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Article de méthode

Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

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DOI :

10.3791/67980

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11 juillet 2025

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1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

La mise en œuvre d’une technique de photoirradiation polyvalente et peu coûteuse avec la méthode manuelle IBEX permet une imagerie optimale des tissus humains avec une autofluorescence native significative. Ce protocole détaille comment obtenir des images multiplexées de lames entières à partir d’échantillons cliniques archivés à l’aide d’un microscope inversé, de réactifs largement disponibles et d’un logiciel open source pour l’alignement et le traitement des images.

Résumé

La prévalence des maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses (MNT) a augmenté à l’échelle mondiale. Bien que la maladie pulmonaire induite par les MNT se manifeste souvent par une bronchectasie, des nodules pulmonaires et une maladie cavitaire, la réponse de l’hôte associée à ces types distincts de lésions pulmonaires n’a pas été bien caractérisée in situ. Nous avons cherché à évaluer les mécanismes de la pathologie induite par les MNT en effectuant une analyse phénotypique approfondie des populations de cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire d’individus atteints de maladie à MNT par rapport à un étalon-or de l’inflammation granulomateuse, la maladie pulmonaire tuberculeuse (TB).

Des blocs pulmonaires fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) de patients atteints de MNT disséminés, de MNT pulmonaires ou de tuberculose pulmonaire ont été sectionnés et colorés selon une version modifiée de la méthode d’imagerie IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity). L’optimisation de la méthode IBEX a d’abord été nécessaire pour traiter la fluorescence endogène significative des sections pulmonaires due à la forte densité de collagène, d’élastine et d’érythrocytes natifs du tissu pulmonaire qui est aggravée par la conservation du FFPE et l’âge des blocs FFPE. Dans ce protocole, nous détaillons un protocole de photoirradiation et une méthode de récupération d’antigène modifiée qui réduit l’autofluorescence des échantillons archivés cliniquement.

De plus, nous fournissons des conseils sur la conception de panels d’anticorps, y compris les défis courants tels que la réactivité croisée, la perte d’épitopes après photoirradiation, le chevauchement spectral entre les fluorophores adjacents et le faible rapport signal/bruit pour certaines cibles. Pour faciliter l’imagerie efficace de coupes de tissus pulmonaires entiers, les lames ont été imagées à l’aide d’un microscope à grand champ et post-traitées avec un logiciel open source afin d’améliorer la qualité de l’image. L’ensemble de ce flux de travail répond à un besoin critique en documentant la manière d’obtenir des images hautement multiplexées, haute résolution et de lames entières à partir d’échantillons difficiles à l’aide d’instruments et de réactifs largement disponibles. Au-delà de l’imagerie quantitative d’échantillons cliniques, ces techniques peuvent être appliquées à divers types d’échantillons pour surmonter les sources de fluorescence endogènes et exogènes.

Introduction

La tuberculose est l’une des principales causes de décès, avec environ 1,3 million de personnes qui meurent chaque année d’une infection tuberculeuse1. Bien qu’elles ne soient pas aussi mortelles que la tuberculose, on a constaté une augmentation significative des infections pulmonaires et des maladies subséquentes causées par des mycobactéries non tuberculeuses (MNT) au cours des dernières années2. Au niveau tissulaire, la réponse immunitaire de l’hôte à l’infection pulmonaire à Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été bien étudiée et comprend la formation de granulomes, d’agrégats hétérogènes de lymphocytes, de cellules dendritiques, de macrophages et de neutrophiles3. Alors que l’inflammation granulomateuse est également une caractéristique fondamentale de l’immunité de l’hôte contre l’infection à MNT, les populations de cellules immunitaires et les caractéristiques spatiales de cette réponse restent sous-étudiées. Il est essentiel d’acquérir une compréhension détaillée des composants tissulaires de l’immunopathologie par rapport à la cicatrisation des plaies pour le développement de traitements (p. ex., thérapies dirigées contre l’hôte) et de stratégies thérapeutiques préventives (c.-à-d. vaccins).

Dans cette étude, notre équipe a eu accès à des échantillons cliniques rares et archivés acquis lors de résections pulmonaires ou d’autopsies de patients atteints d’une infection à Mtb ou à MNT. La majorité de ces échantillons avaient plus de 10 ans et étaient conservés sous forme d’échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE), limitant leur utilisation aux tests histologiques. Pour surmonter les limites des marqueurs de l’immunohistochimie (IHC) traditionnelle et de l’imagerie par immunofluorescence (IF), nous avons utilisé la méthode IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity), une méthode d’imagerie open source et hautement multiplexée 4,5. L’extension de la méthode IBEX à des échantillons FFPE de poumons humains a nécessité une optimisation significative en raison des niveaux élevés de fluorescence endogène, un obstacle bien décrit pour l’imagerie multiplexée basée sur les anticorps6.

Nous fournissons ici un protocole détaillé pour réduire l’autofluorescence à l’aide d’une méthode de photoirradiation optimisée pour les coupes de tissu FFPE pulmonaire 7,8. Il est important de noter que la méthode décrite ici utilise une boîte à lumière peu coûteuse et largement disponible qui peut être étendue à d’autres préparations d’échantillons à haute autofluorescence. En plus de réduire l’autofluorescence avant l’acquisition de l’image, nous fournissons des conseils sur la conception de panels d’anticorps, tels que l’appariement de marqueurs de faible abondance avec des marqueurs fluorophores brillants, l’évaluation de l’impact de la photoirradiation sur le marquage des anticorps et l’amplification avec des anticorps secondaires dans des canaux à fluorescence endogène élevée. En moyenne, nous avons traité cinq lames correspondant à une section de tissu, chacune allant de 37 à 114mm2. Enfin, nous montrons comment acquérir des images de lames entières à l’aide d’un instrument à grand champ. En résumé, ce protocole décrit l’adoption d’IBEX dans les échantillons cliniques archivés et offre en outre des conseils sur la façon de résoudre les problèmes couramment rencontrés avec l’imagerie d’échantillons hautement autofluorescents.

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Protocole

Des coupes de tissu pulmonaire d’autopsie et de résection chirurgicale archivées ont été recueillies en vertu du protocole 09-H-0172 (NCT00943514), Histoire naturelle de la bronchectasie, au National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology. Ce protocole a été approuvé par l’IRB et les participants ont fourni un consentement éclairé.

1. Récupération automatisée de l’antigène

REMARQUE : La déparaffinisation et la récupération de l’antigène ont été effectuées à l’aide d’une plateforme de coloration de recherche automatisée (Figure 1). Des travaux antérieurs ont déterminé qu’une approche de récupération d’antigène double consistant en 30 min avec une solution de récupération d’épitopes de pH 6 à base de citrate (ER1), puis 30 min avec une solution de récupération d’épitopes de pH 9 basée sur l’EDTA (ER2) donnait les meilleurs résultats d’immunomarquage pour les tissus FFPE9. Des résultats comparables peuvent être obtenus en utilisant le déparaffinage manuel et la récupération d’antigènes doubles à l’aide d’autres méthodes décrites et du soutien fourni par la communauté d’imagerie IBEX10,11.

  1. Rassemblez des lames et des fournitures automatisées de récupération d’antigènes (couvertures de lames, système de détection de recherche, solution de récupération d’épitopes à pH 6 à base de citrate (ER1), solution de récupération d’épitopes à pH 9 à base d’EDTA (ER2), etc.).
  2. Allumez l’instrument, laissez-le s’initialiser pendant 20 min, placez le bras de détection de recherche dans l’instrument et insérez les récipients de réactifs dans le fond de la machine.
  3. Ouvrez le logiciel, cliquez sur la diapositive de configuration et sélectionnez Ajouter une étude, puis créez un nouveau nom pour l’étude.
  4. Sélectionnez Ajouter une diapositive et étiquetez-la comme vous le souhaitez.
  5. Pour suivre ce protocole, effectuez un protocole de Bake et Dewax avec un protocole HIER composé de 30 min de ER1 et 30 min de ER2.
  6. Imprimez des étiquettes et placez-les sur les diapositives. Retirez le support de diapositives noir de l’instrument et placez les diapositives d’intérêt sur le support. Placez des couvercles de diapositives transparents sur chaque diapositive, remettez le support de diapositives sur l’instrument et appuyez sur le bouton situé sous le rack pour inciter l’instrument à effectuer la lecture du code-barres des diapositives.
  7. Sélectionnez play | ok et laissez la récupération automatique de l’antigène commencer avec une durée approximative de 3 h.

2. Marquage des anticorps avant la photoirradiation

  1. Une fois la récupération de l’antigène terminée, immergez les lames dans le PBS.
    REMARQUE : Certains épitopes sont sensibles à la photoirradiation et se dégradent après une exposition nocturne à la LED. Les épitopes sensibles doivent être déterminés empiriquement et, lorsqu’ils sont découverts, l’immunomarquage de ces épitopes doit avoir lieu à cette étape. Assurez-vous que la lame reste humide en tout temps après le prélèvement de l’antigène.
  2. Retirez une lame du PBS et séchez tout l’excès de PBS sur la lame à l’aide d’une lingette non pelucheuse ; Veillez à ne pas toucher le tissu. Tracez une bordure autour du tissu avec un stylo hydrophobe. Répétez le processus pour toutes les diapositives restantes. Laissez sécher la barrière hydrophobe pendant 10 min.
  3. Préparez une chambre d’humidité en plaçant une petite quantité d’eau au fond de chaque puits. Placez les lames dans la chambre d’humidité de la lame. Retirez le PBS du tissu sans toucher directement l’échantillon de tissu.
  4. Ajouter 200 μL de tampon de blocage (table des matériaux) à chaque lame. Placez la chambre d’humidité de la lame dans un micro-ondes scientifique non chauffant doté d’un mécanisme permettant de maintenir une température constante.
  5. Bloquez le marquage d’anticorps non spécifiques en exécutant le programme suivant établi précédemment4 : le programme 2-1-2-1-2-1-2-1-2, où « 2 » désigne 2 min à 100 W et « 1 » désigne 1 min à 0 W. Exécutez le programme ci-dessus une fois pour le bloquer. Si cet instrument n’est pas disponible, bloquez les coupes de tissu (5-10 μm) pendant 1 h à 37 °C comme décrit précédemment5.
  6. Créer la solution de coloration primaire des anticorps #1 (cycle 1) (table des matériaux) pendant l’incubation du tampon de blocage. Préparez les mélanges d’anticorps selon le tableau des matières. Mélangez délicatement le cocktail d’anticorps et faites tourner le mélange d’anticorps à l’aide d’une mini-centrifugeuse à 2 680 × g pendant 30 s.
    REMARQUE : Cette solution de coloration contient une dilution de 1:5000 de Hoechst qui devrait être suffisante pour la durée de l’expérience à deux cycles. Les utilisateurs peuvent avoir besoin de titrer Hoechst et d’autres anticorps pour obtenir des résultats optimaux pour leurs tissus et leur configuration d’imagerie.
  7. Retirez la chambre d’humidité Slide du micro-ondes lorsque le cycle est terminé et évacuez la solution tampon de blocage de chaque mouchoir. Ajouter 200 μL de solution de coloration des anticorps primaires #1 (cycle 1) (table des matériaux) à chaque lame. Remettez la chambre avec les lames dans le micro-ondes et exécutez le programme d’anticorps primaires pendant environ 30 minutes : exécutez deux fois le programme 2-1-2-1-2-1-2 pour le marquage des anticorps primaires.
    REMARQUE : Ici, 200 μL de solution d’anticorps primaires sont une estimation. Utilisez un volume adéquat de solution pour couvrir toute la surface de la section de tissu.
  8. Une fois l’étape de marquage des anticorps primaires terminée, lavez chaque lame avec 1 000 μL de PBS en inclinant la lame verticalement, en pipetant le PBS sur le tissu et en laissant le PBS s’écouler. Répétez cette étape 3 à 5 fois.
  9. Évacuez l’excès de PBS et fixez les lames avec du paraformaldéhyde à 1 % (PFA) pendant 10 min à température ambiante dans la chambre d’humidité.
    REMARQUE : La fixation du PFA peut masquer les épitopes, empêchant les anticorps de se lier à leurs cibles. Lors de la première mise en place d’un panel d’anticorps, nous recommandons d’évaluer l’impact d’une fixation douce (1 % de PFA pendant 10 min) en comparant le schéma de marquage de coupes de tissus traitées avec ou sans fixateur avant immunomarquage. Si un anticorps est sensible à une fixation de 1 % de PFA, déplacez cet anticorps avant l’étape de post-fixation.
  10. Lavez abondamment les lames avec 1 000 μL de PBS 3-5x. Laissez le PBS sur le tissu jusqu’à l’étape de photoirradiation.

3. Photoirradiation tissulaire

  1. Pour préparer la boîte de photoirradiation (figure 2), procurez-vous une lampe à DEL de 150 W, une lampe à DEL RGBW de 40 W, un grand contenant en plastique (d’un volume de 20 gallons [75,71 L] ou plus), 1 PBS frais et une boîte de Pétri.
  2. Placez la boîte de Pétri au centre de la lampe de 150 W et remplissez-la de 1x PBS. Utilisez un volume suffisant pour immerger les diapositives dans PBS. Effectuez le processus de photoirradiation dans la chambre froide pour minimiser la génération de chaleur des lampes.
  3. Retirez les lames de la chambre d’humidité des lames et placez-les dans une boîte de Pétri, en vous assurant que toutes les lames sont immergées dans du PBS.
  4. Placez la lampe de 40 W directement sur la boîte de Pétri, la source lumineuse faisant face aux diapositives. Assurez-vous que la lampe de 40 W est réglée sur le réglage de la lumière rouge avant de la placer.
  5. Allumez les lampes de 150 W et de 40 W. Couvrez l’installation de photoirradiation avec le couvercle du récipient en plastique. Maintenez la lampe de 40 W sur le réglage de la lumière rouge pendant 2 h, puis passez au réglage de la lumière verte via la télécommande incluse pendant les 16 h restantes.
    REMARQUE : Il est impératif d’effectuer une photoirradiation à environ 4 °C pour éviter une distorsion thermique indésirable du tissu de la lame. Point de pause : la photoirradiation peut être effectuée pendant la nuit et le protocole peut être repris le lendemain matin.

4. Marquage des anticorps après photoirradiation

  1. Retirez les lames de la boîte de Pétri et immergez-les dans 1x PBS dans un bocal Coplin, un tube conique de 50 ml ou un seau du système de coloration des lames. Préparez la solution de coloration primaire des anticorps #2 (cycle 1) (tableau des matériaux) aux dilutions recommandées (tableau 1). Utilisez 200 μL de la solution pour chaque lame.
  2. Évacuez l’excès de PBS de chaque lame individuelle avec une lingette non pelucheuse, en veillant à sécher la zone autour du tissu sans toucher le tissu lui-même. Placez les lames dans la chambre d’humidité de la lame.
  3. Appliquez doucement la solution de coloration primaire des anticorps #2 (cycle 1) et ajoutez 200 μL à chaque lame, en vous assurant que tout le tissu est couvert.
  4. Remettez la chambre d’humidité de la lame avec les lames dans le micro-ondes et exécutez le programme d’anticorps primaires pendant environ 30 minutes, comme indiqué à l’étape 2.7
  5. Lors du marquage primaire des anticorps, préparez la solution de coloration secondaire des anticorps #1 (cycle 1) (table des matériaux).
  6. Une fois le programme de micro-ondes terminé, retirez la chambre d’humidité de la lame et lavez chaque lame 3 à 5 fois avec 1 000 μL de 1x PBS.
  7. Éliminez l’excès de PBS de chaque lame individuelle avec une lingette non pelucheuse, utilisez la solution de coloration secondaire des anticorps et ajoutez 200 μL à chaque lame.
  8. Placez la chambre d’humidité de la lame dans le micro-ondes et exécutez le programme d’anticorps secondaires : Un programme 2-1-2-1-2-1-2-1-2, où « 2 » désigne 2 min à 100 W et « 1 » signifie 1 min à 0 W. Exécutez le programme ci-dessus une fois pour le marquage des anticorps secondaires.
  9. Lavez abondamment les lames 3 à 5 fois avec 1 ml de 1 PBS et évacuez l’excès de PBS de chaque lame.
  10. Ajouter la solution de coloration primaire des anticorps #3 (cycle 1) contenant des anticorps directement conjugués à chaque lame. Effectuez la coloration des anticorps à l’aide du micro-ondes ou d’un autre appareil (1 h à 37 °C) comme indiqué à l’étape 2.7.
  11. Lavez à nouveau les lames 3 à 5 fois avec 1 ml de PBS 1 fois et évacuez soigneusement l’excès de PBS de chaque lame.
  12. Ajoutez 30 μL de support de montage directement sur chaque section de tissu et placez une lamelle couvrant l’intégralité de la section de tissu. Inspectez le toboggan à la recherche de bulles d’air et poussez les bulles d’air vers le périmètre du toboggan avec une légère pression. Répétez le processus pour les lames restantes.
  13. Retirez l’excès de support de montage avec une lingette non pelucheuse et utilisez un nettoyant pour lentilles optiques pour nettoyer tout résidu restant à la surface de la lamelle. Laissez toutes les lames prendre pendant 10 à 15 minutes à température ambiante avant d’effectuer l’acquisition d’images au microscope.

5. Configuration de la microscopie et acquisition d’images

  1. Allumez le microscope à grand champ et la source lumineuse LED8 ; Lancez le logiciel. Sélectionnez l’objectif (ici, un objectif sec 20x/0,8). Placez l’appareil photo en mode 16 bits dans l’onglet de configuration . Sélectionnez les canaux requis en fonction des fluorophores présents dans les panels d’anticorps (voir le tableau 1 pour plus de conseils).
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont spécifiées pour le microscope référencé. Un microscope à grand champ équivalent avec une source lumineuse comparable et des cubes de filtre pour l’excitation et l’émission de plusieurs fluorophores et une platine de précision pourrait être utilisé.
  2. Nettoyez la lamelle avec un nettoyant pour lentille et du papier pour lentille immédiatement avant l’imagerie. Inspectez visuellement la lamelle et enlevez toute poussière ou peluche de la surface avant l’imagerie. Positionnez fermement la glissière dans le coin supérieur gauche (ou équivalent) de l’insert de platine, de sorte que le tissu soit constamment positionné dans le plan XY (critique pour l’alignement des images cycliques).
  3. Paramétrez les paramètres d’acquisition en créant un canal correspondant à chaque fluorophore inclus dans le panel d’anticorps. Sélectionnez le cube de filtre et la LED correspondants pour chaque fluorophore. Ajustez l’intensité de chaque LED et les temps d’exposition pour chaque canal. Reportez-vous au Tableau 1 pour obtenir la liste des paramètres d’image utilisés ici.
  4. Avant l’acquisition de l’image, sélectionnez le canal Hoechst et activez l’ombrage lié. Utilisez l’assistant d’ombrage lié pour définir cette option pour l’objectif sélectionné.
    REMARQUE : Ce protocole détaille comment réaliser des images de diapositives entières grâce à l’acquisition de numérisations de grandes tuiles. L’ombrage lié ou la correction de l’ombrage est nécessaire pour surmonter l’éclairage inégal sur les images en mosaïque.
  5. Dans le logiciel, cliquez sur le bouton En direct pour visualiser le canal Hoechst. Utilisez le bouton de mise au point grossier pour mettre au point la section du tissu.
  6. Sélectionnez chaque canal fluorescent et évaluez la section tissulaire pour le motif de coloration attendu pour tous les anticorps marqués par fluorescence dans le cycle.
  7. Sélectionnez Navigateur dans le logiciel. À l’aide de la fonction de canal de Hoechst et de spirale dans Navigator, cartographiez l’ensemble de la section ou de la région tissulaire d’intérêt à imager. Si plusieurs coupes de tissu doivent être imagées par lame, répétez cette étape pour créer une carte du tissu à l’aide du Navigateur.
  8. Identifiez le(s) ROI(s) à imager à l’aide du polygone, de la baguette magique ou d’autres outils de sélection de ROI dans Navigator. Dessinez soigneusement le contour du tissu pour capturer le moins de tuiles nécessaires pour couvrir le(s) ROI(s) souhaité(s). Supprimez les tuiles supplémentaires pour réduire le temps total d’acquisition.
  9. Une fois les zones d’intérêt créées, examinez et ajustez les paramètres de canal pour minimiser les pixels saturés et optimiser le rapport signal/bruit. Sélectionnez la table de recherche de la carte thermique dans la fenêtre d’affichage de l’image. Les couleurs indiquent le niveau de remplissage des pixels, tandis que les rouges, oranges, jaunes et blancs indiquent des variations d’intensité plus faciles à voir ; Les pixels bleus indiquent les pixels saturés. Pour éviter de perdre des informations et de compromettre la qualité de l’image, réduisez le temps d’exposition afin de minimiser le nombre de pixels saturés (bleus).
  10. Dans le Navigateur, utilisez l’outil Carte de mise au point pour créer une carte topographique du tissu. Définissez un point Focus Map tous les 3-4 FOV pour les grandes tuiles ou les échantillons inégaux.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour les numérisations de grandes tuiles requises pour l’imagerie de lames entières. En général, la qualité de l’image dépend du nombre de points de mise au point de la carte sélectionnés. Cependant, ce processus peut prendre beaucoup de temps, en particulier pour les numérisations de grandes tuiles.
    1. Créez des points de carte de mise au point dans l’ordre dans lequel ils seront balayés par le microscope. Pour correspondre à l’ordre de balayage des tuiles du microscope référencé, sélectionnez Points de carte de mise au point le long d’une trajectoire serpentine qui correspond à la trajectoire utilisée par le microscope.
    2. Réglez le premier point de la carte de mise au point à l’aide de la mise au point manuelle. Utilisez l’autofocus pour les points de mise au point restants. Asseyez-vous et observez pour vous assurer que la mise au point optimale est sélectionnée pour chaque point de la carte de mise au point. Ajustez manuellement les points de la carte de mise au point si nécessaire. Augmentez la portée utilisée pour trouver chaque point de la carte de focalisation pour les tissus inégaux et/ou grands.
  11. Configurez le traitement à l’aide des paramètres suivants : Small Volume Computational Clearing (SVCC) avec un indice de réfraction (RI) réglé pour correspondre au support de montage (ici, 1.4) ; Résistance réglée à 98 % et taille de caractéristique réglée à 2 000 NM pour les marqueurs à membrane ou à 3 000 NM pour les marqueurs nucléaires. Exécutez le protocole d’effacement informatique pendant l’acquisition de l’image.
  12. Démarrez l’analyse des tuiles. Notez le numéro de la tuile et maintenez les retours sur investissement constants tout au long de tous les cycles.
  13. Après l’acquisition de l’image, fusionnez les images effacées par calcul avec Mosaic Merge qui se trouve dans l’onglet Processus , avec l’option Lisse sélectionnée. Inspectez visuellement chaque image à la recherche d’erreurs d’assemblage et répétez la fusion de mosaïque avec de nouveaux paramètres si des erreurs de mosaïque sont présentes.
    REMARQUE : Des images mal alignées empêcheront l’enregistrement des images acquises de manière itérative.
  14. Si nécessaire, utilisez le module de séparation des colorants pour compenser le débordement spectral entre les canaux, comme décrit précédemment5.

6. Cycles d’inactivation du colorant, de marquage des anticorps et d’acquisition d’images

  1. Une fois l’acquisition de l’image terminée, immergez les lames dans un tube conique de 50 ml de PBS stérile 1x jusqu’à ce que les lamelles tombent. Si la lamelle ne tombe pas, passez le PBS directement sur la lame ou utilisez une pince à épiler pour retirer délicatement la lamelle.
  2. Préparez une solution de borohydrure de lithium (LiBH4) en dosant 3 à 5 mg de poudre dans un bateau de pesée en plastique. Ajouter le diH2O dans un rapport de 1:1 directement à la poudre (par exemple, 3,2 mg de LiBH4 et 3,2 mL de diH2O) et homogénéiser la solution à l’aide d’une pipette. À l’aide d’une seringue, faites passer la solution à travers un filtre de 0,2 μm dans un tube conique de 50 mL et notez la concentration et l’heure exacte à laquelle la solution a été créée. Laissez la solution incuber à température ambiante pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que de grosses bulles soient visibles dans toute la solution.
    REMARQUE : Nous recommandons d’utiliser la solution d’inactivation du colorant dans les 4 heures suivant la préparation. ATTENTION : Effectuez les étapes suivantes dans une hotte chimique et utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. Cette réaction peut produire de l’hydrogène gazeux, qui est hautement inflammable. Il est important de travailler avec de petites quantités de LiBH4 (<10 mg) à tout moment. Pour plus d’informations, regardez les vidéos tutorielles sur la façon de préparer LiBH4 en toute sécurité sur la base de connaissances IBEX10,11.
    Remplacez le flacon de LiBH4 après 4 semaines d’utilisation en raison de la diminution de l’efficacité du blanchiment après une exposition répétée à l’air. Nous vous recommandons d’acheter de petites aliquotes de LiBH4 (1 gramme).
  3. Retirez chaque lame de l’imprégnation 1x PBS, évacuez l’excès de PBS avec une lingette non pelucheuse et placez-la dans la chambre d’humidité de la lame.
  4. Traitez chaque lame non recouverte avec du LiBH4 pendant 30 minutes en pipetant la solution directement sur la lame avec un volume suffisant pour couvrir le tissu. Retirer l’ancienne solution de LiBH4 de chaque lame et la rafraîchir avec une nouvelle aliquote de LiBH4 à 10 min et 20 min à partir de la même solution mère de LiBH4 .
  5. Lavez abondamment les lames 3 à 5 fois avec 1x PBS. Utilisez des remplacements rapides de PBS, en trempant les lames pendant 1 minute par lavage.
  6. Pour obtenir une image de soustraction d’arrière-plan, placez une nouvelle lamelle sur chaque lame comme décrit aux étapes 4.12 et 4.13 et obtenez des images du tissu après l’inactivation du colorant. Créez un nouveau projet pour l’image de soustraction d’arrière-plan et répétez les étapes 5.2 à 5.14 pour acquérir l’image. Image en utilisant le même nombre de tuiles, de canaux, de paramètres de canaux et de champs de vision établis pour l’image du cycle 1. Conservez les points de la carte de mise au point dans les mêmes champs de vision, mais utilisez la mise au point automatique pour ajuster chaque point de la carte de mise au point pour cette nouvelle image.
    REMARQUE : Utilisez le canal qui contient le marqueur repère répété (Hoechst) pour identifier les structures uniques (formes nucléaires) qui sont présentes dans l’image « en direct » (image de soustraction d’arrière-plan, par exemple) et l’image précédente (cycle 1).
  7. Pour minimiser les signaux fluorescents non spécifiques des anticorps biotinylés dans le deuxième cycle d’anticorps, effectuez un blocage de l’avidine et de la biotine.
    1. Évacuez l’excès de PBS et appliquez une solution de blocage de l’avidine sur chaque lame à température ambiante pendant 15 min.
    2. Lavez les lames 3 à 5 fois avec 1x PBS et évacuez l’excès de PBS lorsque les lavages sont terminés.
    3. Appliquez la solution de blocage de la biotine sur chaque lame à température ambiante pendant 15 minutes et lavez les lames 3 à 5 fois avec 1 PBS comme à l’étape 6.7.2.
  8. Préparez un nouveau tampon de blocage sans BSA (cycle 2) (tableau des matériaux) pour
    Solution de coloration des anticorps primaires #4 (cycle 2) et solution de coloration des anticorps secondaires #2 (cycle 2).
    REMARQUE : Ces solutions ne nécessiteront pas d’albumine sérique bovine car la BSA peut compromettre l’étape de blocage de l’avidine/biotine.
  9. Diluer les anticorps primaires aux concentrations recommandées par le fabricant dans la solution de coloration des anticorps primaires #4 (cycle 2). Agitez doucement cette solution et ajoutez-la à chaque lame à l’intérieur de la chambre d’humidité, en vous assurant que le tissu est complètement recouvert de la solution d’anticorps primaire. Placez la chambre d’humidité de la lame avec les lames dans le micro-ondes et exécutez le programme d’anticorps primaires pendant environ 30 minutes, comme indiqué aux étapes 2.7-2.8.
  10. Effectuez le marquage secondaire des anticorps avec la solution de coloration secondaire des anticorps #2 (cycle 2) comme indiqué aux étapes 4.6 à 4.9. Une fois la coloration terminée, placez une nouvelle lamelle sur chaque lame comme décrit précédemment aux étapes 4.12-4.13. Replacez la lame sur la platine du microscope et repositionnez-la pour qu’elle soit dans le même plan XY que les images précédentes.
    REMARQUE : Utilisez le canal qui contient le marqueur repère répété (Hoechst) pour identifier les structures uniques (formes nucléaires) présentes dans l’image « en direct » (cycle 2, par exemple) et l’image précédente (cycle 1).
  11. Créez un nouveau projet pour l’image du cycle 2 et répétez les étapes 5.2 à 5.14 pour acquérir l’image du cycle 2. Image en utilisant le même nombre de tuiles, de canaux, de paramètres de canaux et de champs de vision établis pour l’image du cycle 1. Gardez les points de la carte de mise au point dans les mêmes champs de vision, mais utilisez la mise au point automatique pour ajuster chaque point de la carte de mise au point pour cette nouvelle image. Une fois l’image du cycle 2 acquise, passez à l’alignement de l’image ou répétez les étapes de la section 6 pour des cycles supplémentaires avec des anticorps directement conjugués. REMARQUE : Utilisez le canal qui contient le marqueur repère répété (Hoechst) pour identifier les structures uniques (formes nucléaires) qui sont présentes dans l’image « en direct » (image du cycle 2, par exemple) et l’image précédente (cycle 1). Les cycles supplémentaires nécessitent des anticorps directement conjugués car IBEX ne décharge pas les anticorps.

7. Alignement de l’image

  1. Convertissez les images brutes des fichiers .lif de sortie du microscope en fichiers .ims avec le convertisseur de fichiers gratuit et le traitement d’image avec le logiciel open source comme décrit précédemment5 et détaillé dans les vidéos de la base de connaissances IBEX10,11.
  2. Pour chaque cycle d’imagerie, modifiez le fichier et appliquez les étapes de traitement souhaitées (par exemple, nommage de canal, pseudo-coloration de canal).
    1. Effectuez une soustraction d’arrière-plan et un seuillage de canal à l’aide des fonctions d’arithmétique de canal créées pour SimpleITK afin de diminuer le signal d’autofluorescence (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      REMARQUE : Nous effectuons ces étapes sur chaque image (par exemple, cycle 1, cycle 2) avant de les aligner en une seule image composite. En effet, il est plus facile de travailler sur des images individuelles plus petites que sur des images combinées plus grandes.
  3. Élaborez une stratégie de nommage cohérente pour utiliser le logiciel d’enregistrement. Nommez les canaux avec un préfixe-séparateur-caractère-postfixe (par exemple 'Cycle1 CD8_AF647') avec un espace comme caractère séparateur pour désigner le canal dans lequel l’anticorps anti-CD8 AF647 a été utilisé dans le premier cycle.
    REMARQUE : Pour plus de détails, reportez-vous à l’extension du fichier d’aide : https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. Une fois que tous les canaux ont été correctement nommés, lancez le logiciel d’enregistrement, cliquez sur Imaris Extensions | SimpleITK | Affine.
  5. Téléchargez le fichier .ims pour chaque cycle à l’aide du bouton Parcourir à côté de Noms de fichiers. Entrez le caractère séparateur de préfixe du nom du canal. Si vous suivez l’exemple ci-dessus, tapez un seul espace, puis cliquez sur Suivant.
  6. Sélectionnez le canal d’enregistrement utilisé comme repère commun entre les cycles (par exemple Hoechst).
  7. Sélectionnez l’image fixe, l’image à laquelle les autres images seront enregistrées.
    REMARQUE : Nous vous recommandons de vous inscrire au cycle 2 des images itératives.
  8. Sélectionnez le répertoire souhaité pour le 'Fichier de sortie'. L’option Démarrer l’inscription à la résolution sera définie par défaut à la résolution maximale pour permettre l’inscription la meilleure possible. Si la puissance de calcul est limitée, réduisez ce paramètre.
    REMARQUE : Pour les données décrites ici (12-15 Go par image), nous avons utilisé une résolution maximale de 5.
  9. Cliquez sur S’inscrire pour commencer. Une fois l’inscription terminée, attendez que le bouton Rééchantillonner et enregistrer l’image combinée apparaisse, cliquez dessus et attendez que la barre de progression soit terminée.
  10. Ouvrez le fichier de sortie terminé dans le logiciel de traitement. L’image enregistrée avec toutes les informations sur les cycles et les canaux sera disponible et prête pour l’analyse ou la publication.

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Résultats

La conception d’un panel d’imagerie basé sur des anticorps multiplexés nécessite beaucoup de temps, d’efforts et de ressources12. Ces défis sont particulièrement prononcés lors de la conception d’un panel pour des échantillons FFPE archivés provenant de tissus hautement autofluorescents, comme décrit ici (Figure 1). Pour surmonter ces défis, nous avons d’abord identifié les fluorophores les plus brillants compatibles avec notre protocole d’inactivation des colorants (...

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Discussion

La pathologie pulmonaire clinique de la tuberculose pulmonaire est caractérisée par une inflammation granulomateuse nécrosante. La pathologie pulmonaire des MNT se produit principalement chez deux populations de patients distinctes avec deux schémas pathologiques distincts : une lésion pulmonaire isolée marquée par une inflammation granulomateuse avec oblitération bronchiolaire et formation de cavités chez les individus immunocompétents, ou une maladie nodulaire diffuse affectant

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Déclarations de divulgation

A.J.R. est un employé de Leica Microsystems, Inc. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du DIR/NIAID, NCI et NHLBI. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender dans le cadre d’un accord de licence institutionnel avec le NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,3 % Triton-X-100Sigma-AldrichRéf. T8787Solution pour bloquer la mémoire tampon
1 % de BSASigma-AldrichA4503Solution pour bloquer la mémoire tampon
1 % Bloc BD Fc humainBD Biosciences564220Fc Bloc requis pour le blocage de la mémoire tampon
Lampe LED 150 WAmazoneB07VH3CVSFSource lumineuse LED pour la photoirradiation tissulaire
1x PBS  ;Gibco10010-023Solution pour bloquer les étapes de tampon et de lavage
Conteneur de stockage de 20 gallonsAmazoneB001B1C4G0Récipient pour procédé de photoirradiation
Lampe LED RGBW flood 40 W  ;AmazoneB08QFPJSMDSource lumineuse RVB pour le photoirradiation tissulaire
Ag85BAbcamab43019/NAAnticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAnticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Kit de blocage Avidin/BiotineAbcamAB64212Solution de blocage de l’avidine et de la biotine
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714Solution de fixation
Solution de daffilation BONDLeica BiosystemsNC0221076Solution de déparaffinisation
BOND Solution de récupération d’épitopes 1Leica BiosystemsNC0235529Solution de récupération d’épitopes à base de citrate pH 6 (ER1)
BOND Solution de récupération d’épitopes 2Leica BiosystemsNC0235530Solution de récupération d’épitopes pH 9 à base d’EDTA (ER2)
Système de détection de recherche BONDLeica BiosystemsNC0396648Réactif de coloration de recherche automatisé
Colorant de recherche BOND RXLeica BiosystemsNAPlateforme de coloration de recherche automatisée
Solution de lavage BONDLeica BiosystemsNC0221077Tampon de lavage
CD15BD BiosciencesRéférence 347420/AB_400298Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher ScientificRéférence 50-0202-82/AB_11150959Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD4 Alexa Fluor 488R& D SystèmesFAB8165G/AB_2728839Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD45 Phycoérythrine (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAnticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificN° A32814/AB_2762838Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearchTél. : 715-545-020/AB_2340844Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificN° A32794/AB_2762834Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Système de coloration EasyDipApprovisionnement des nouveaux arrivants5300KITSystème de coloration par glissement
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Supports de montage
HoechstBiotium40046Coloration nucléaire pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Convertisseur de fichiers Imaris x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsConvertisseur de fichiers gratuit
Logiciel ImarisViewer x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsLogiciel de traitement d’image gratuit
Stylo ImmEdgeLaboratoires VecteursH-4000Stylo barrière hydrophobe
Borohydrure de lithium (1 gramme)STREM Produits chimiques93-0397Produit chimique pour l’inactivation du colorant, achetez de petites aliquotes de ce produit chimique (1 gramme)
Biotine LumicanR& D SystèmesBAF2846Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Lunettes Micro CoverVWR48393-241Couvercles de diapositives en verre
Pan-cytokératine Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Système micro-ondes PELCO BioWave ProTed Pella Inc36500-230Micro-ondes scientifique non chauffant
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Contrôle de température entièrement automatisé pour micro-ondes scientifique
SimpleITKLogiciels open sourceLogiciel d’enregistrement et de traitement des canaux
Streptavidine Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificRéf. S11227Réactif de marquage pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.
Microscope à grand champMicrosystèmes LeicaNAImageur THUNDER de Leica Microsystems avec source lumineuse LED8 et logiciel LAS X (3.7.1.21655). Pour l’imagerie de fluorescence, un filtre quadribande personnalisé avec roue à filtres externe (PN : 11536075) avec deux filtres monobande supplémentaires (PN : 8118215) a été utilisé pour imager sept canaux de colorant par passe. Les raies d’excitation du filtre, dichroïque et d’émission sont (1) Cube quadribande : dichroïque à 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, pas de filtres d’excitation ou d’émission ; (2) roue à filtres externes position 1 : 434/32, position 2 : 520/40, position 3 : 585/20, position 4 : 720/60, position 5 : passage ; (3) monobande 1&mdash ; excitation 585/22, 594 dichroïque, émission 625/30 ; (4) monobande de 2 po ; 635/20 excitation, 647 dichroïque, 667/30 émission.
Nettoyant pour verres optiques ZeissAmazoneB00GPVQVCONettoyeur d’objectif de microscope
Anticorps
Ag85BAbcamAB43019IgG polyclonales de lapin, cycle 1
Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, cycle 1
CD4 Alexa Fluor 488R& D SystèmesFAB8165GIgG polyclonales de chèvre, cycle 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLégende372906C8/144B, cycle 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, cycle 1
Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificN° A32814Âne polyclonal, cycle 1
Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificRéférence A32787Âne polyclonal, cycle 1
Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificN° A32794Âne polyclonal, cycle 1
HoechstBiotium40046Étiquette nucléaire, cycle 1
CD15BD Biosciences347420MMA, cycle 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, cycle 2
CD45 Phycoérythrine (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, cycle 2
Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Âne polyclonal, cycle 2
Biotine LumicanR& D SystèmesBAF2846IgG polyclonales de chèvre, cycle 2
Pan-cytokératine Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, cycle 2
Streptavidine Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificRéf. S11227N/A, cycle 2
HoechstBiotium40046Cycle 2
fortes
Blocking Buffer (cycle 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichRéf. T87870,3 % en volume
BSASigma-AldrichA45031 % en volume
Bloc BD Fc humainBD Biosciences5642201 % en volume
1x PBS  ;Gibco10010-02397,7 % en volume
solution de coloration d’anticorps primaire #1 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLégende3729061:10
solution de coloration primaire des anticorps #2 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD4  ; AF488R& D SystèmesFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
solution de coloration d’anticorps secondaire #1 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
Âne Anti-Chèvre AF Plus 488Thermo Fisher ScientificN° A32814/AB_27628381:100
Âne anti-Lapin AF Plus 555Thermo Fisher ScientificN° A32794/AB_27628341:100
Âne anti-Souris AF Plus 647Thermo Fisher ScientificN° A32787/AB_27628301:50
solution de coloration d’anticorps primaire #3 (cycle 1)
Tampon de blocage (cycle 1)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
tampon de blocage sans BSA (cycle 2)  ;
Triton-X-100Sigma-AldrichRéf. T87870,3 % en volume
Bloc BD Fc humainBD Biosciences5642201 % en volume
1x PBS  ;Gibco10010-02398,7 % en volume
solution de coloration primaire des anticorps #4 (cycle 2)
Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
CD15BD Biosciences3474201:30
Biotine LumicanR& D SystèmesBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-cytokératine AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
solution de coloration d’anticorps secondaire #2 (cycle 2)
Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)Voir ci-dessusComplétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps
Âne anti-Souris IgM AF488Jackson ImmunoResearchTél. : 715-545-020/AB_23408441:100
Strénavidine AF594Thermo Fisher ScientificRéf. S112271:200

Références

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