Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

Summary

La mise en œuvre d’une technique de photoirradiation polyvalente et peu coûteuse avec la méthode manuelle IBEX permet une imagerie optimale des tissus humains avec une autofluorescence native significative. Ce protocole détaille comment obtenir des images multiplexées de lames entières à partir d’échantillons cliniques archivés à l’aide d’un microscope inversé, de réactifs largement disponibles et d’un logiciel open source pour l’alignement et le traitement des images.

Abstract

La prévalence des maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses (MNT) a augmenté à l’échelle mondiale. Bien que la maladie pulmonaire induite par les MNT se manifeste souvent par une bronchectasie, des nodules pulmonaires et une maladie cavitaire, la réponse de l’hôte associée à ces types distincts de lésions pulmonaires n’a pas été bien caractérisée in situ. Nous avons cherché à évaluer les mécanismes de la pathologie induite par les MNT en effectuant une analyse phénotypique approfondie des populations de cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire d’individus atteints de maladie à MNT par rapport à un étalon-or de l’inflammation granulomateuse, la maladie pulmonaire tuberculeuse (TB).

Des blocs pulmonaires fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) de patients atteints de MNT disséminés, de MNT pulmonaires ou de tuberculose pulmonaire ont été sectionnés et colorés selon une version modifiée de la méthode d’imagerie IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity). L’optimisation de la méthode IBEX a d’abord été nécessaire pour traiter la fluorescence endogène significative des sections pulmonaires due à la forte densité de collagène, d’élastine et d’érythrocytes natifs du tissu pulmonaire qui est aggravée par la conservation du FFPE et l’âge des blocs FFPE. Dans ce protocole, nous détaillons un protocole de photoirradiation et une méthode de récupération d’antigène modifiée qui réduit l’autofluorescence des échantillons archivés cliniquement.

De plus, nous fournissons des conseils sur la conception de panels d’anticorps, y compris les défis courants tels que la réactivité croisée, la perte d’épitopes après photoirradiation, le chevauchement spectral entre les fluorophores adjacents et le faible rapport signal/bruit pour certaines cibles. Pour faciliter l’imagerie efficace de coupes de tissus pulmonaires entiers, les lames ont été imagées à l’aide d’un microscope à grand champ et post-traitées avec un logiciel open source afin d’améliorer la qualité de l’image. L’ensemble de ce flux de travail répond à un besoin critique en documentant la manière d’obtenir des images hautement multiplexées, haute résolution et de lames entières à partir d’échantillons difficiles à l’aide d’instruments et de réactifs largement disponibles. Au-delà de l’imagerie quantitative d’échantillons cliniques, ces techniques peuvent être appliquées à divers types d’échantillons pour surmonter les sources de fluorescence endogènes et exogènes.

Introduction

La tuberculose est l’une des principales causes de décès, avec environ 1,3 million de personnes qui meurent chaque année d’une infection tuberculeuse¹. Bien qu’elles ne soient pas aussi mortelles que la tuberculose, on a constaté une augmentation significative des infections pulmonaires et des maladies subséquentes causées par des mycobactéries non tuberculeuses (MNT) au cours des dernières années². Au niveau tissulaire, la réponse immunitaire de l’hôte à l’infection pulmonaire à Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été bien étudiée et comprend la formation de granulomes, d’agréga....

Protocol

Des coupes de tissu pulmonaire d’autopsie et de résection chirurgicale archivées ont été recueillies en vertu du protocole 09-H-0172 (NCT00943514), Histoire naturelle de la bronchectasie, au National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology. Ce protocole a été approuvé par l’IRB et les participants ont fourni un consentement éclairé.

1. Récupération automatisée de l’antigène

REMARQUE : La déparaffinisation et la récupération de l’antigène ont été effectuées à l’aide d’une plateforme de coloration de recherche automatisée (Figure 1

Results

La conception d’un panel d’imagerie basé sur des anticorps multiplexés nécessite beaucoup de temps, d’efforts et de ressources¹². Ces défis sont particulièrement prononcés lors de la conception d’un panel pour des échantillons FFPE archivés provenant de tissus hautement autofluorescents, comme décrit ici (Figure 1). Pour surmonter ces défis, nous avons d’abord identifié les fluorophores les plus brillants compatibles avec notre protocole d’inactivation des colorants (.......

Discussion

La pathologie pulmonaire clinique de la tuberculose pulmonaire est caractérisée par une inflammation granulomateuse nécrosante. La pathologie pulmonaire des MNT se produit principalement chez deux populations de patients distinctes avec deux schémas pathologiques distincts : une lésion pulmonaire isolée marquée par une inflammation granulomateuse avec oblitération bronchiolaire et formation de cavités chez les individus immunocompétents, ou une maladie nodulaire diffuse affectant

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3 % Triton-X-100	Sigma-Aldrich	Réf. T8787	Solution pour bloquer la mémoire tampon
1 % de BSA	Sigma-Aldrich	A4503	Solution pour bloquer la mémoire tampon
1 % Bloc BD Fc humain	BD Biosciences	564220	Fc Bloc requis pour le blocage de la mémoire tampon
Lampe LED 150 W	Amazone	B07VH3CVSF	Source lumineuse LED pour la photoirradiation tissulaire
1x PBS  ;	Gibco	10010-023	Solution pour bloquer les étapes de tampon et de lavage
Conteneur de stockage de 20 gallons	Amazone	B001B1C4G0	Récipient pour procédé de photoirradiation
Lampe LED RGBW flood 40 W  ;	Amazone	B08QFPJSMD	Source lumineuse RVB pour le photoirradiation tissulaire
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Kit de blocage Avidin/Biotine	Abcam	AB64212	Solution de blocage de l’avidine et de la biotine
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554714	Solution de fixation
Solution de daffilation BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Solution de déparaffinisation
BOND Solution de récupération d’épitopes 1	Leica Biosystems	NC0235529	Solution de récupération d’épitopes à base de citrate pH 6 (ER1)
BOND Solution de récupération d’épitopes 2	Leica Biosystems	NC0235530	Solution de récupération d’épitopes pH 9 à base d’EDTA (ER2)
Système de détection de recherche BOND	Leica Biosystems	NC0396648	Réactif de coloration de recherche automatisé
Colorant de recherche BOND RX	Leica Biosystems	NA	Plateforme de coloration de recherche automatisée
Solution de lavage BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Tampon de lavage
CD15	BD Biosciences	Référence 347420/AB_400298	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	Référence 50-0202-82/AB_11150959	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R& D Systèmes	FAB8165G/AB_2728839	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD45 Phycoérythrine (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135/AB_2892745	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	N° A32814/AB_2762838	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	A32787/ AB_2762830	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 715-545-020/AB_2340844	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	N° A32794/AB_2762834	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Système de coloration EasyDip	Approvisionnement des nouveaux arrivants	5300KIT	Système de coloration par glissement
Fluoromount-G	Thermo Fisher Scientific	00-4958-02	Supports de montage
Hoechst	Biotium	40046	Coloration nucléaire pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Convertisseur de fichiers Imaris x64 10.2.0	Imaris Oxford Instruments		Convertisseur de fichiers gratuit
Logiciel ImarisViewer x64 10.2.0	Imaris Oxford Instruments		Logiciel de traitement d’image gratuit
Stylo ImmEdge	Laboratoires Vecteurs	H-4000	Stylo barrière hydrophobe
Borohydrure de lithium (1 gramme)	STREM Produits chimiques	93-0397	Produit chimique pour l’inactivation du colorant, achetez de petites aliquotes de ce produit chimique (1 gramme)
Biotine Lumican	R& D Systèmes	BAF2846	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Lunettes Micro Cover	VWR	48393-241	Couvercles de diapositives en verre
Pan-cytokératine Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Système micro-ondes PELCO BioWave Pro	Ted Pella Inc	36500-230	Micro-ondes scientifique non chauffant
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	Contrôle de température entièrement automatisé pour micro-ondes scientifique
SimpleITK	Logiciels open source		Logiciel d’enregistrement et de traitement des canaux
Streptavidine Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	Réf. S11227	Réactif de marquage pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Microscope à grand champ	Microsystèmes Leica	NA	Imageur THUNDER de Leica Microsystems avec source lumineuse LED8 et logiciel LAS X (3.7.1.21655). Pour l’imagerie de fluorescence, un filtre quadribande personnalisé avec roue à filtres externe (PN : 11536075) avec deux filtres monobande supplémentaires (PN : 8118215) a été utilisé pour imager sept canaux de colorant par passe. Les raies d’excitation du filtre, dichroïque et d’émission sont (1) Cube quadribande : dichroïque à 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, pas de filtres d’excitation ou d’émission ; (2) roue à filtres externes position 1 : 434/32, position 2 : 520/40, position 3 : 585/20, position 4 : 720/60, position 5 : passage ; (3) monobande 1&mdash ; excitation 585/22, 594 dichroïque, émission 625/30 ; (4) monobande de 2 po ; 635/20 excitation, 647 dichroïque, 667/30 émission.
Nettoyant pour verres optiques Zeiss	Amazone	B00GPVQVCO	Nettoyeur d’objectif de microscope
Anticorps
Ag85B	Abcam	AB43019	IgG polyclonales de lapin, cycle 1
Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R	1A4/asm-1, cycle 1
CD4 Alexa Fluor 488	R& D Systèmes	FAB8165G	IgG polyclonales de chèvre, cycle 1
CD8 Alexa Fluor 647	BioLégende	372906	C8/144B, cycle 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologies	1064135	KP1, cycle 1
Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	N° A32814	Âne polyclonal, cycle 1
Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientific	Référence A32787	Âne polyclonal, cycle 1
Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientific	N° A32794	Âne polyclonal, cycle 1
Hoechst	Biotium	40046	Étiquette nucléaire, cycle 1
CD15	BD Biosciences	347420	MMA, cycle 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	L26, cycle 2
CD45 Phycoérythrine (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, cycle 2
Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020	Âne polyclonal, cycle 2
Biotine Lumican	R& D Systèmes	BAF2846	IgG polyclonales de chèvre, cycle 2
Pan-cytokératine Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, cycle 2
Streptavidine Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	Réf. S11227	N/A, cycle 2
Hoechst	Biotium	40046	Cycle 2
fortes
Blocking Buffer (cycle 1)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	Réf. T8787	0,3 % en volume
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	1 % en volume
Bloc BD Fc humain	BD Biosciences	564220	1 % en volume
1x PBS  ;	Gibco	10010-023	97,7 % en volume
solution de coloration d’anticorps primaire #1 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
Hoechst	Biotium	40046	1:5000
CD8 AF647	BioLégende	372906	1:10
solution de coloration primaire des anticorps #2 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD4  ; AF488	R& D Systèmes	FAB8165G	1:10
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	1:100
solution de coloration d’anticorps secondaire #1 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
Âne Anti-Chèvre AF Plus 488	Thermo Fisher Scientific	N° A32814/AB_2762838	1:100
Âne anti-Lapin AF Plus 555	Thermo Fisher Scientific	N° A32794/AB_2762834	1:100
Âne anti-Souris AF Plus 647	Thermo Fisher Scientific	N° A32787/AB_2762830	1:50
solution de coloration d’anticorps primaire #3 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD68 iF594	Caprico Biotechnologies	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
tampon de blocage sans BSA (cycle 2)  ;
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	Réf. T8787	0,3 % en volume
Bloc BD Fc humain	BD Biosciences	564220	1 % en volume
1x PBS  ;	Gibco	10010-023	98,7 % en volume
solution de coloration primaire des anticorps #4 (cycle 2)
Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD15	BD Biosciences	347420	1:30
Biotine Lumican	R& D Systèmes	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientific	50-0202-82	1:10
Pan-cytokératine AF750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	1:10
solution de coloration d’anticorps secondaire #2 (cycle 2)
Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)	Voir ci-dessus		Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
Âne anti-Souris IgM AF488	Jackson ImmunoResearch	Tél. : 715-545-020/AB_2340844	1:100
Strénavidine AF594	Thermo Fisher Scientific	Réf. S11227	1:200