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In vitro Expositions au cannabis des cellules épithéliales pulmonaires à l’interface air-liquide

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DOI :

10.3791/68102

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20 juin 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

Dans cet article

Résumé

Nous établissons un modèle in vitro standardisé pour étudier l’exposition à la vapeur de cannabis à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une approche systématique pour examiner les impacts du cannabis vaporisé, répondant ainsi à l’intérêt croissant pour les vaporisateurs de cannabis comme alternative à la fumée.

Résumé

Le cannabis est consommé par environ 192 millions de personnes dans le monde. La plupart des gens consomment du cannabis par inhalation de fumée de cannabis, qui contient des sous-produits de combustion qui peuvent nuire à la santé pulmonaire. La connaissance de ces risques a conduit à un intérêt croissant pour les vaporisateurs de cannabis, qui chauffent la fleur de cannabis sèche sans la brûler. La vaporisation du cannabis libère toujours des cannabinoïdes pour l’inhalation, mais chauffe la matière végétale à une température plus basse. Il n’existe actuellement aucun modèle in vitro normalisé pour évaluer les effets de la vapeur de cannabis sèche. Par conséquent, nous avons établi un modèle d’exposition des cultures de cellules pulmonaires à une interface air-liquide (ALI), où les cellules sont exposées apicalement au cannabis vaporisé, simulant ainsi plus précisément la physiologie des cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole garantit une distribution cohérente et reproductible de la vapeur de cannabis à la surface de la cellule, fournissant une plate-forme fiable pour étudier les impacts cellulaires et moléculaires du cannabis vaporisé. Ce travail est le premier à normaliser une méthode d’administration in vitro de vapeur de cannabis, qui peut servir de référence pour les futures recherches précliniques sur le cannabis.

Introduction

Le cannabis est généralement consommé en inhalant de la fumée provenant de la combustion de la fleur de la plante sous la forme d’un joint, que ce soit à des fins récréatives ou médicinales. Les principales activités biologiques du cannabis sont dues aux cannabinoïdes tels que le Δ 9-tétrahydrocannabinol (Δ9-THC) et le cannabidiol (CBD), qui sont libérés dans le corps lors de l’inhalation. La fumée de cannabis contient également des composés pyrogènes, notamment des agents cancérigènes, mutagènes et tératogènes, qui ont le potentiel de causer des problèmes de santé1. Compte tenu de ces préoccupations, il est intéressant de se tourner vers des vaporisateurs de cannabis qui chauffent la fleur de cannabis sans la brûler, dans l’espoir que cela permette la libération de cannabinoïdes pour une inhalation ultérieure mais sans produits de combustion. Des travaux ont été réalisés pour caractériser les composants chimiques de la vapeur de cannabis, montrant la présence de cannabinoïdes mais aussi de divers toxiques respiratoires, remettant en question l’idée que ces dispositifs sont sûrs 2,3. Il existe d’importantes lacunes dans les connaissances sur l’impact du cannabis vaporisé sur les poumons et d’autres organes.

Les études de culture cellulaire sont essentielles en toxicologie pour isoler et comprendre les effets spécifiques des substances inhalées au niveau cellulaire, ce qui permet d’obtenir des informations à haut débit, rentables et mécanistes qui sont pertinentes pour la biologie humaine. La méthode de culture des cellules est également un déterminant important des résultats globaux obtenus à partir d’une expérience in vitro . La plupart des études de culture cellulaire sont réalisées dans un environnement immergé, où les cellules sont cultivées sur du plastique et exposées apicalement à un milieu aqueux. Les cellules épithéliales des voies respiratoires, cependant, présentent un défi unique à cet égard. Dans tout le système respiratoire, la surface apicale des cellules épithéliales est en contact avec l’air. Dans les alvéoles, les cellules épithéliales produisent du surfactant, tandis que d’autres cellules épithéliales des voies respiratoires produisent du mucus ; Collectivement, cela protège et maintient la fonction pulmonaire. Les cultures submergées ne parviennent pas à reproduire l’exposition apicale à l’air, ce qui limite leur capacité à modéliser avec précision l’environnement in vivo . Une alternative aux modèles de culture submergée est la culture à l’interface air-liquide (ALI), où les cellules épithéliales respiratoires sont cultivées sur une membrane recouverte de collagène avec un milieu sur le côté basolatéral tout en étant exposées apicalement à l’air. Les cellules épithéliales cultivées à l’ALI sont des modèles plus précis de l’épithélium respiratoire en raison de leur capacité à se polariser, à produire du surfactant ou du mucus et à former des jonctions dans cet environnement4.

Une considération supplémentaire à laquelle les méthodes traditionnelles de culture cellulaire submergée sont confrontées est que les composés hydrophobes comme les cannabinoïdes se solubilisent mal dans les milieux aqueux5. Les extraits éthanoliques sont un solvant courant pour étudier les composés hydrophobes dans les cultures immergées 6,7,8,9,10,11,12. Ces extraits permettent de dissoudre les composés hydrophobes et hydrophiles dans un milieu aqueux. Cependant, le potentiel d’agglomération des composés ainsi que l’interaction des composés avec le milieu constituent une limite, ce qui peut modifier la biodisponibilité13,14. Récemment, des développements ont été réalisés pour permettre aux composés en phase aérosol d’être livrés aux cellules en l’absence de solvant ou de milieu à l’aide de systèmes d’exposition avancés tels que l’expoCube15 (système d’exposition in vitro ALI/Transwell), entre autres. Le dépôt direct d’aérosols et de suspensions de particules à l’aide d’un système d’exposition avancé élimine le processus de collecte-remise en suspension crucial pour les expositions immergées, qui est connu pour modifier considérablement les propriétés physicochimiques des particules16. Ici, nous décrivons un protocole standardisé pour l’exposition d’une lignée cellulaire épithéliale alvéolaire à l’ALI.

Protocole

1. Cultiver des cellules épithéliales pulmonaires à l’ALI

REMARQUE : Ici, un protocole de culture des cellules A549 à ALI est décrit. Veuillez consulter la littérature pour connaître le type de cellule à utiliser dans l’étude. Différentes lignées cellulaires ont besoin d’un temps différent à l’ALI pour se différencier, former des jonctions serrées et produire du surfactant/mucus.

  1. Culture cellulaire
    1. Préparez le milieu en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 5 ml de Glutamax, 5 ml d’antibiotique-antimycosique et 500 μL de gentamycine dans une bouteille de 500 ml de DMEM.
    2. Placez le milieu préparé dans un bain-marie pendant 10 à 15 minutes pour le réchauffer à 37 °C.
    3. Vaporisez l’enceinte de biosécurité avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-la. Une fois le milieu réchauffé, placez-le sous l’enceinte de biosécurité stérilisée.
    4. Sous le capot de culture, pipeter environ 10 ml de milieu dans un tube de 15 ml.
    5. Récupérez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les en les agitant doucement dans un bain-marie.
    6. Sous le capot de culture, pipeter les cellules décongelées du cryoflacon dans le tube de 15 ml.
    7. Centrifuger le tube de 15 mL à 300 g pendant 5 min.
    8. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille.
    9. Mélangez la pastille avec le support et transférez-la dans la fiole T75 .
    10. Vérifiez la fiole T75 au microscope.
    11. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 avec une humidité saturante.
    12. Rafraîchissez les milieux de culture cellulaire tous les 2-3 jours.
    13. Passez et faites croître les cellules jusqu’à ce que le nombre de cellules souhaité soit atteint. Pour ensemencer une plaque de 12 puits, 3 × 106 cellules sont nécessaires.
  2. Revêtement de collagène des transwells
    1. Préparation de la solution de collagène
      1. Dissoudre 10 mg de collagène de type IV dans 20 mL de ddH2O avec 50 μL d’acide acétique glacial.
      2. Incuber à 37 °C pendant 30 min, en remuant de temps en temps, jusqu’à dissolution complète.
      3. Stérilisez la solution en filtrant à travers un filtre de 0,22 μm.
      4. Aliquote 1,5 mL de la solution dans des tubes de 15 mL et conserver à -20 °C.
    2. Revêtement des filtres transwell avec du collagène de type IV
      1. Décongeler un tube de collagène de type IV (50 μg/mL) à -20 °C.
      2. Ajoutez 150 μL de collagène dans chaque filtre Transwell.
        REMARQUE : Seules les plaques à 12 puits sont compatibles avec le système d’exposition.
      3. Laissez sécher les plaques avec couvercle ouvert dans l’enceinte de sécurité biologique (ESB) pendant 18 h.
      4. Stérilisez en l’exposant à la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min.
    3. Conserver les assiettes à 4 °C, enveloppées dans du parafilm, jusqu’à 30 jours.
    4. Avant de placage des cellules, rincez les deux côtés des filtres avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile.
  3. Semis de cellules dans des inserts et transition vers ALI
    1. Préparation de la suspension en plaques et en cellules
      1. Pipeter 1,5 mL de milieu préparé préchauffé dans chaque puits de la plaque à 12 puits.
      2. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
      3. Préparer une suspension cellulaire d’une concentration de 5 × 105 cellules/mL dans un milieu préparé.
    2. Semis de cellules dans des inserts
      1. Retirez la plaque de culture cellulaire préparée de l’incubateur et placez-la sous une enceinte de biosécurité stérilisée.
      2. Pipeter 0,5 mL de suspension cellulaire (2,5 × 105 cellules/insert) sur le dessus de la membrane dans l’insert.
      3. Couvrez la plaque avec son couvercle et remettez-la dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
    3. Établir l’ALI
      1. Retirer le milieu apical 24 h après l’ensemencement des cellules.
      2. Remplacer le milieu basolatéral par 0,6 mL de milieu préparé. À ce stade, les cellules sont exposées apicalement à l’air, établissant l’ALI.
      3. Cultivez les cellules A549 à l’ALI pendant une période allant jusqu’à 2 semaines, en changeant de milieu tous les 2 jours pour permettre aux cellules de se différencier comme cela a été caractérisé précédemment4.

2. Évaluation par dosimétrie de l’exposition aux vapeurs de cannabis à l’aide de la LC/MS

REMARQUE : Dans cette partie du protocole, des méthodes acellulaires ont été utilisées pour caractériser la dose de vapeur de cannabis déposée dans chaque puits en analysant les concentrations de Δ9-THC. Le Δ9-THC adhère aux matières plastiques, de sorte que seuls des flacons en verre doivent être utilisés pour le prélèvement d’échantillons. Cette méthode nécessite que le cultivar de cannabis choisi contienne du Δ9-THC.

  1. Préparation et configuration du système d’exposition
    1. Configurez la tubulure du système d’exposition en fonction de la voie d’écoulement spécifiée (Figure 1A, B) : Unité ENDS > Condenseur > Pompe de soufflage > Ensemble d’échantillonnage isométrique avec pompe Aeroneb > Capteur d’humidité > expoCube avec filtre > Orifice de débit d’exposition expoCube.
    2. Activez les commandes de température pour chauffer le système à 35 °C et 50 °C.
    3. Effectuez des tests d’écoulement pour vous assurer que le système est exempt de fuites et que les pressions sont correctement réglées (reportez-vous à la note technique SCIREQ : Guide de dépannage des écoulements irréguliers dans l’expoCube).
    4. Démarrez les pompes Aeroneb pour atteindre une humidité relative supérieure à 75 %.
  2. Test de dosimétrie et préparation du vaporisateur
    1. Préparation du vaporisateur de cannabis
      1. Broyez la fleur de cannabis à l’aide d’un broyeur d’herbes.
      2. Pesez 0,25 g d’aliquotes à l’aide d’un séparateur de pilules pour organiser chaque portion.
      3. Placez les inserts en acier inoxydable dans la rangée d’exposition de la plaque de transpuits à 12 puits à l’intérieur du système d’exposition.
  3. Exposition des inserts en acier inoxydable à la vapeur de cannabis
    1. Commencer l’exposition
      1. Remplissez le four du vaporisateur avec 0,25 g de cannabis.
      2. Fixez le vaporisateur de cannabis à l’unité ENDS du système d’exposition avec un joint d’étanchéité sécurisé et commencez le régime de bouffée souhaité. Réglez le vaporisateur sur le réglage de température Smart Path Level 2 .
        REMARQUE : Le système d’exposition utilisé dans cette étude propose quatre niveaux de trajectoire intelligente, soit le niveau 1 (176-188 °C), le niveau 2 (188-199 °C), le niveau 3 (199-210 °C) et le niveau 4 (210-221 °C).
      3. Créez un profil puff dans le logiciel flexiWare (logiciel d’acquisition de données ; reportez-vous à la note technique SCIREQ : Guide de création de profils pour flexiWare 8). Pour ce protocole, utilisez une bouffée d’un volume de 70 mL avec une fréquence de 4 bouffées/min.
      4. Faites fonctionner le vaporisateur d’herbes sèches pendant 5 minutes avant de changer de cannabis en retirant la fleur de cannabis du four du vaporisateur et en ajoutant 0,25 g de cannabis frais dans le vaporisateur. Alternez entre deux vaporisateurs pour une exposition continue.
      5. Continuez les étapes 2.3.1.1 à 2.3.1.4 jusqu’à ce que le temps d’exposition souhaité soit atteint.
    2. Après chaque exposition, retirez soigneusement les inserts du système d’exposition à l’aide d’une pince à épiler et préparez-les pour le prélèvement d’échantillons comme décrit ci-dessous.
  4. Collecte et préparation d’échantillons pour l’analyse LC/MS
    1. À l’aide d’une pince à épiler, placez les filtres correspondant à chaque exposition dans un flacon en verre étiqueté contenant 10 ml de méthanol de qualité LC/MS (p. ex., exposition 1, exposition 2, exposition 3).
    2. Lavez l’insert.
      1. Placez chaque insert en acier inoxydable exposé dans un flacon en verre étiqueté contenant 10 ml de méthanol de qualité LC/MS.
      2. Étiqueter les flacons en fonction de l’exposition (p. ex., exposition 1 puits 1-4).
    3. Extrait Δ9-THC
      1. Utilisez un bain sonicateur pour soniser les flacons avec des inserts pendant 10 min afin d’extraire le Δ9-THC.
      2. Transférez les inserts dans un deuxième ensemble de flacons en verre avec 10 ml de méthanol frais et de sonicate pendant 10 minutes supplémentaires.
    4. Soumettre tous les échantillons préparés (puits, lavage et filtre) pour analyse LC/MS afin de quantifier les niveaux de Δ9-THC.
  5. Calculs de dosimétrie
    1. À l’aide des résultats de l’analyse LC/MS, calculer la quantité de Δ9-THC déposée pour déterminer la dosimétrie du flux d’exposition (quantité déposée dans le filtre) et la dosimétrie dans le puits.
    2. Calculer le rapport entre le filtre de flux d’exposition et le dépôt de puits pour le Δ9-THC.
    3. Utilisez ce rapport pour déterminer la dose qui sera délivrée aux cellules pendant les expositions.

3. Évaluation par dosimétrie de l’exposition à la vapeur de cannabis à l’aide d’une microbalance à cristal de quartz

REMARQUE : Cette méthode détaille la configuration et l’étalonnage d’une microbalance à cristal de quartz (QCM) pour évaluer la masse des particules de vapeur de cannabis déposées lors des expositions. Chaque QCM fournit des mesures en temps réel, permettant une dosimétrie précise de l’exposition à la vapeur de cannabis.

  1. Préparation et configuration du QCM dans le système d’exposition
    1. Configurez le système d’exposition comme décrit précédemment.
    2. Fixez chaque QCM à son module électronique à l’aide du connecteur à pince et connectez le module aux entrées de l’unité inExpose (plate-forme d’exposition par inhalation) à l’aide d’un connecteur à 7 broches.
    3. Placez les inserts QCM dans une plaque à puits du côté exposition du système d’exposition, en vous assurant que le QCM est bien aligné.
    4. Préchauffez le système d’exposition à l’aide des MCQ fixés jusqu’à ce que le système se stabilise aux températures cibles de 35 °C et 50 °C.
    5. Activer les microflux et les flux d’exposition en fonction des paramètres expérimentaux.
  2. Étalonnage du QCM
    1. Utilisez l’assistant d’étalonnage du logiciel d’acquisition de données pour calibrer le QCM avant chaque cycle d’exposition.
    2. Attendez que la barre d’étalonnage bleue se stabilise, puis sélectionnez Suivant pour enregistrer la fréquence de résonance QCM afin de calculer la masse avec précision.
      REMARQUE : La plage d’étalonnage prévue est de -15 % à 15 %. Les écarts peuvent indiquer des problèmes tels qu’un QCM sale ou un connecteur LEMO déconnecté.
  3. Surveillance en temps réel des signaux QCM
    1. Surveiller les sorties QCM ; Le système produit la masse accumulée déposée. La valeur est affichée dans le logiciel d’acquisition de données à la fois dans le cadre d’un graphique et de la valeur actuelle réelle.
      REMARQUE : Pour chaque essai expérimental, les dépôts maximum et minimum sont également indiqués dans le logiciel.
  4. Nettoyage du QCM
    1. Pour maintenir la précision, nettoyez le QCM après chaque expérience.
    2. Ajouter 1 mL d’alcool isopropylique à 70 % à l’intérieur de chaque insert QCM.
    3. Pipetez la solution d’alcool de haut en bas 2 à 3 fois pour dissoudre les résidus.
    4. Retirez la solution d’alcool et laissez le QCM sécher complètement à l’air libre dans un environnement sans poussière avant la prochaine utilisation.

4. Résultats de l’exposition des cellules à la vapeur de cannabis

REMARQUE : Ce protocole est conçu pour évaluer les effets de la vapeur de cannabis sur les cellules respiratoires cultivées à l’ALI à l’aide du système expoCube. Les essais post-exposition, y compris le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) et la lactate déshydrogénase (LDH), fournissent des informations sur la cytotoxicité dose-dépendante et l’activité métabolique.

  1. Livraison de vapeur de cannabis
    1. Configurez le système d’exposition comme décrit ci-dessus : Assurez-vous que le système a atteint une température de 35 °C et 50 °C et des niveaux d’humidité relative supérieurs à 75 %.
    2. Si vous utilisez un QCM, fixez l’appareil à son module électronique à l’aide du connecteur à pince et connectez le module aux entrées de l’unité d’exposition par inhalation avec un connecteur à 7 broches. Placez l’insert QCM unique dans une plaque à puits du côté exposition de l’expoCube, en vous assurant que le QCM est bien aligné.
    3. Ouvrez le système d’exposition et placez la plaque de culture cellulaire à l’intérieur.
    4. Commencer le régime de bouffées pendant la durée souhaitée en fonction de la section 2. L’utilisation du QCM permettra un suivi en temps réel de la vapeur totale déposée.
    5. Après l’exposition, retournez les cellules dans l’incubateur jusqu’au moment de l’essai souhaité.
    6. Prélevez des échantillons au besoin dans divers compartiments, y compris le compartiment basolatéral, le lavage du compartiment apical (pour le tensioactif ou le mucus) et le lysat cellulaire.
    7. Tests de sélection de dose : Utilisez les tests LDH et MTT pour aider à déterminer la dose optimale et la cytotoxicité potentielle.
  2. Dosage de la LDH pour les cellules à l’ALI
    1. Prélever les milieux : Au moment souhaité après l’exposition, prélever les milieux dans le compartiment basolatéral.
    2. Transférez 100 μL de milieu collecté dans une microplaque transparente à 96 puits.
    3. Ajouter 100 μL de mélange réactionnel de LDH fraîchement préparé dans chaque puits.
    4. Incuber la plaque à température ambiante (15-25 °C) pendant 30 min, à l’abri de la lumière.
    5. Mesurez l’absorbance à 490-492 nm, en utilisant une longueur d’onde de référence supérieure à 600 nm.
    6. Calculer la cytotoxicité à l’aide de la formule suivante :
      Cytotoxicité ( %) = (valeur expérimentale-témoin négatif)/(témoin positif-témoin négatif) x 100
  3. Dosage MTT pour cellules chez ALI
    1. Cultiver des cellules A549 à l’ALI comme établi précédemment.
    2. Après l’administration de l’exposition dans le système d’exposition, remettre les cellules dans l’incubateur jusqu’au moment du test souhaité.
    3. Dissoudre 1 mg de MTT dans 1 mL de PBS pour obtenir la solution de MTT.
    4. Ajouter 500 μL de solution de MTT sur la face apicale des cellules et 500 μL de solution de MTT sur le compartiment basolatéral.
    5. Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h.
    6. Retirez soigneusement tous les supports.
    7. Ajoutez 500 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) sur le côté apical et 1 000 μL de DMSO sur le côté basolatéral.
    8. Incuber pendant 1 h pour dissoudre les cristaux de formazan.
    9. Prélevez et combinez la solution des côtés apical et basolatéral.
    10. Mesurez l’absorbance à 540 nm (OD540) avec une référence à 690 nm (OD690).
    11. Calculez la viabilité cellulaire à l’aide de la formule suivante :
      Viabilité cellulaire ( %) = 100 × (OD_exposure moyenne/moyenne OD_negative témoin)

Résultats

Au cours des expériences avec le système expoCube, quatre puits reçoivent l’exposition à la vapeur de cannabis, quatre puits sont exposés à l’air conditionné en tant que commandes du véhicule, et les quatre autres puits sont entièrement fermés en tant que commandes négatives (Figure 1C)17. Cette configuration permet une comparaison précise entre les conditions traitées, les conditions de véhicule et les conditions négatives. Le système est humidifié pour créer un environnement adapté aux cultures cellulaires (Figure 2), et la régulation de la température à l’intérieur du système améliore le dépôt de particules par thermophorèse, ce qui permet une distribution efficace des composés vaporisés vers les cellules18. Pour quantifier l’exposition, nous mesurons la quantité de Δ9-THC en tant que marqueur du dépôt de vapeur de cannabis dans le site d’exposition de la cellule. Cette quantification est cruciale pour optimiser les temps et les doses d’exposition, ce qui permet aux chercheurs d’ajuster les périodes d’exposition active pour obtenir les doses souhaitées dans les expériences de culture cellulaire (Figure 3). En calculant le rapport entre le Δ9-THC recueilli dans le filtre à flux d’exposition et la quantité déposée dans les puits individuels, nous pouvons estimer la dose réelle délivrée aux cellules (tableau 1). Cette dose calculée informe de la plage d’exposition souhaitée, aidant à déterminer les paramètres optimaux pour étudier les réponses cellulaires à la vapeur de cannabis de manière cohérente et mesurable. Cela peut être effectué pour d’autres cannabinoïdes, en fonction du profil cannabinoïde de la variété de cannabis sélectionnée. De plus, l’analyse QCM peut être effectuée pour mesurer le dépôt de vapeur de cannabis en temps réel. La figure 4 montre le dépôt de vapeur de cannabis sur une période de 30 minutes au cours de laquelle le vaporisateur et le matériel de cannabis ont été changés toutes les 5 minutes. Chaque puits a montré une augmentation constante de la masse au fil du temps, indiquant un dépôt efficace et continu de particules entières de vapeur de cannabis.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma du système d’exposition in vitro/ex vivo d’ALI/Transwell pour l’exposition aux vapeurs de cannabis à l’ALA. (A) Le vaporisateur DaVinci MIQRO a été utilisé pour générer de la vapeur de cannabis. Cet échantillon est humidifié et acheminé à travers l’échantillonneur isocinétique jusqu’au site d’exposition. L’unité de commande permet de régler les sorties de débit d’air et les gradients de température. (B) Photographies de la configuration du système d’exposition. (C) L’intérieur de l’expoCube est compartimenté en trois rangées : une rangée de test pour l’exposition à la vapeur de cannabis, une rangée de contrôle du véhicule d’air conditionné et la rangée de contrôle négatif fermée qui reste intacte par tout flux d’air. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Profil d’humidité relative ( %) enregistré au fil du temps. Ces données montrent les niveaux d’humidité relative lorsque les Aeronebs sont activés, atteignant et maintenant une humidité moyenne de 75 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Quantification des dépôts de Δ 9-THC par analyse LC/MS après une exposition de 30 minutes à la vapeur de cannabis. (Un-C) Le dépôt de Δ9-THC a été mesuré dans chaque puits après trois expositions indépendantes à la vapeur de 30 minutes, chacune utilisant 1,5 g d’un cultivar de cannabis à haute teneur en THC. Les niveaux de Δ9-THC ont été quantifiés par LC/MS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-4
Figure 4 : Mesures QCM des dépôts de vapeur de cannabis dans le système d’exposition in vitro/ex vivo ALI/Transwell sur un régime d’exposition de 30 minutes. (A-D)Chaque graphique représente le dépôt cumulatif de particules de vapeur de cannabis dans les puits 1 à 4, avec une masse mesurée en microgrammes (μg) au fil du temps. Le taux de dépôt démontre une accumulation constante dans tous les puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dépôt du filtre à flux primaire (μg)Dépôts de puits (μg)Pourcentage de l’écoulement primaire déposé dans le puits ( %)
Exposition 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Exposition 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Exposition 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Moyenne2422.94.30.18
Écart type292.80.40.03

Tableau 1. Comparaison des dépôts de Δ9-THC dans le système d’exposition in vitro/ex vivo ALI/Transwell entre le filtre à flux d’exposition et le site d’exposition cellulaire.

Discussion

La culture de cellules à l’ALI est une méthode importante dans la recherche respiratoire en raison de sa capacité à représenter plus précisément les conditions des voies respiratoires in vivo par rapport aux cultures submergées traditionnelles19. La culture à l’ALI permet aux cellules épithéliales pulmonaires d’être exposées directement à l’air sur leur surface apicale tout en conservant les nutriments essentiels du milieu de culture du côté basolatéral. Cette configuration permet aux cellules de produire du surfactant ou du mucus, des composants clés du mécanisme de défense respiratoire qui sont essentiels pour piéger et éliminer les particules inhalées et les agents pathogènes 20,21,22. Les cellules A549 sont couramment utilisées pour les études in vitro, mais ne sont qu’une des nombreuses cultures de cellules épithéliales respiratoires qui peuvent être utilisées pour l’ALI. Silva et al. ont examiné des lignées cellulaires et des cultures primaires de l’épithélium respiratoire pour l’ALI, de la cavité nasale aux alvéoles22. La flexibilité du système d’exposition ALI présenté lui permet d’être adapté à différentes lignées cellulaires et cellules primaires.

Les cultures ALI sont de plus en plus considérées comme la « référence » pour les études d’inhalation in vitro , en particulier pour la recherche sur les polluants atmosphériques, les particules et d’autres agents inhalables23. L’un des principaux avantages des modèles ALI réside dans leur capacité à fournir des informations plus susceptibles d’être transposées aux effets humains in vivo . Cependant, un inconvénient notable est l’absence de protocoles normalisés pour l’exposition aux ALI, ce qui affecte la reproductibilité et la comparabilité entre les études. L’une des lacunes est un flux de travail d’exposition standardisé. En exposant les cellules à la vapeur de cannabis au niveau de l’ALI, les impacts du cannabis sur la fonction cellulaire, la viabilité et la cytotoxicité peuvent être évalués. Ces expositions permettent une évaluation détaillée des résultats biologiques, y compris les marqueurs de cytotoxicité, d’inflammation et de stress oxydatif. La quantification précise des cannabinoïdes déposés permet des études reproductibles sur les effets cellulaires de la vapeur de cannabis (et d’autres formes de produits à base de cannabis), ce qui fait progresser notre compréhension de ses impacts potentiels sur la santé dans un environnement de laboratoire contrôlé.

Les systèmes d’exposition avancés comblent les limites des cultures submergées traditionnelles en permettant le dépôt direct de particules à la surface des cellules, offrant ainsi des expositions plus pertinentes sur le plan physiologique. Cela réduit également les effets potentiels des solvants ou des supports. En permettant le dépôt direct de particules sans avoir besoin de ces solvants, les systèmes d’exposition aident à minimiser les effets liés aux véhicules. Néanmoins, certaines considérations liées aux véhicules demeurent. Par exemple, des niveaux d’humidité non contrôlés peuvent provoquer un stress cellulaire indésirable24, ce qui peut avoir un impact sur les résultats expérimentaux. Il est essentiel de s’assurer que l’humidité est soigneusement régulée pour atteindre des niveaux optimaux afin de maintenir la stabilité des cellules et la précision des résultats. De plus, chaque particule, aérosol ou mélange gazeux a ses propres propriétés physicochimiques uniques, qui pourraient modifier le dépôt à la surface de la cellule25. Il est donc important de caractériser un régime d’exposition pour chaque produit unique. Les facteurs qui pourraient avoir un impact sur le dépôt de particules comprennent la thermophorèse, le mouvement des particules d’une région de température élevée à bassetempérature 26. La thermophorèse aide à diriger les particules vers les cellules et améliore l’efficacité du dépôt.

L’uniformité et la précision du dosage sont des défis supplémentaires lorsque l’on travaille avec des systèmes d’exposition à l’ALI, en particulier lorsque des aérosols ou des particules sont impliqués. Le dépôt de particules in vivo dans le poumon est un processus complexe influencé par la taille, la forme, la densité et la solubilité des particules, ainsi que par la région spécifique du poumon exposée27. Ces facteurs se traduisent par des taux de dépôt variables qui peuvent être difficiles à reproduire in vitro. Les modèles mathématiques, tels que la dosimétrie de particules à trajets multiples (MPPD), sont des outils utiles pour estimer les taux de dépôt in vivo et guider la traduction des doses in vitro 28. Cependant, l’adéquation du dosage in vitro aux scénarios d’exposition in vivo reste un défi, en particulier pour les aérosols complexes aux compositions hétérogènes.

Pour la caractérisation de la dose acellulaire, il est important de noter que les lavages d’insert en acier inoxydable ont tendance à surestimer le dépôt, car les composés peuvent adhérer à la fois aux parois de l’insert et à la base où se trouvent généralement les cellules. Le QCM offre ici un avantage en mesurant uniquement la masse déposée directement sur le lieu de culture cellulaire, ce qui permet une évaluation plus précise des dépôts spécifiquement pertinents pour l’exposition cellulaire.

À mesure que la toxicologie évolue vers des modèles plus pertinents sur le plan physiologique, l’adoption de protocoles d’exposition unifiés à l’ALI sera fondamentale pour combler l’écart entre les résultats in vitro et les réponses humaines in vivo , ce qui permettra en fin de compte des évaluations plus fiables des substances toxiques respiratoires et de leurs impacts sur la santé.

Déclarations de divulgation

PG et BU sont employés chez SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW a effectué un stage chez SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. dans le cadre du programme Mitacs Accelerate. Les autres auteurs n’ont aucun conflit à divulguer

Remerciements

Ces travaux ont été financés par la subvention Projet 162273 des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). CJB a été soutenu par le Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). Cette étude a également été financée par une subvention de Mitacs #IT34076 à ETW.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger de 15 ml, support (support en polystyrène), SterileMontreal Biotech Inc.
flacons en verre de 30 mLThomas Scientific1755F32
A549 cellulesATCCCCL-185
Antibiotique-antimycosique (100x)Wisent450-115-EL
Broyeur d’herbes de cannabis  ;Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
keywords=herb %2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=herb %2Bgrinder %2Caps %
2C168& sr=8-10& th=1
Collagène du placenta humain, type IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0,4 µ ; Membrane polyester à pores m InsertsStemcell Technologies38023
Kit de détection de cytotoxicité (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C vaporisateur d’herbes sèchesDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich34869
DMEM mediumWisent319-005-CL
Fleur de cannabis séchéeSocié ; té ; qué ; bé ; coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1=THC		Teneur en cannabinoïdes : 17&ndash ; 23 % de THC < 0,1 % de CBD  ;
Sérum fœtal bovinWisent080-150FBS
flexiWare  ;SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Version 8.4.1
GentamycineWisent450-134-XL
Acide acétique glacialSigma-Aldrich100063  ;
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube emballage d’exposition in vitro   ;SCIREQIX-XCP  ;
Infinite 200 PROTECAN30125944
méthanol de qualité LC/MSSigma-Aldrich106035
Saline tamponnée au phosphateThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, Capuchon de filtreThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, Capuchon de filtreThermoFisher Scientific
Bleu de thiazolyle bromure de tétrazoliumSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Bain nettoyeur à ultrasonsVWR18303Bain sonicateur
Organisateur de piluleshebdomadaire HealthSmart640-8223-0000
MBI601051C156499

Références

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

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