBA4079B
Gaze médicaleJianerkang Medical-
Plate-forme Metascapehttp://metascape.org/gp/index.html--
MéthanolThermo67-56-1
Site Web de microbiologiehttp://www.bioinformatics.com.cn/--
microscopeNikonECLIPSE Ci
four à micro-ondesGalanz Four à micro-ondes Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Broyeur de tissus multi-échantillonsShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Balance électronique analytique multifonctionnelleChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Résine neutreWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Sérum de chèvre normalSolarbioSL038
fourShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Centrifugeuse de palmeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
Kit de coloration PASBASOBA4114B
Trancheuse pathologiqueShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
Instrument PCRHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pistolet pipetteDragonKE0003087/KA0056573
Tampon de dilution d’anticorps primairesBeyotimeP0023A
Complexe inhibiteur de la protéine phosphataseMeilunbioMB12707-1
Membrane PVDF (0.22 &mu ; m)SolarbioISEQ00010
Diluant rapide à base d’anticorps primaires/secondairesSolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981:200 pour IHC, 1:1000 pour WB
Rabbit anti-COI-IAffinityDF121491:200 pour IHC, 1:1000 pour WB
Rabbit anti-IL-1&beta ;AffinityAF51031:1000 pour WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 pour WB
Rabbit anti-P-NF-&Kappa ; bAffinityAF32191:1000 pour WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 pour WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 pour IHC, 1:1000 pour WB
Rabbit anti-&alpha ;--SMAAffinityAF10321:200 pour IHC, 1:1000 pour WB
Rabbit anti-&beta ;-ActinAffinityAF70181:1000 pour WB
Système de PCR en temps réelABIQuantStudio 6
RIPA Tampon de lyseMeilunbioMA0151
DdH2O sans RNase SolarbioR1600
Tampon de dilution d’anticorps secondaireBeyotimeP0023D
Verre de glissement et de couvertureJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 logiciel----site
Web de base de données de chaînes  ;https://cn.string-db.org/--
Instrument d’eau super pureZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus ADN polyméraseTIANGENET105-02
Base de données TCMSP  ;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
Broyeur de tissusBelle paroiMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20Chine Groupe pharmaceutique national Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Spectrophotomètre visible Ultra micro UVHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Base de données sur les protéines Uniprothttps://www.uniprot.org--
Microscope optique droitNikonNikon Eclipse CI
Urinary Protein Test KitNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
lyophilisateur sous videNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Réservoir d’électrophorèse verticalBeijing 61 Instrument FactoryDYCZ-24DN
Mélangeur vortexWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Western Blocking BufferSolarbioSW3010
xyleneChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdE8090
de

Références

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
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