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Écran CRISPR à l’échelle du génome pour dévoiler les gènes radiosensibles et radiorésistants

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DOI :

10.3791/67982

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23 mai 2025

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1Department of Pulmonary Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Tumor Precision Diagnosis and Treatment Technology and Translational Medicine, Hubei Engineering Research Center, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 3Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors, Zhongnan Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Une approche méticuleuse et structurée est donnée pour sélectionner les gènes résistants et sensibles des rayonnements grâce à l’application d’une méthode de criblage CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome. Ce protocole a également le potentiel de servir de cadre polyvalent pour d’autres efforts de recherche portant sur les mécanismes de résistance aux médicaments chimiques administrés cliniquement.

Résumé

Le système CRISPR-Cas9 a été exploité et transformé en un puissant outil d’édition du génome. En exploitant cette technologie, les chercheurs peuvent couper, coller et même réécrire avec précision des séquences d’ADN dans des cellules vivantes. Néanmoins, l’application de la technologie d’écran CRISPR va bien au-delà de la simple expérimentation. Il s’agit d’un outil essentiel dans la lutte contre les maladies génétiques, en disséquant systématiquement des paysages génétiques complexes, en permettant aux chercheurs de démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents aux phénomènes biologiques et en permettant aux scientifiques d’identifier et de cibler les causes profondes de maladies telles que le cancer, la fibrose kystique et l’anémie falciforme. Parmi tous, le cancer représente un formidable défi pour la médecine, stimulant les efforts d’éradication. La radiothérapie, en tant que traitement traditionnel, donne des résultats mais a des limites. Il éradique les cellules cancéreuses mais endommage également les tissus sains, provoquant des effets néfastes qui réduisent la qualité de vie. De plus, toutes les cellules cancéreuses ne répondent pas à la radiothérapie, et certaines peuvent développer une résistance, aggravant la maladie. Pour y remédier, une technologie complète de criblage CRISPR du génome entier est introduite, car elle permet l’identification efficace des gènes radiosensibles et radiorésistants, faisant ainsi progresser le domaine de la recherche et du traitement du cancer. Un dépistage CRISPR à l’échelle du génome a été effectué dans des cellules d’adénocarcinome pulmonaire exposées à l’irradiation selon le protocole décrit, grâce auquel les gènes associés à la radiorésistance et à la radiosensibilité ont été identifiés.

Introduction

L’étude des phénomènes biologiques est intrinsèquement liée à l’étude des comportements cellulaires, et à son tour, l’examen des comportements cellulaires est fondamentalement lié à l’exploration de son génome. Au fur et à mesure que la technologie moderne continue d’évoluer, les chercheurs médicaux réorientent progressivement leur attention vers la modification des comportements cellulaires via l’édition de gènes afin d’améliorer les résultats du traitement de diverses maladies. À cet égard, la technologie CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) est apparue comme un outil révolutionnaire pour l’édition du génome en raison de son application relativement simple1. Le système CRISPR-Cas9 se compose de la nucléase Cas9 et de l’ARN monoguide (ARNsg), qui reconnaît et se lie spécifiquement à la séquence d’ADN cible, guidant la nucléase Cas9 à couper à cet endroit, ce qui entraîne une cassure double brin (DSB) dans l’ADNdu génome 2,3,4. De plus, l’introduction d’autres substances peut entraîner des insertions, des délétions ou des mutations spécifiques dans le génome, permettant une édition génique ciblée.

Dans la recherche en génomique fonctionnelle, le dépistage de l’interférence ARN (ARNi) était autrefois une méthode largement utilisée pour mener des expériences de perte de fonction à grande échelle afin d’étudier les rôles des gènes dans le cancer. La technologie ARNi étudie la fonction des gènes en réduisant spécifiquement au silence les gènes cibles, aidant ainsi les chercheurs à identifier les facteurs oncogéniques critiques. Cependant, il est limité par des effets hors cible et une efficacité incomplète de l’inactivation des gènes. Les effets hors cible peuvent conduire à l’inactivation d’autres gènes non cibles, compromettant ainsi l’exactitude et la fiabilité des résultats expérimentaux 1,2. De plus, l’ARNi présente une faible efficacité d’inactivation pour certains gènes, ce qui pourrait ne pas réussir à supprimer complètement l’expression des gènes cibles. Contrairement aux cribles ARNi traditionnels, le crible CRISPR fait preuve d’une spécificité et d’une efficacité plusélevées3. Cette technologie permet non seulement l’édition précise de gènes spécifiques, mais permet également un dépistage à grande échelle à l’échelle du génome, fournissant un soutien solide à la recherche sur la fonction des gènes. La technologie d’écran CRISPR, un puissant outil d’édition de gènes basé sur le système CRISPR-Cas9, est utilisée pour cribler efficacement et dévoiler des fonctions inconnues de gènes spécifiques dans les cellules 5,6,7,8. Les chercheurs conçoivent des sgRNA par lots pour des gènes ou des régions de gènes spécifiques, et préparent les banques de sgRNA correspondantes avec précision et rigueur, en garantissant leur intégrité et leur fonctionnalité9. Ces banques d’ARNsg sont ensuite encapsulées dans des particules lentivirales, qui sont utilisées pour infecter efficacement les cellules hôtes. Après une infection réussie, les cellules infectées sont cultivées dans des conditions de dépistage définies personnellement. Lors du criblage, l’ADN génomique des cellules criblées est extrait, en maintenant des normes élevées de pureté et de quantité. Par la suite, les régions ciblées d’intérêt pour les ARNsg sont soumises à une amplification par PCR, un processus qui réplique avec précision les segments souhaités d’acides nucléiques 3,9. Enfin, un séquençage à haut débit est effectué sur les fragments d’ADN amplifiés, permettant une analyse complète et efficace des régions ciblées, fournissant ainsi des informations précieuses sur la fonction et le comportement des gènes étudiés4.

Le cancer représente une menace redoutable pour la santé humaine en tant que maladie complexe. Dans le monde entier, les chercheurs et les cliniciens déploient des efforts concertés pour démêler les mécanismes moléculaires de la cancérogenèse et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des collaborations internationales ont été établies pour accélérer l’application des résultats de la recherche fondamentale en applications cliniques, dans le but ultime d’améliorer les résultats pour les patients. Sasmal et al. ont proposé une stratégie d’assemblage bioorthogonale basée sur un système synthétique hôte-invité pour un ciblage précis des cellules cancéreuses métastatiques, ce qui a considérablement aidé des dizaines de scientifiques à faire progresser les technologies médicales. Leurs travaux de recherche exceptionnels sont caractérisés par une grande innovation et des idées uniques, apportant des contributions significatives à la communauté scientifique10. Le cancer est caractérisé par l’état tumultueux d’instabilité génomique, résultant de la régulation erratique des réponses aux dommages de l’ADN11-14. Les dommages à l’ADN comprennent les défauts mononucléotidiques, les cassures monocaténaires et les CDB. La recombinaison homologue (HR) et la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) participent à la réparation des DSB à différents stades 15,16,17. Sur cette base, la radiothérapie est apparue comme une option de traitement viable, qui utilise des rayons de haute énergie (tels que les rayons X et les rayons γ) pour irradier le tissu tumoral, causant des dommages à l’ADN dans les cellules tumorales, perturbant ainsi leur croissance et leur prolifération18. Cependant, la radiothérapie ne produit pas toujours les effets escomptés chez une proportion importante de patients atteints de cancer, résultant potentiellement de lésions des tissus paracancéreux et de limitations imposées par les caractéristiques inhérentes à la tumeur, telles qu’une faible sensibilité à la radiothérapie 19,20,21.

Théoriquement, n’importe quel type de cellule peut être utilisé pour un écran CRISPR. Cependant, le maintien d’une représentation suffisante dans les populations mutées nécessite un grand nombre de cellules de départ. Les types de cellules à faible abondance ne sont pas particulièrement adaptés au criblage à l’échelle du génome. En ce qui concerne le choix de la bibliothèque, la plupart des banques contiennent 3 à 6 ARNg par gène cible, et le maintien de la distribution de chaque ARNg au sein de la population est essentiel18. La perte de représentation due à l’enrichissement ou à l’épuisement d’ARNg spécifiques peut conduire à une distribution inégale des résultats. Pour résoudre ce problème, il peut être préférable d’opter pour des bibliothèques CRISPR disponibles dans le commerce et testées sur le marché20. In vitro Le criblage CRISPR utilisant des lignées cellulaires cancéreuses homogènes peut ne pas capturer pleinement l’hétérogénéité génétique et épigénétique des tumeurs in vivo . Bien que le dépistage in vitro ait révélé des gènes clés impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN et la signalisation autocrine induite par les radiations, il n’a pas entièrement reproduit le microenvironnement tumoral, y compris la radiorésistance induite par l’hypoxie (via les ROS, l’adaptation métabolique et l’autophagie), les effets paracrines à médiation immunitaire et la modulation des cytokines dépendante de l’ECM. Avant d’utiliser l’écran CRISPR pour explorer les gènes associés à la sensibilité ou à la résistance aux rayonnements, ces facteurs doivent être soigneusement pris en compte. À la lumière du paysage thérapeutique actuel, il est urgent d’identifier et d’étudier en profondeur les facteurs associés à la radiorésistance et à la radiosensibilité afin d’améliorer efficacement l’efficacité de la radiothérapie22. Étant donné l’avantage clé de l’écran CRISPR dans l’étude des fonctions de gènes inconnus, une technologie d’écran CRISPR du génome entier systématiquement détaillée est fournie pour identifier efficacement les gènes radiosensibles et radiorésistants.

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Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Choisir une dose appropriée de rayonnement

  1. Préparation et placage de cellules adhérentes
    1. Ajustez la densité cellulaire à 5 x 105 cellules par mL avec le milieu de culture cellulaire complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS pour le passage et la croissance cellulaire. Répartissez les cellules dans des boîtes de culture de 3,5 cm pour les radier à différentes doses. Ajouter 2 ml (1 x 106 cellules) dans chaque plat et incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Application de différentes doses de rayonnement
    1. Numérotez les boîtes de culture de 3,5 cm de 1 à 5. Utilisez le groupe #1 comme groupe témoin, les 4 autres groupes étant désignés comme groupes de traitement.
    2. Scellez les bords des plaques à 6 puits à l’aide d’une membrane d’étanchéité pour les groupes de traitement et administrez des doses de rayonnement de 2, 4, 6 et 8 Gy, respectivement. Après le traitement, remettez la vaisselle dans l’incubateur.
  3. Placage de lignées cellulaires après irradiation
    1. Préparez des plaques à 6 puits et à 96 puits. Lavez les cellules dans les boîtes de culture de 3,5 cm une fois avec du PBS, digérez les cellules en croissance logarithmique avec 0,25 % de trypsine et ajustez la densité cellulaire à 1 x 105 cellules par ml avec le milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS.
    2. Ensemencez 10 μL/puits (1 000 cellules/100 μL) dans les plaques à 6 puits à 3 répétitions pour chaque dose de rayonnement. Ajouter 2 ml de milieu complet dans chaque puits et compter après 14 jours (lorsque chaque groupe de clones a environ 50 cellules).
    3. Implantez 30 μL/puits (3 000 cellules/100 μL) dans les plaques à 96 puits à raison de 5 répétitions pour chaque dose de rayonnement. Ajouter 70 μL de milieu complet dans chaque puits et mesurer la viabilité cellulaire après 72 h.
  4. Mesure de la viabilité cellulaire
    REMARQUE : Taux d’inhibition clonogénique = 1 - (nombre de clones dans le groupe de traitement/nombre de clones dans le groupe de contrôle) x 100 %. Le test CCK-8 utilise un sel de tétrazolium soluble dans l’eau (WST-8) qui peut être réduit par les déshydrogénases cellulaires pour générer un produit de formazan jaune hautement soluble dans l’eau11. La quantité de formazan produite est directement proportionnelle au nombre de cellules viables, et sa densité optique (mesurée à une longueur d’onde de 450 nm) reflète avec précision l’activité métabolique cellulaire et l’état prolifératif11,13. Sur la base de ce principe bien établi, le test CCK-8 a été largement adopté pour diverses applications, notamment les tests de prolifération cellulaire et les tests de sensibilité aux médicaments tumoraux. Dans ce protocole, le test CCK-8 est utilisé pour évaluer systématiquement la viabilité cellulaire sous différentes doses de rayonnement.
    1. Mélangez le réactif CCK8 avec le milieu RPMI 1640 sans FBS dans un rapport de 1:9. Jeter le milieu dans les plaques à 96 puits et ajouter 100 μL du milieu contenant la CCK8 dans chaque puits.
    2. Incuber dans l’obscurité pendant 1 h et mesurer la valeur de DO à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
      REMARQUE : Taux de survie cellulaire = [(valeur DO du groupe traité - valeur DO du puits à blanc) / (valeur DO du groupe témoin - valeur DO du puits à blanc)] x 100 %
  5. Sélection de la dose de rayonnement
    1. Intégrer le taux d’inhibition clonogénique au taux de survie cellulaire afin de sélectionner une dose de rayonnement appropriée en fonction des besoins de la recherche. Choisir une dose de rayonnement avec un taux d’inhibition de 50 % pour le dépistage des gènes radiorésistants et radiosensibles.

2. Sélection de la concentration appropriée de MOI et de puromycine

  1. Placage de cellules adhérentes
    1. Ajustez la densité cellulaire à 3 x 105 cellules par mL et injectez 1 mL (3 x 105 cellules) par puits dans une plaque à 12 puits. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Infection lentivirale
    1. À l’aide d’une pipette, aspirez le milieu de la plaque à 12 puits et remplacez-le par 1 mL de milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Préparez une banque de lentiviraux CRISPR du génome entier dont la qualité a été vérifiée (les banques disponibles dans le commerce sont recommandées) et établissez un gradient de concentration logarithmique (p. ex., 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
    2. Ajouter la quantité correspondante de lentivirus à 2 μL/boîte de polybrène et équilibrer à température ambiante pendant 5 min. Versez lentement le mélange de lentivirus et de polybrène dans chaque puits, mélangez bien et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Détermination de la concentration minimale de puromycine pour la destruction cellulaire
    1. Ajuster la densité cellulaire des parents à 3 x 105 cellules/mL et inoculer 1 mL (3 x 105 cellules) par puits dans une plaque à 12 puits. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Ajouter la puromycine dans chaque puits de la plaque à 12 puits dans un gradient de concentration de 0-0,1-0,2-0,5-1-2-4-8 μM. Compter les cellules après 72 h. La concentration minimale qui tue toutes les cellules dans le puits est la concentration minimale de puromycine pour la destruction des cellules, qui sera utilisée pour le dépistage ultérieur des cellules infectées par le virus.
  4. Sélection de la puromycine après l’infection
    1. Le deuxième jour après l’infection, aspirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par 1 mL de milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Poursuivre la culture pendant 48 h.
    2. Après 72 h d’infection, remplacer le milieu existant par un milieu complet contenant la concentration minimale de puromycine pour la destruction cellulaire. Mettre en place 2 puits dans la plaque de 12 puits sans infection lentivirale comme témoins négatifs et positifs. Traitez le témoin négatif avec de la puromycine et laissez le témoin positif non traité. Poursuivre la culture pendant 72 h.
    3. Après 72 h de sélection de la puromycine, toutes les cellules parentales du témoin négatif seront mortes, tandis que les cellules parentales du contrôle positif présentent une mort minimale. Calculez le moment d’inertie de chaque puits.
      REMARQUE : MOI = (Nombre de cellules dans le groupe infecté par le virus / Nombre de cellules dans le groupe témoin positif) x 100 %. Utilisez la concentration du virus avec un MOI de ~0,3 pour le dépistage ultérieur.

3. Infection de la banque lentivirale CRISPR à l’échelle du génome

  1. Ensemencement de lignées cellulaires adhérentes
    1. Ajustez la densité cellulaire à 1 x 107 cellules par mL dans le milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS pour le passage et la croissance cellulaire. Inocutionner 1 mL de cellules (1 x 107 cellules) dans chaque boîte de culture de 15 cm à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 8 h. Une fois que les cellules ont adhéré et ont atteint une confluence de 70 % à 80 %, elles étaient prêtes pour l’infection virale (ce qui fait un nombre de copies d’environ 500).
  2. Infection lentivirale
    1. Aspirez le milieu des boîtes de culture de 15 cm et remplacez-le par 15 mL de milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Préparez une banque de lentiviraux CRISPR du génome entier dont la qualité a été vérifiée.
    2. Ajouter la quantité correspondante de lentivirus avec le MOI = 0,3 à 30 μL/boîte de polybrène et équilibrer à température ambiante pendant 5 min, verser lentement le mélange de lentivirus et de polybrène dans les boîtes de culture de 15 cm, bien mélanger et incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit. En même temps, préparez une boîte de culture de 15 cm avec la cellule parentale en contraste.
  3. Sélection de la puromycine après l’infection
    1. Le deuxième jour après l’infection virale, aspirer le milieu des boîtes de culture de 15 cm et le remplacer par 15 mL de milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Poursuivre la culture pendant 48 h.
    2. 72 h après l’infection, remplacer le milieu par un milieu complet contenant la concentration létale minimale de puromycine. Traitez les cellules parentales non infectées comme un témoin négatif de la même manière et poursuivez la culture pendant 72 h. Après 72 h de sélection de la puromycine, les cellules parentales du groupe témoin négatif seront toutes tuées, et les cellules survivantes de l’infection lentivirale sont considérées comme infectées avec succès.
  4. Extraction du génome du jour 0
    1. Digérer les cellules d’une boîte de culture de 15 cm avec de la trypsine à 0,25 %, les remettre en suspension dans un milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et compter le nombre de cellules. Étiquetez cet échantillon comme Jour 0.
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min (à température ambiante) et jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS, centrifuger à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Extrayez l’ADN génomique du jour 0, mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV à nanogouttes.
    3. Pour la détection de l’intégrité de l’ARNsg, utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose pour analyser la banque d’ARNsg amplifiée, en s’assurant que les bandes étaient claires et qu’il n’y avait pas de dégradation significative, préservant ainsi l’intégrité de la banque23. Pour l’évaluation de la couverture de la banque de lentiviraux, utilisez la technologie de séquençage profond pour effectuer une analyse de séquençage sur les ARNsg de la banque24,25.
    4. Dans l’écran CRISPR, l’amplification PCR sert de vérification préliminaire de l’intégrité des fragments d’ARNsg et de la qualité de la banque6. Pour analyser de manière plus complète la couverture des banques et les modèles de distribution des ARNsg, et pour assurer une représentation adéquate des ARNsg pour chaque gène cible lors du dépistage, effectuez un NGS pour obtenir des informations approfondies sur la robustesse du criblage9.
      REMARQUE : En détectant les changements dans l’abondance des ARNsg avant et après le criblage, et en identifiant l’intégration potentielle hors cible de l’ARNsg ou la contamination de la banque, la précision et la fiabilité du criblage CRISPR pourraient être encore améliorées. Ces échantillons du jour 0 servent de contrôles négatifs cruciaux et font l’objet d’une évaluation complète de la qualité par amplification PCR et NGS pour atteindre 2 objectifs clés : (1) la confirmation de l’épuisement des gènes essentiels (indiquant une représentation adéquate de la bibliothèque), et (2) la démonstration de l’expression stable dans les gènes non essentiels (établissant des conditions expérimentales de base)9.
    5. S’assurer que la couverture atteint le niveau attendu pour assurer la diversité et la représentativité de la bibliothèque et éviter les biais dans le processus de sélection. Pour mesurer l’efficacité de l’infection, utilisez l’imagerie par fluorescence pour évaluer l’efficacité de l’infection, en vous assurant qu’elle répond aux exigences de l’expérience.

4. Application du rayonnement comme condition de dépistage

  1. Groupement
    1. Ajustez la densité des cellules infectées par CRISPR à 1 x 107 cellules par ml et injectez 1 ml dans chaque boîte de Pétri de 15 cm. Incuber toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Radiothérapie
    1. Divisez au hasard les cellules en 2 groupes : un groupe de traitement et un groupe témoin, avec 6 plats par groupe. Administrer une dose appropriée de rayonnement aux cellules du groupe de traitement, tout en laissant les cellules du groupe témoin non traitées se propager normalement. Après la radiothérapie, poursuivre l’incubation à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 7 jours.
    2. Au cours de la deuxième semaine, répéter l’administration d’une dose appropriée de radiation aux cellules du groupe de traitement, en laissant les cellules du groupe témoin non traitées et en leur permettant de se propager normalement. Après la radiothérapie, continuer l’incubation à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 7 jours supplémentaires.

5. Extraction et séquençage du génome

  1. Extraction du Jour 14
    1. Après 14 jours de traitement, digérer les cellules des groupes de traitement et de contrôle avec de la trypsine à 0,25 %, les remettre en suspension à l’aide d’un milieu RPMI 1640 complet contenant 10 % de FBS et les étiqueter comme Day 14-RT ou Day 14-NC.
    2. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS, centrifuger à 300 x g pendant 5 min et jeter à nouveau le surnageant. Extrayez l’ADN génomique du jour 14 et détectez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide de la spectroscopie d’absorbance UV nanodrop.
  2. Amplification par PCR
    1. Préparez les amorces correspondantes de la séquence (voir tableau des matériaux) et diluez-les à 10 μM.Mettez en place un système de réaction de 20 μL en ajoutant les réactifs dans un tube de microcentrifugation stérile, centrifugez pendant 5 s à 300 x g et mélangez bien. Réglez les paramètres de l’instrument PCR en fonction de la condition d’amplification pour obtenir des produits PCR.
  3. Détection par électrophorèse sur gel d’agarose
    1. Préparez une plaque de coulée de gel, scellez les bords du moule avec de l’agarose, insérez le peigne et préparez un gel d’agarose de concentration appropriée en fonction de la longueur de l’ADN de l’échantillon.
    2. Pesez avec précision une certaine quantité de poudre d’agarose, ajoutez une quantité appropriée de tampon d’électrophorèse, mélangez bien et chauffez au four à micro-ondes pour faire fondre. Après avoir légèrement refroidi, ajoutez une quantité appropriée de colorant d’acide nucléique, mélangez doucement et versez lentement dans le moule de coulée de gel. Laisser le gel se solidifier pendant 30 min.
    3. Retirez le peigne et ajoutez une quantité appropriée de tampon d’électrophorèse dans le réservoir d’électrophorèse jusqu’à ce qu’il recouvre le gel. Ajoutez une quantité appropriée de tampon de chargement à l’échantillon d’ADN, mélangez bien et utilisez une pipette pour ajouter lentement le mélange à l’échantillon.
    4. Réglez la tension appropriée en fonction de la taille du fragment d’ADN et de la concentration du gel d’agarose. Après l’électrophorèse, retirez délicatement le gel et placez-le dans un imageur de gel pour observer les résultats et vérifier si l’amplification PCR a réussi.
  4. Séquençage Illumina
    1. Collectez l’ADN génomique des trois groupes (groupe du jour 0, groupe de contrôle et groupe de traitement) et envoyez-le à une entreprise pour la construction de la bibliothèque et le séquençage Illumina. Effectuer une analyse bioinformatique et une visualisation des résultats de séquençage pour obtenir des gènes sensibles et résistants à la radiothérapie26.
    2. Mettre en place plusieurs expériences répétées pour l’analyse des données et effectuer une analyse statistique des résultats expérimentaux pour assurer la cohérence et la reproductibilité des données27,28.
  5. Évaluation de la qualité des données de séquençage
    1. Soumettre les données brutes à des mécanismes rigoureux de filtrage et de contrôle de la qualité pour garantir la précision des informations de séquençage5. Calculez le score Phred (Qphred) pour chaque nucléotide en fonction du taux d’erreur de séquençage, à l’aide d’un algorithme de conversion spécifié et d’un modèle qui évalue la probabilité qu’une erreur se produise lors de l’appel de base28.
    2. Maintenir le taux d’erreur de séquençage pour chaque position de base en dessous de 1 % (ce qui équivaut à un seuil Q30) et s’assurer qu’au moins 80 % des données de séquençage atteignent cette norme Q30 pour appuyer les procédures analytiques ultérieures.
  6. Traitement des données et contrôle de la qualité au niveau de l’échantillon
    REMARQUE : Pour plus de détails, veuillez vous référer aux rapportspubliés précédemment 29,30.
    1. Alignez les lectures filtrées des données de séquençage avec les séquences de la bibliothèque sgRNA. Rapports statistiques : y compris le nombre d’ARNsg dans la banque avec un alignement parfait, l’abondance moyenne des ARNsg, le nombre d’ARNsg non détectés et la proportion de lectures d’échantillons individuels mappés avec succès à la banque d’ARNsg. Utilisez un rapport de mappage plus élevé pour indiquer une plus grande couverture.
    2. Comptez l’enrichissement des lectures pour chaque gène (ciblé par différents ARNsg) dans chaque échantillon. Normalisez les lectures de support pour chaque ARNsg dans les échantillons à l’aide de la méthode de normalisation « médiane » de MAGeCK. Effectuez un contrôle qualité au niveau de l’échantillon en évaluant la distribution du nombre de lectures d’ARNsg, en générant des boîtes à moustaches, en effectuant une analyse en composantes principales (ACP) et en construisant des cartes thermiques de corrélation.
    3. Supposons que le nombre de lectures d’ARNsg suive une distribution de Poisson. Représenter le nombre normalisé d’ARNsg de différents groupes dans des boîtes à moustaches pour visualiser la distribution globale des données dans les échantillons et comparer les distributions entre les groupes.
    4. Utilisez l’ACP pour simplifier l’analyse des données en reflétant les différences entre les composantes principales et le taux de variation au sein de chaque composante, facilitant ainsi l’observation des variations intra et intergroupes. Utilisez une carte thermique de corrélation pour illustrer les relations entre les échantillons.
  7. Analyse de base
    1. Effectuer une analyse différentielle des ARNsg entre les groupes et identifier les gènes essentiels après le contrôle de la qualité et le traitement préliminaire des données. Effectuer une analyse d’enrichissement fonctionnel des gènes pertinents30. Classez les gènes essentiels en fonction du score d’agrégation de rang robuste (RRA) calculé par MAGeCK ou d’autres méthodes statistiques telles que MLE, un score RRA plus faible indiquant une importance plus élevée.
    2. Utilisez le langage R ou d’autres langages de programmation pour effectuer une analyse bio-informatique sur les résultats classés, et visualisez les résultats à l’aide des diagrammes d’analyse GO et KEGG30. Lier des gènes ou des protéines à des termes GO correspondants (fonction moléculaire, processus biologique et composant cellulaire) par le biais de la cartographie d’identification ou de l’annotation de séquences.
    3. Utilisez KEGG comme base de données pour comprendre les fonctions de haut niveau et les systèmes biologiques, en reliant le catalogue de gènes identifié aux fonctions du système aux niveaux cellulaire, de l’espèce et de l’écosystème. Sélectionnez les 10 ou 20 premiers chemins à partir des analyses GO et KEGG pour un affichage intuitif des directions des chemins.

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Résultats

Le cancer du poumon, avec le taux de mortalité le plus élevé, représente une maladie médicale très agressive et répandue. En utilisant la lignée cellulaire du cancer du poumon A549 comme exemple pour réaliser un dépistage CRISPR à l’échelle du génome avec le rayonnement comme condition de dépistage, le flux de travail schématique est illustré à la figure 1. Tout d’abord, explorez la sensibilité des cellules A549 à différentes doses de rayonnement par la formation de clones et les expériences...

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Discussion

En tant que technologie d’édition génomique de pointe, l’écran CRISPR a déclenché de profonds changements dans le domaine de la recherchescientifique5. Issue du système CRISPR-Cas9, cette technologie est devenue un outil essentiel pour l’étude des fonctions des gènes en raison de sa grande efficacité et de sa précision9. Le principe d’ingénierie CRISPR/Cas9 implique la conception et l’introduction d’ARNsg spécifiques avec environ 20 nucléot...

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Remerciements

Cette étude a été soutenue par le Projet régional d’innovation scientifique et technologique de la province du Hubei (2024EIA001) et le Projet de soutien à la construction de la plateforme d’innovation en sciences et technologies médicales de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (PTXM2025001). La figure 1 a été créée à l’aide de Figdraw.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de culture cellulaire et tissulaire de 150 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.715011Boîte
de culture cellulaire 35 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.706011Culture cellulaire
A549 lignée cellulaireATCC--
Kit de comptage cellulaire-8Shanghai Beyotime Biotech IncC0041Pour le test de viabilité cellulaire
CO2-indépendant PHCbiMCO-50AICCulture cellulaire
Countess 3 FL compteur de cellules automatiséThemo ScientificAMQAF2001Pour le comptage cellulaire
EDTAGibco25200056Culture cellulaire
Sérum fœtal bovinGibco10099141Culture cellulaire
Microscopie à fluorescenceLEICAebq 100-04Pour microscope à fluorescence
Bibliothèque lentivirale CRISPR à l’échelle du génomeShanghai OBiO Technology Co., Ltd.H5070Pour l’infection lentivirale
MiniAmp plus PCRThemo ScientificC37835Pour l’amplification PCR
Plaques de culture cellulaire NEST, 12 puitsWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.712002Plaques
culture cellulaire NEST, 6 puitsWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.703002Plaques
culture cellulaire NEST, 96 puitsWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.701001Culture cellulaire
PBSGibcoC10010500BTde culture cellulaire
(AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Pour l’amplification PCR
PCR reverse primer (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Pour l’amplification PCR
PolybreneShanghai Beyotime Biotech IncC0351Pour l’infection lentivirale
PuromycineMCEHY-K1057Pour la sélection post-infection lentivirale
RPMI 1640 milieu de culture cellulaire Gibco23400-021Culture cellulaire
TIANGENamp kit d’ADN génomiqueBeijing TIANGEN Biotech Co., Ltd.DP304Pour l’extraction d’ADN génomique
Diffractomètre à poudre à rayons XPerkinElmerPour la radiothérapie
de de Amorce directe PCR

Références

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