Utilisation des bibliothèques de vision par ordinateur pour rationaliser la quantification des noyaux

Summary

Cet article décrit des méthodes étape par étape pour automatiser la quantification de noyaux basée sur des images à l’aide d’un programme exécutable open source validé sur une gamme de densités cellulaires. Ce programme offre une solution de rechange qui s’attaque aux obstacles liés au coût, à l’accessibilité pour les utilisateurs ayant des compétences technologiques limitées et à la validation propre à l’application qui peut limiter l’utilité des technologies existantes.

Abstract

Les tests sur cellules vivantes et les analyses de cellules basées sur l’image nécessitent une normalisation des données pour une interprétation précise. Une méthode couramment utilisée consiste à colorer et à quantifier les noyaux, puis à normaliser les données en fonction du nombre de noyaux. Ce nombre de noyaux est souvent exprimé en nombre de cellules uninucléées. Bien que la quantification manuelle puisse être laborieuse et chronophage, les méthodes automatisées disponibles peuvent ne pas être préférées par tous les utilisateurs, peuvent manquer de validation pour cette application spécifique ou peuvent être prohibitives. Ici, nous fournissons des instructions étape par étape pour capturer des images quantifiables de noyaux colorés avec des colorants d’ADN fluorescents, puis quantifier les noyaux à l’aide d’un logiciel de comptage d’objets automatisé développé à l’aide de bibliothèques de vision par ordinateur Python. Nous validons également ce programme sur une gamme de densités cellulaires. Bien que le temps exact d’exécution du programme varie en fonction du nombre d’images et de matériel informatique, ce programme consolide les heures de travail en comptant les noyaux en secondes pour que le programme s’exécute. Bien que ce protocole ait été développé à l’aide d’images de cellules fixes et colorées, les images de noyaux colorés dans des cellules vivantes et des applications d’immunofluorescence peuvent également être quantifiées à l’aide de ce programme. En fin de compte, ce programme offre une option qui ne nécessite pas un haut degré de compétence technologique et constitue une alternative validée et open-source pour aider les biologistes cellulaires et moléculaires à rationaliser leurs flux de travail, en automatisant la tâche fastidieuse et chronophage de quantification des noyaux.

Introduction

Les expériences fonctionnelles et basées sur l’image sont essentielles pour comprendre les impacts des traitements expérimentaux sur la biochimie et la physiologie des cellules entières. L’interprétation valide des données des expériences de biologie cellulaire dépend de la précision et de la reproductibilité du protocole expérimental, y compris la normalisation des données. Par exemple, l’analyse de la consommation d’oxygène et des taux d’acidification extracellulaire dans les cellules vivantes au départ et après le traitement avec des médicaments spécifiques permet d’évaluer divers aspects du métabolisme énergétique

Protocol

REMARQUE : Les fichiers supplémentaires se trouvent au lien suivant https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Capture et enregistrement d’images à l’aide de la microscopie à fluorescence

1. Préparez les échantillons de cellules ou de tissus à imager, y compris la coloration avec le colorant d’ADN souhaité. Pour obtenir les images utilisées ici, des myoblastes C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) ont été cultivés dans des plaques à 6 puits pendant 48 à 72 h dans des conditions de culture standard (5 % de CO₂, 37 °C, humidifiés), avec ou sans 50 mM d’EtOH⁶....

Results

Chaque série d’images par lots produit : 1) un ensemble de fichiers d’images avec des contours appliqués montrant les contours des noyaux identifiés (Figure 5), et 2) un fichier .csv (tableur) reliant les noms des fichiers d’images et les comptages associés. La visualisation des contours permettra à l’utilisateur d’évaluer visuellement la qualité du comptage. Plus précisément, les images obtenues selon la section 1 doivent avoir tous les noyaux (ou presque to.......

Discussion

Notre programme de quantification des noyaux présente plusieurs avantages par rapport aux options existantes : il ne nécessite que des compétences technologiques minimales, est validé pour la tâche spécifique de quantification des noyaux et est open-source ; Ce dernier permet de surmonter les obstacles liés aux coûts. En fin de compte, ce programme offre aux biologistes cellulaires et moléculaires une option supplémentaire pour quantifier rapidement et précisément les noyaux dans des ima.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ordinateur avec accès au fichier de résultats de la méthode 2 ou 3	-	-	Voir l’étape 2.6 (pour la méthode 2) ou l’étape 3.3.9 ou 3.4.9 (pour la méthode 3)
Ordinateur avec accès à Internet, navigateur moderne	-	-	par exemple, Google Chrome
Ordinateur avec accès à Internet, navigateur moderne et système d’exploitation Windows	Varie		Pour Mac, Linux ou autre système d’exploitation, utilisez la méthode 3
Ordinateur avec logiciel de capture d’image	Zeiss	AxioVision	D’autres logiciels sont acceptables ; doivent être compatibles avec le microscope à fluorescence
Emplacement du fichier pour la sortie (feuilles de calcul des résultats et contours de l’image)	-	-	Peut être un nouveau dossier vide
Microscope à fluorescence	Zeiss	Axiovert 200M	Les autres microscopes à fluorescence sont acceptables ; doivent être équipés de cubes de filtre appropriés, de l’objectif souhaité et d’une caméra.
Dossier contenant toutes les images à quantifier	-	-	Voir étape 1.12
Python version 3.10 ou supérieure		Python-Disponible	en téléchargement gratuit et installation à https://www.python.org/downloads/  ;
Échantillons à imager	-		Fixes ou vivants, colorés ou contre-colorés avec des colorants d’ADN fluorescents
Logiciel de tableur	Microsoft	Excel	Un tableur similaire est également acceptable