Article de méthode

Détection par fluorescence de l’activité des nucléases FEN1 et criblage d’inhibiteurs de petites molécules

DOI :

10.3791/67968

⸱

27 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un test biochimique par déplacement de gel pour mesurer l’activité de FEN1 (Flap Endonuclease 1) et le développement d’inhibiteurs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonuclease 1) est une nucléase d’ADN clé impliquée dans la réplication de l’ADN et la réparation des dommages, jouant un rôle crucial dans le maintien de la stabilité génomique. Des niveaux élevés d’activité de FEN1 sont étroitement associés au développement de divers cancers, ce qui fait de FEN1 un biomarqueur reconnu et une cible médicamenteuse pour les cancers du poumon, du sein et de la prostate. Les méthodes conventionnelles de marquage radio-isotopique pour détecter l’activité des nucléases FEN1 présentent des défis en termes de commodité et de sécurité. Dans cette étude, un substrat de fragment d’ADN avec une structure en lambeau a été synthétisé in vitro. Ce substrat est marqué avec un fluorophore à l’extrémité 5' du volet, ce qui permet à la nucléase FEN1 de reconnaître et de cliver spécifiquement le site désigné. L’activité de FEN1 a ensuite été déterminée en détectant le signal fluorophore après électrophorèse sur gel. Cette méthode permet une évaluation rapide et efficace de l’activité des nucléases de FEN1 et le criblage de ses inhibiteurs. Il fournit une approche sensible et spécifique pour analyser l’activité de FEN1 et évaluer l’efficacité des inhibiteurs à petites molécules. De plus, il contribue de manière significative à la recherche sur la réparation des dommages à l’ADN et le développement du cancer, en proposant une nouvelle stratégie de recherche clinique sur les mécanismes de la maladie et la détection des substances génotoxiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La réplication de l’ADN n’est pas toujours parfaite et peut être perturbée par des facteurs internes et externes. Par conséquent, les mécanismes de réplication de l’ADN et de réparation des dommages sont essentiels à la survie cellulaire et à la stabilité du génome. Dans ce processus, l’endonucléase spécifique à la structure ramifiée humaine FEN1 (Flap Endonuclease 1), une nucléase de l’ADN central, joue un rôle crucial 1,2,3.

FEN1 est principalement impliqué dans la réplication de l’ADN et est indispensable à la maturation des fragments d’Okazaki sur le brin retardé 4,5. Cela garantit la progression efficace de la réplication de l’ADN et la réparation précise de l’ADN endommagé. Cependant, des augmentations anormales des niveaux de FEN1 ont été étroitement liées au développement de divers cancers 6,7, tels que le cancer du poumon et du sein7. Ainsi, FEN1 est non seulement essentiel à la réplication et à la réparation de l’ADN, mais a également suscité une attention considérable en tant que biomarqueur pour le diagnostic du cancer et une cible thérapeutique potentielle 8,9. La détection de l’activité de FEN1 est essentielle pour le diagnostic précoce des cancers et pour faire progresser la recherche sur les thérapies ciblées.

Compte tenu de l’importance de FEN1 et de la nécessité d’étudier son activité pour le diagnostic précoce du cancer et le développement de thérapies ciblées, l’objectif principal de la méthode développée dans cette expérience était de mesurer avec précision et efficacité l’activité des nucléases de FEN1. Cette méthode vise à fournir une plateforme fiable pour le criblage de petites molécules inhibitrices ciblant FEN1. En atteignant ces objectifs, l’étude cherche à contribuer à une meilleure compréhension du rôle de FEN1 dans le cancer et à faciliter la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Il existe de nombreuses techniques pour détecter l’activité des nucléases FEN1, chacune ayant des caractéristiques, des principes, des avantages, des limites et des scénarios applicables distincts. Par exemple, l’électrophorèse sur gel et les méthodes de séparation de substrat basées sur HPLC fournissent des résultats intuitifs mais impliquent des procédures lourdes et un faible débit10,11. Les tests de polarisation de fluorescence (FP) sont confrontés à des défis pour évaluer l’activité de FEN1 en raison de l’interférence de l’autofluorescence composée ou de la diffusion de la lumière, qui affecte les signaux FP. Bien que les stratégies de contre-dépistage puissent exclure partiellement les faux positifs, environ 15 % des composés actifs primaires sont encore mal identifiés en raison d’interférences techniques12. L’utilisation combinée de paires donneur/quencher de fluorescence (par exemple, TAMRA/BHQ-2) et de la chimiluminescence AlphaScreen présente des inconvénients, tels que le coût de synthèse élevé des substrats fluorescents complexes à triple volet, limitant particulièrement leur utilité dans le criblage à grande échelle. De plus, la structure à double lambeau des substrats peut entraver une liaison optimale avec FEN1, réduisant l’efficacité du clivage enzymatique et compromettant la sensibilité de détection. De plus, cette approche s’appuie fortement sur des instruments spécialisés (par exemple, ViewLux, EnVision), ce qui limite son adoption dans les laboratoires aux ressources limitées 13,14,15. Les méthodes de détection fluorescente basées sur des nanosondes d’ADN en forme d’haltère à double rabat fonctionnalisées avec des nanoclusters d’argent (DNA-AgNCs) souffrent d’une variabilité d’un lot à l’autre en raison de leur dépendance à l’égard d’étapes de recuit précis et de nucléation in situ, ce qui entrave la reproductibilité et l’évolutivité. Des coûts élevés et des procédures longues limitent encore leur application pratique16.

Dans cet article, un test basé sur le marquage par fluorescence est développé pour répondre aux limites techniques actuelles et répondre à la demande croissante de méthodes plus sûres et accessibles à l’utilisateur pour étudier l’activité de FEN1. Cette technique tire parti de la spécificité et de la haute sensibilité de la détection par fluorescence, ainsi que de la capacité de concevoir des substrats d’ADN avec des structures définies qui peuvent être reconnues et clivées par FEN1 (Figure 1). Cette méthode simplifie les procédures expérimentales tout en maintenant une grande précision dans l’évaluation de l’activité des nucléases FEN1. Par rapport aux techniques traditionnelles d’électrophorèse sur gel et de HPLC, il offre un fonctionnement simplifié et un délai d’exécution plus rapide. Contrairement aux tests de polarisation de fluorescence, cette approche permet un criblage qualitatif rapide des composés, établissant ainsi une stratégie efficace d’évaluation enzymatique préliminaire.

Cette méthode convient à l’étude de l’activité des nucléases FEN1 en laboratoire où l’accès aux matières radioactives est limité. Il est également bien adapté au criblage d’un grand nombre d’inhibiteurs à petites molécules dans un délai relativement court, en particulier lorsqu’une sensibilité et une spécificité élevées sont requises. Cependant, il n’est pas idéal pour les études nécessitant une quantification absolue avec une très grande précision ou pour les laboratoires manquant d’équipement de détection de fluorescence de base et d’expertise dans l’analyse du signal de fluorescence. Pour les études axées sur des applications in vivo , où le comportement de FEN1 peut être influencé par des facteurs biologiques complexes non reproduits dans les conceptions d’essais in vitro actuelles, des améliorations supplémentaires ou des méthodes alternatives peuvent être nécessaires.

Ce test de fluorescence est très sensible et spécifique, fournissant un outil sûr, pratique et efficace pour étudier l’activité de FEN1 et développer ses inhibiteurs.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Purification de l’expression de la protéine FEN1

  1. Purification des protéines
    1. Retirez le stock bactérien contenant le plasmide cible (voir le tableau des matériaux) à -80 °C. Décongeler à température ambiante et inoculer 200 μL des tubes de microcentrifugation congelés de 1,5 mL dans un milieu de 20 μg/mL contenant 50 μg/mL de kanamycine à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
      REMARQUE : La souche est E. coli BL21(DE3)-FEN1.
    2. Incuber à 37 °C avec agitation à 160 tr/min pendant 12 h.
    3. Transvaser la suspension bactérienne dans un erlenmeyer de 200 mL contenant du milieu LB complété par 50 μg/mL de kanamycine. Poursuivre l’incubation à 37 °C en agitant à 160 tr/min pendant 2-3 h.
    4. Lorsque la DO600 de la culture atteint environ 0,6, ajouter 2 mL d’IPTG (concentration finale : 1 mM). Poursuivre l’incubation à 25 °C, 160 tr/min pendant 10 h.
    5. Transférez la culture induite dans un tube à centrifuger de 50 mL pré-pesé. Centrifuger à 4 °C et 2500 × g pendant 15 min. Jetez le surnageant. Pesez le tube contenant les granulés et soustrayez le poids du tube vide pour calculer la masse des granulés.
    6. Ajouter 7 ml de tampon de lyse par gramme de pastille de cellule humide. À l’aide d’une pipette, remettez complètement la pastille en suspension en la pipetant de haut en bas.
      REMARQUE : Le tampon de lyse (10 mL au total) contient 20 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 2 % de Triton X-100 et de ddH2O. Effectuez cette étape dans une hotte pour assurer une manipulation sûre des réactifs chimiques.
    7. Transférez la suspension bactérienne dans le tampon de lyse dans un congélateur à -80 °C et congelez toute la nuit. Le lendemain, décongeler la suspension sur un agitateur à 4 °C pendant 1 h pour améliorer l’efficacité de la lyse.
    8. Lyser les cellules à l’aide d’ultrasons à 75 % de puissance pendant 45 min. Centrifuger le lysat à 12 000 × g pendant 20 min à 4 °C pour séparer le surnageant de la pastille.
      REMARQUE : Si le lysat reste trouble, augmentez le volume du tampon de lyse ou répétez les cycles de congélation-décongélation. Un inhibiteur de nucléase peut également être ajouté pour préserver l’intégrité de la protéine et prévenir la dégradation.
    9. Appliquez le surnageant clarifié le long de la paroi d’un tube contenant de la résine de purification des protéines préparée. Laver avec 10 ml de tampon d’élution pour éliminer les protéines non spécifiquement liées.
      REMARQUE : Le tampon d’élution contient 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM de NaCl, 2 % de Triton X-100, 200 mM d’imidazole et de l’eau distillée.
    10. Éluer la protéine FEN1 en ajoutant 5 mL de tampon d’élution le long de la paroi interne du tube.
  2. Identification de protéines cibles par coloration rapide au bleu brillant de Coomassie
    1. Préparez les gels SDS-PAGE en utilisant 12 % de gel séparateur et 5 % de gel empilable selon la taille prévue de FEN1.
    2. Mélangez l’échantillon de protéines cible et l’étalon BSA avec un tampon d’échantillon de 5× dans un rapport de 1:4. Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines.
    3. Chargez 20 μL chacun des échantillons de protéines standard BSA et de protéines dénaturées dans des puits séparés du gel SDS-PAGE.
    4. Connectez l’appareil d’électrophorèse. Réglez la tension sur 90 V et faites fonctionner pendant 1 h et 40 min.
    5. Après l’électrophorèse, transférez le gel dans un récipient de coloration. Rincer à l’eau déminéralisée, puis ajouter 30 mL de solution de coloration protéique et colorer pendant 25 min. Récupérez la solution de coloration, rincez le gel avec 20 ml d’eau déminéralisée et décolorez pendant la nuit sur un agitateur horizontal.
    6. Après la décoloration, placez le gel sur une plaque en plastique transparent et observez les bandes protéiques sous lumière blanche.
      REMARQUE : Si les bandes sont faibles ou si la concentration en protéines est faible, concentrez l’échantillon à l’aide de tubes d’ultrafiltration. Cette étape élimine l’excès de solvant et les petites molécules, améliorant ainsi la concentration des protéines et garantissant une analyse précise dans les expériences ultérieures.

2. Préparation du substrat d’ADN marqué FEN1 TAMRA

  1. Préparation de substrat d’ADN marqué par TAMRA
    1. Concevoir des brins d’oligonucléotides d’ADN en fonction de l’activité de clivage spécifique de FEN1, en se référant aux méthodes publiées17 (voir Tableau 1). L’extrémité 5' de la séquence D1 est modifiée avec un marqueur fluorescent TAMA.
    2. Ajoutez des oligonucléotides d’ADN simple brin mélangés à 10 μL de tampon de recuit dans les volumes suivants : 5 μL de D1 (10 pmol/μL), 10 μL de T1 (10 pmol/μL) et 7,5 μL de U2 (10 pmol/μL). Ajouter de l’eau déminéralisée pour porter le volume total à 50 μL.
      REMARQUE : Le tampon de recuit contient 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 10 mM de MgCl2.
    3. Chauffer le mélange réactionnel dans un bain métallique à 100 °C pendant 1 min, puis le transférer immédiatement à 72 °C pendant 10 min18.
      REMARQUE : Le substrat final de l’ADN a une longueur de 80 nucléotides. La température initiale élevée (100 °C) assure la dénaturation, tandis que la température de recuit (72 °C) favorise un appariement précis des brins.
    4. Éteignez la source de chaleur et laissez la solution refroidir progressivement à température ambiante, formant ainsi le substrat complet d’ADN double brin.
  2. Essai de substrat d’ADN marqué par TAMRA
    1. Préparez un gel de polyacrylamide dénaturant à 12 % en mélangeant 4,8 ml d’acrylamide à 30 % (29:1), 4,32 ml d’urée 6 M, 2,4 ml de 5× TBE, 50 μL d’APS à 10 %, 5 μL de TEMED et 0,48 mL d’eau déminéralisée. Mélangez bien pour préparer le gel.
    2. Placez le gel dans un four à 37 °C pendant 30 min pour qu’il se solidifie.
    3. Pour la détection, pipeter 2 μL du substrat d’ADN synthétisé dans 18 μL d’eau distillée et ajouter 7,7 μL de tampon d’arrêt.
    4. À titre de référence, pipetez 2 μL de D1 marqué TAMRA dans 18 μL d’eau distillée et ajoutez 7,7 μL de tampon d’arrêt.
    5. Chargez 20 μL de chaque échantillon préparé sur le gel et effectuez une électrophorèse SDS-PAGE pour analyser la formation du substrat d’ADN.

3. Dosage de l’activité des nucléases FEN1

  1. Dosage de l’activité enzymatique de FEN1
    1. Préparez 20 μL de mélange réactionnel en combinant 2 μL de substrat d’ADN avec la nucléase FEN1 dans le tampon réactionnel.
      REMARQUE : Le tampon réactionnel se compose de 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), de 200 mM de MgCl2, de 2 mM de DTT, de 0,2 mg/mL de BSA et d’eau déminéralisée.
    2. Incuber le mélange réactionnel à 37 °C dans un bain métallique pendant 15 min.
    3. Terminez la réaction en ajoutant 20 μL de tampon de terminaison 2×.
    4. Chargez 20 μL de l’échantillon ayant réagi sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12 % préparé à l’avance et effectuez une électrophorèse à 100 V pendant 60 min.
    5. Après l’électrophorèse, visualisez les résultats à l’aide d’un système d’imagerie par fluorescence (voie 600).

4. Criblage de petites molécules inhibitrices de la nucléase FEN1

  1. Criblage d’inhibiteurs de petites molécules
    1. À l’aide d’une pipette, transférez 2 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
    2. Ajouter 2 μL de nucléase FEN1 et 10 μL de tampon de réaction 2× dans le tube.
    3. Bien mélanger et incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min.
    4. Ajouter 2 μL de substrat d’ADN et 4 μL d’eau désionisée, bien mélanger pour porter le volume total de réaction à 20 μL.
    5. Préparer une dilution fonctionnelle de l’inhibiteur de nucléase FEN1, FEN1-IN-4, en effectuant une dilution en série double d’une solution mère de 1 M dans du DMSO.
    6. Pipeter 2 μL de nucléase FEN1 (0,03 μg/μL) et 2 μL de l’inhibiteur dilué de FEN1-IN-4 dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ajouter 10 μL de tampon de réaction 2× et 4 μL d’eau déminéralisée. Mélangez doucement et incubez sur de la glace pendant 10 min pour assurer une interaction suffisante entre l’inhibiteur et l’enzyme.
    7. Ajoutez 2 μL de substrat d’ADN dans le tube pour former un mélange réactionnel final de 20 μL.
    8. Incuber la réaction à 37 °C dans un bain métallique pendant 15 min.
    9. Terminez la réaction en ajoutant 20 μL de tampon de terminaison 2×.

5. Évaluation du pouvoir inhibiteur de la petite molécule inhibitrice de FEN1--IN-4

  1. À l’aide d’une micropipette, prélever 10 μL de tampon de réaction 2× et l’ajouter à un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  2. Ajouter 2 μL de nucléase FEN1 à une concentration de 0,03 μg/μL, ainsi que 2 μL d’inhibiteur de FEN1 FEN1-IN-4 à différentes concentrations.
    REMARQUE : Plusieurs gradients de concentration doivent être établis en fonction des exigences expérimentales.
  3. Ajouter 4 μL d’eau déminéralisée et bien mélanger la solution. Placez le tube de microcentrifugation de 1,5 mL sur de la glace et incubez pendant 10 min.
  4. Ajoutez 2 μL de substrat d’ADN double brin dans le tube pour former un système réactionnel de 20 μL.
  5. Placez le tube EP dans un bain métallique à 37 °C pendant 15 min.
  6. Une fois la réaction terminée, ajoutez 20 μL de tampon d’arrêt 2× au mélange réactionnel pour terminer la réaction.
  7. Observez les résultats à l’aide d’un appareil d’imagerie par fluorescence et tracez la courbe IC50 19.
    REMARQUE : La quantification de l’intensité de fluorescence a été effectuée à l’aide de Fiji/ImageJ20, suivie d’une analyse statistique et d’une visualisation à l’aide d’un logiciel de graphiques et d’analyse21.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme le montre la figure 2A, le réactif de coloration se lie à la protéine, ce qui fait apparaître la protéine comme une bande bleue sur le gel. La première voie contient la protéine marquée utilisée comme référence de poids moléculaire, dans laquelle la bande protéique standard BSA correspond à une masse moléculaire de 70 kDa, et la bande protéique d’acide nucléique FEN1 correspond à une masse moléculaire de 45 kDa. Les résultats expérimentaux ont montré que la nucléase FEN1 apparaissait s...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le test d’activité des nucléases FEN1 et le criblage des inhibiteurs de petites molécules sont au cœur de la recherche sur la réparation des dommages à l’ADN et le développement du cancer. Par rapport aux techniques de radiomarquage traditionnelles, la méthode actuelle offre une alternative rentable, efficace, facile à utiliser et plus sûre. De plus, contrairement aux tests FEN1 basés sur l’éclatement de fluorescence, cette approche offre une visualisation plus intuitive du clivage du su...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par l’équipe de recherche innovante de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu pour la science et la technologie (2021), le programme du centre de recherche sur la technologie de l’ingénierie du collège professionnel du Jiangsu (2023), le programme technologique clé des projets technologiques de subsistance du peuple de Suzhou (SYWD2024099), le projet du laboratoire clé d’État de médecine et de protection contre les radiations, l’Université Soochow (GZK12023013), les programmes du collège de santé professionnelle de Suzhou (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205), et le projet Qing-Lan de la province du Jiangsu en Chine (2021, 2022).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 M Tris-HCLBeyotimeST774
30 % Acr-Bis (29:1)BeyotimeST003-500ml
5M NaclBeyotimeST347
BeyoBlue PlusBeyotimeP0003S
BL21(DE3)-FEN1VazymeRéf. C504-F1
BSABeyotimeRéf. P0007
Shaker décolorantKylin-BellLe TS-100
DL-DithiothreitolBeyotimeST041
Incubateur à bain secRUICHENGDH200
Appareil d’électrophorèseBei jing Liuyi BiotechnologieDDY-6D
FEN1-EN-4TargetMOLRéf. T8545
L’IPTGTakaba9030
Slufate de KanamycineBiosharpNorme BS152
Centrifugeuse de laboratoireThermoSL 16R
Bouillon LBSolarbioN° L8291
Ni-NTA Sa Résine De Liaison7SE BiotechPANF001-001C
Odyssey FCODYSSÉELI-COR
PAGE DE DONNÉES DE SÉCURITÉBeyotimeP0015L
Trition-x-100ShyuanyeRéf. S15022

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

D tection par fluorescencer paration des dommages l ADNlectrophor se sur gelclivage du substrat d ADNbiomarqueur du cancercriblage haut d bitADN double brincriblage d inhibiteurs

Articles connexes