Method Article

Assemblage modulaire standardisé d’opérons polycistroniques avec clonage modulaire (MoClo) à l’aide de la boîte à outils In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente un protocole étape par étape démontrant comment le clonage modulaire (MoClo) peut être adapté au clonage d’opérons polycistroniques.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les boîtes à outils de clonage modulaire (MoClo) permettent l’assemblage rapide de constructions multigéniques. Ils sont basés sur le clonage du Golden Gate, qui utilise des enzymes de restriction de type IIS qui coupent en dehors de leur site de reconnaissance. Étant donné que la reconnaissance et la séquence coupée sont découplées, les surplombs créés par les enzymes de restriction de type IIS peuvent être délibérément choisis, et les stratégies de clonage empêchent généralement la coupe des fragments d’ADN correctement joints. Cela permet des assemblages très efficaces de plusieurs fragments d’ADN en une seule réaction. Dans MoClo, des parties fonctionnelles individuelles de l’ADN telles que les promoteurs, les sites de liaison ribosomique, les séquences codantes et les terminateurs, ainsi que les assemblages d’ordre supérieur, se voient attribuer des surplombs standardisés, de sorte que des bibliothèques de pièces réutilisables peuvent être créées. La majorité des boîtes à outils MoClo bactériennes sont conçues pour le clonage d’unités transcriptionnelles monocistroniques et ne fournissent pas de chemin structuré pour l’assemblage d’opérons polycistroniques. Ce protocole démontre l’assemblage d’unités de transcription polycistroniques avec la boîte à outils In- & Out-Cloning . La même approche est transférable à d’autres boîtes à outils MoClo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le clonage moléculaire, c’est-à-dire l’introduction d’ADN recombinant dans un réplicon tel qu’un plasmide, est une méthodologie fondamentale en biologie moléculaire. Les méthodes de construction et d’assemblage de l’ADN sont devenues de plus en plus sophistiquées au cours des dernières décennies. À l’heure actuelle, les chercheurs peuvent construire des chromosomes synthétiques entiers et même des génomes à partir d’ADN1 synthétisé. Le clonage moléculaire traditionnel repose souvent sur des stratégies de clonage ad hoc, et peut être laborieux et coûteux pour les grandes constructions multigéniques2. Ces dernières années, le clonage Golden Gate (GG) et les boîtes à outils MoClo (Secured Hierarchical Modular Cloning) 2,3 sont devenues des solutions populaires pour permettre un assemblage d’ADN rapide et rentable.

Les enzymes de restriction de type IIS sont des endonucléases qui reconnaissent une séquence directionnelle (non palindromique) et se clivent à l’extérieur de cette séquencede reconnaissance 4. Par conséquent, les séquences de surplomb créées par le clivage ne dépendent pas du site de reconnaissance, mais peuvent être choisies4. De plus, les fragments d’ADN fonctionnels, ici appelés « parties », peuvent être conçus de telle sorte que le clivage supprime le site de reconnaissance des extrémités des partiesà assembler 2. Les stratégies de clonage GG en tirent parti pour permettre des assemblages d’ADN efficaces en plusieurs parties dans des réactions en un seul pot5. Les boîtes à outils MoClo sont basées sur le clonage GG et visent à fournir une manière modulaire et hiérarchique pour l’assemblage de constructions multigéniques. Les porte-à-faux utilisés pour l’assemblage des pièces sont standardisés, permettant la création de bibliothèques de pièces réutilisables et interchangeables. Les boîtes à outils MoClo reposent sur des plasmides accepteurs, qui sont conçus pour accepter plusieurs séquences d’ADN et libérer le produit assemblé. Chaque plasmide accepteur contient deux sites de reconnaissance de deux enzymes différentes de type IIS, l’un étant utilisé pour accepter la cargaison d’ADN et l’autre pour libérer l’ADNassemblé 3,6. Une illustration de ce principe est illustrée à la figure 1 pour le clonage d’une pièce individuelle, un terminateur, dans un plasmide accepteur MoClo (niveau 0). Le plasmide accepteur et l’insert sont coupés par l’enzyme de restriction BbsI, de manière à laisser des surplombs compatibles et à supprimer les sites de reconnaissance BbsI. Les plasmides correctement ligaturés ne sont donc plus coupés par BbsI. La coupe du plasmide résultant avec l’enzyme de type IIS SapI libère le fragment précédemment inséré lors de l’étape d’assemblage suivante (niveau 1).

Dans ce protocole, la boîte à outils MoClo In- and Out-Cloning est utilisée7. Ici, les plasmides de niveau 0 contiennent des parties génétiques fondamentales définies telles que des promoteurs avec des régions non traduites 5' (UTR), des séquences codantes et des terminateurs avec des UTR 3', la figure 1 montre une vue d’ensemble schématique du niveau 0. Au niveau 1, plusieurs pièces sont assemblées dans une unité de transcription (TU), la figure 2 montre une vue d’ensemble schématique des pièces de niveau 1 et du clonage. Clonage entrant et sortant MoClo a été conçu pour l’assemblage sans cicatrice d’unités de transcription au niveau 1 en utilisant une enzyme de type IIS qui crée des surplombs de 3 nucléotides. Cela permet aux porte-à-faux d’être entièrement dans la trame de codons de la séquence de codage, en utilisant les codons de début ATG et d’arrêt TGA pour l’assemblage. Les niveaux M et P sont utilisés pour l’assemblage de plusieurs unités de transcription libérées par les plasmides de niveau 1 3,8. La figure 3 montre une vue d’ensemble schématique des pièces à cloner aux niveaux M et P, et de l’assemblage d’un opéron bicisternique au niveau M (un opéron bicisternique est une unité transcriptionnelle qui exprime plusieurs séquences de codage (CDS)). Les niveaux P et M ont été conçus pour permettre un cycle itératif de l’un à l’autre, de sorte qu’il n’y a pas de limite théorique au nombre de pièces pouvant être assemblées, mais cela n’est pas décrit dans ce protocole, car l’objectif principal de ce protocole est de montrer l’assemblage d’un opéron bicisternique. Bien qu’il n’y ait pas de limite au nombre de pièces pouvant être assemblées, il existe une limite à la taille d’une construction qui peut être assemblée ; jusqu’à 100 000 BP a été assemblé à l’aide d’un kit MoClo9. De plus, les grandes constructions ou les constructions qui contiennent des gènes toxiques peuvent causer une charge sur la cellule ; Pour ces cas, des protocoles modifiés ont été publiés10.

Au départ, le clonage intérieur et sortant ne décrivait pas de schéma d’assemblage d’unités de transcription polycistroniques. Les opérons polycistroniques sont un mode d’organisation génique très courant chez les bactéries 11,12,13, et par conséquent, il y a un intérêt notable pour leur assemblage ascendant de manière modulaire 14. Ici, un schéma structuré pour l’assemblage d’opérons polycistroniques à l’aide du clonage In et Out est décrit. Le schéma présenté permet d’échanger facilement la position des séquences codantes au sein des unités de transcription polycistronique, ainsi que des assemblages constitués à la fois de transcription mono- et polycistronique.

Le protocole étape par étape suivant montre la conception et le clonage d’un opéron polycistronique à l’aide du clonage entrant et sortant. La stratégie présentée pour cloner des unités de transcription polycistroniques peut facilement être adaptée à d’autres boîtes à outils MoClo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Ce protocole décrit la conception et l’assemblage d’un opéron polycistronique à travers trois niveaux de la norme In-Cloning (0, 1 et M). L’opéron polycistronique assemblé ici commence par un promoteur, suivi d’un site de liaison ribosomique (RBS), d’une séquence codante (CDS), d’un second RBS, d’un second CDS et enfin d’un terminateur (Figure S1). Il est fortement conseillé d’utiliser un logiciel de clonage moléculaire pour simuler le clonage in silico, afin de s’assurer que la stratégie de clonage conçue est correcte. Un exemple d’assemblage d’un promoteur en tant que pièce de niveau 0, d’assemblage d’un RBS avec une séquence de codage et un terminateur dans une unité de transcription de niveau 1, et de l’assemblage d’un opéron bicistronique au niveau M est décrit ici, et une vue d’ensemble schématique de l’ensemble de l’ensemble est illustrée à la figure S1.

1. Niveau 0 : Domestication des pièces

REMARQUE : Le terme « domestication » est utilisé pour indiquer qu’une pièce moléculaire a été intégrée dans une bibliothèque de pièces MoClo et peut être assemblée à travers les niveaux du kit MoClo. En règle générale, tous les sites de reconnaissance des enzymes de restriction de type IIS utilisés dans le kit sont retirés de la partie à domestiquer, par exemple par recodage synonyme.

  1. Conception de l’insert
    1. Choisissez les parties moléculaires, telles que le promoteur, le CDS et le terminateur, à assembler dans l’opéron.
      REMARQUE : Dans ce protocole, l’opéron initie avec le promoteur PLuxB, qui peut être activé par la protéine LuxR en présence du composé inducteur N-(β-Ketocaproyl)-L-homosérine lactone (OC6)17. GFP est le premier CDS de l’opéron ; son RBS est iGEM BBa_B0064. GFP est suivi d’un éditeur de liens non terminal, le « pont terminateur ». Le deuxième CDS est mTurquoise. Sa RBS a été conçue par un calculateur RBS18. Enfin, l’opéron se termine avec le terminateur L3S2P2119.
    2. Choisissez la position dans laquelle la pièce doit être assemblée, une vue d’ensemble est illustrée à la figure 1. En fonction de la position, choisissez le plasmide accepteur à utiliser dans le GG.
      REMARQUE : Les pièces peuvent être domestiquées pour une utilisation ultérieure dans diverses positions. Par exemple, un promoteur peut être assemblé en une seule pièce lors de la connexion ultérieure avec une pièce 5'UTR (pSL252), ou il peut être domestiqué avec une 5'UTR déjà contenue (pSL099). Un CDS peut être assemblé en quatre plasmides accepteurs, à assembler sans étiquette (pSL102), à assembler avec une étiquette N-terminale (pSL104), à assembler avec une étiquette C-terminale (pSL101), ou à assembler à la fois avec une étiquette N-terminale et une étiquette C-terminale (pSL103). Dans l’exemple donné, le promoteur est domestiqué en pSL252, le premier RBS est domestiqué en pSL253, le premier CDS est domestiqué en pSL102, le pont de terminaison est domestiqué en pSL106, le deuxième RBS est domestiqué en pSL099, le deuxième CDS est domestiqué en pSL102 et le terminateur est domestiqué en pSL106.
    3. Ajoutez des extensions à l’insert conçu en fonction du plasmide accepteur choisi. Le Tableau 1 donne un aperçu de l’extension requise pour l’assemblage GG par plasmide accepteur. Ces extensions doivent être ajoutées lors de la conception des amorces pour la PCR, la conception des oligos en cas de recuit de deux oligos pour construire une pièce, ou lors de la synthèse de gènes.
      REMARQUE : Pour qu’une pièce soit domestiquée, il est nécessaire de s’assurer que la pièce elle-même ne contient pas de sites de reconnaissance des enzymes de type IIS utilisées dans le kit, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') et BsaI (5'-GGTCTC-3'). La présence de sites de reconnaissance dans les pièces réduit considérablement l’efficacité d’un assemblage correct, car le produit final peut être coupé par l’enzyme de type IIS utilisée (voir Figure 1).
  2. Réaction GG
    1. Pour la réaction GG, ajoutez 50 fmol de l’insert souhaité, 50 fmol du plasmide accepteur, 1 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 1 μL de ligase T4 et 1 μL de BbsI. Ajouter de l’eau sans nucléase à un volume total de 10 μL. De plus, inclure un témoin négatif avec la même réaction sans l’insert souhaité.
    2. Exécutez le programme suivant dans un thermocycleur : 25 cycles de 37 °C pendant 3 min (37 °C est la température optimale de l’enzyme de restriction) et 16 °C pendant 4 min (16 °C est la température optimale de la T4 ligase), suivis d’une digestion finale à 50 °C pendant 20 min (à 50 °C, la T4 ligase montre très peu ou pas d’activité, alors que l’enzyme de restriction est toujours capable de fonctionner, limitant ainsi la quantité de plasmide accepteur non coupé dans le produit final) et une inactivation thermique des enzymes à 80 °C pendant 20 min (à 80 °C, toutes les enzymes sont inactivées thermiquement et la réaction est terminée)6.
    3. Transformer la réaction GG en ajoutant 5 μL de la réaction GG dans 50 μL de cellules E. coli chimiquement compétentes et effectuer une transformation par choc thermique avec une étape de récupération comme décrit dans un protocole15 précédemment publié.
    4. Étaler 100 μL de l’excroissance de transformation sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) avec 100 μg/mL de spectinomycine. Incuber la plaque toute la nuit à 37 °C.
    5. Comparez l’efficacité de transformation du témoin négatif à celle de l’ensemble complet en comptant le nombre de colonies blanches sur les deux plaques. Passez à l’étape suivante si l’assemblage a environ 10 fois (ou plus) de colonies blanches que le témoin négatif.
      REMARQUE : La majorité des colonies résultantes doivent être blanches, avec seulement une petite fraction de colonies rouges. Les plasmides accepteurs de la boîte à outils In-Cloning ont une cassette à double sélection, contenant soit mCherry (niveau 0 et niveau 1), soit LacZα (niveau M et niveau P), et un gène ccdB, codant pour un inhibiteur de gyrase. La transformation de la réaction GG est effectuée dans les cellules E. coli sensibles au ccdB, ainsi, seules les cellules qui ont le plasmide assemblé peuvent se développer, tandis que le plasmide accepteur d’origine ne peut pas être propagé. Des exemples de souches sensibles au ccdB comprennent DH5α et TOP10. Le mCherry/LacZα permet l’identification visuelle des cellules échappant au mécanisme ccdB 16.
    6. Pour chaque assemblage, cultivez deux colonies blanches en prélevant un peu de matériel de la colonie à l’aide d’une pointe de pipette et en le remettant en suspension dans 5 mL de milieu LB avec 100 μg/mL de spectinomycine chacune et incubez toute la nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation à 250 tr/min. Effectuez une extraction plasmidique sur colonne selon les instructions du fabricant. Vérifiez que le plasmide extrait a la séquence attendue par séquençage de Sanger.

2. Niveau 1 : Détermination des positions

REMARQUE : Le niveau 1 est le niveau entre la domestication des pièces et l’assemblage d’un opéron polycistronique (Figure 2). Ici, les positions des assemblages intermédiaires dans la construction finale sont déterminées. La position d’un assemblage de niveau 1 dans l’opéron peut être modifiée en utilisant un plasmide accepteur de niveau 1 différent. L’exemple donné décrit l’assemblage d’une unité bicisternique, mais le schéma donné peut être facilement adapté pour l’assemblage d’un maximum de six séquences de codage (avec une RBS chacune). L’assemblage d’un plus grand nombre de séquences codantes nécessite en outre un cycle entre les niveaux P et M. Avec un cycle itératif entre les niveaux P et M, il n’y a pas de limite supérieure fixe au nombre de séquences codantes pouvant être assemblées en un seul opéron.

  1. Choix des pièces et des plasmides accepteurs
    1. Choisissez les parties de niveau 0 à assembler dans une unité de transcription. Au minimum, ceux-ci doivent inclure un promoteur, un CDS et un terminator.
    2. Choisissez la position dans laquelle l’unité de transcription doit être assemblée dans l’opéron. En fonction de cette position, choisissez le plasmide accepteur approprié. La figure 2 en donne une vue d’ensemble.
      REMARQUE : Les 7 fragments d’ADN pour la construction de l’opéron bicistronique montré à titre d’exemple sont assemblés en deux constructions de niveau 1. Le promoteur, le premier RBS, le premier CDS et le pont terminateur sont assemblés dans pSL68 ; le deuxième RBS, le deuxième CDS et le terminateur sont assemblés dans le pSL69.
  2. Réaction GG
    1. Pour la réaction GG, ajoutez 50 fmol de chacun des inserts souhaités, 50 fmol du plasmide accepteur, 1 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 1 μL de T4 ligase et 1 μL de SapI. Ajouter de l’eau exempte de nucléases à un volume total de 10 μL.
    2. Exécutez le programme suivant dans un thermocycleur : 25 cycles de 37 °C pendant 3 min et 16 °C pendant 4 min, suivis d’une digestion finale à 50 °C pendant 20 min et d’une inactivation thermique des enzymes à 80 °C pendant 20 min6.
    3. Facultatif : Ajouter 0,5 μL de SapI à la réaction GG et incuber à 37 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : SapI n’est pas aussi stable que les autres enzymes de restriction de type IIS utilisées. Il a été constaté qu’une étape de digestion avec SapI après la réaction GG réduit la quantité de colonies qui portent le plasmide accepteur religé. SapI a un isoschizomère, BspQI, qui n’a peut-être pas besoin de cette dernière étape de digestion.
    4. Transformez 5 μL de la réaction GG en 50 μL de cellules E. coli chimiquement compétentes et effectuez une transformation par choc thermique, de préférence avec une étape de récupération comme effectuée à l’étape 1.2.3.
    5. Plaque de 100 μL de l’excroissance de transformation sur une plaque de gélose LB avec 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber la plaque toute la nuit à 37 °C.
    6. Pour chacune, cultivez deux colonies blanches en prélevant un peu de matériel de la colonie à l’aide d’une pointe de pipette et en le remettant en suspension dans 5 mL de milieu LB avec 100 μg/mL d’ampicilline chacune. Incuber une nuit à 37 °C dans un incubateur agitateur à 250 tr/min. Effectuez une extraction plasmidique sur colonne selon les instructions du fabricant.
    7. Confirmez l’assemblage correct grâce à une synthèse de restriction avec BbsI, en vérifiant que la taille de la découpe correspond à la taille attendue de l’insert. Digérez 1000 ng d’ADN plasmidique en ajoutant 1 μL du tampon de digestion 10x approprié et 1 μL de BbsI. Ajouter de l’eau exempte de nucléases jusqu’à un volume total de 10 μL. Incuber la réaction à 37 °C pendant 15 min.
    8. Effectuez une électrophorèse sur gel en chargeant le plasmide digéré sur un gel d’agarose à 1 %, exécutez le gel à 100 V pendant 35 min.
      REMARQUE : Une digestion in silico du plasmide attendu peut être effectuée pour simuler un gel d’agarose afin de prédire le résultat.

3. Niveau M : Assemblage d’un opéron polycistronique

REMARQUE : Dans cette étape, l’opéron polycistronique est en cours d’assemblage. Dans le cas présenté d’un opéron bicisternique, deux inserts de niveau 1 sont assemblés dans les positions 1 et 2. En conséquence, le plasmide accepteur pMA60 est choisi. De plus, un éditeur de liens d’extrémité est nécessaire. Tous les plasmides accepteurs de niveau M et P ont le surplomb GGGA comme deuxième surplomb. Les liaisons d’extrémité font le pont entre l’insert et le plasmide accepteur et permettent l’assemblage d’une construction de niveau P dans le niveau M et vice versa. Pour un assemblage de niveau P de deux inserts de niveau 1, le linker d’extrémité pMA668 est utilisé et prendra la troisième et dernière position. La figure 3 présente une vue d’ensemble des niveaux M et P ainsi qu’une visualisation de l’étape de clonage. Avec un assemblage uniquement au niveau M (ou P), des opérons de jusqu’à 6 séquences codantes peuvent être clonés (positions 1-6). La position 7 est prise par l’éditeur de liens d’extrémité. L’assemblage d’un plus grand nombre de séquences codantes dans un opéron est possible, mais nécessite un cycle vers le niveau M (ou P), qui n’est pas décrit dans ce protocole.

  1. Pour la réaction GG, ajoutez 50 fmol de chaque insert souhaité, 50 fmol du plasmide accepteur, 1 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 1 μL de ligase T4 et 1 μL de BbsI. Ajouter de l’eau exempte de nucléases à un volume total de 10 μL.
  2. Exécutez le programme suivant dans un thermocycleur : 50 cycles de 37 °C pendant 3 min et 16 °C pendant 4 min, suivis d’une digestion finale à 50 °C pendant 20 min et d’une inactivation thermique des enzymes à 80 °C pendant 20 min6.
  3. Transformer 5 μL de la réaction GG en 50 μL de cellules E. coli chimiquement compétentes et effectuer une transformation par choc thermique avec une étape de récupération comme à l’étape 1.2.3.
  4. Étaler 100 μL de l’excroissance de transformation sur une plaque de gélose LB avec 100 μg/mL de spectinomycine. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 °C, ou à 30 °C si l’on s’attend à une charge métabolique ou à une toxicité de l’assemblage.
  5. Pour chaque assemblage, faites une culture à partir de deux colonies blanches. À cette fin, trempez une pointe de pipette dans la colonie et utilisez-la pour inoculer 5 mL de LB avec 100 μg/mL de spectinomycine. Incuber une nuit à 37 °C ou 30 °C dans un incubateur agitateur à 250 tr/min. Effectuez une extraction plasmidique sur colonne selon les instructions du fabricant.
  6. Confirmez l’assemblage correct à l’aide d’une synthèse de restriction avec BsaI, en vérifiant que la taille de la découpe correspond à la taille attendue de l’insert, comme effectué à l’étape 2.2.7.
    REMARQUE : La construction peut être trop longue pour être couverte par le séquençage de Sanger pour confirmation. Il peut ensuite être confirmé par le séquençage du plasmide entier, qui est disponible en tant que service commercial auprès de plusieurs fournisseurs de services de séquençage.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, les résultats d’un assemblage ascendant d’un opéron polycistronique du niveau 0 au niveau M sont présentés (Figure S1). L’opéron s’initie avec le promoteur PLuxB, qui peut être activé par la protéine LuxR en présence du composé inducteur N-(β-Ketocaproyl)-L-homosérine lactone (OC6)17. GFP est le premier CDS de l’opéron, son RBS est iGEM BBa_B0064. GFP est suivi d’un éditeur de liens non terminal, le « pont terminateur ». Le deuxièm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le clonage moléculaire peut prendre du temps et être fastidieux, en particulier avec des stratégies de clonage ad hoc. Les boîtes à outils MoClo peuvent améliorer le clonage moléculaire grâce à leur modularité, leur assemblage hiérarchique et leurs réactions très efficaces en un seul pot. Ils reposent sur l’assemblage de l’ADN par le biais de réactions du Golden Gate. Grâce aux porte-à-faux standardisés, les bibliothèques de pièces moléculaires peuvent être réutilisées et partag...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV et DS ont été soutenus par la Société Max Planck dans le cadre du projet MaxGENESYS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillineMerck Life ScienceA9518
Agar bactérienFisher Scientific & nbsp ;P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5&alpha ; Cellules compétentes
Eppendorf  ; Mastercycler  ; Nexus Thermal CyclersEppendorf6333000014
Spectrophotomètre micro-volume EzDrop 1000Blue-Ray BiotechBRED-1000
Kit Mini-Préparation Plasmide GeneJETThermo ScientificK0503
< >In- & Sortie - Boîte à outils de clonage
Tampon de ligaseNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific & nbsp ;BP358
New Brunswick Innova & reg ;   ; 42/42R - Shaker Incubateur EmpilableEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Instruments chanteursPHB-007
SaPiNew England BiolabsR0569
SpectinomycineMerck Life ScienceS4014
Matériel de laboratoire standard
Ligase de l’ADN T4New England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TryptoneFisher Scientific & nbsp ;LP0042B
Extrait de levureFisher Scientific & nbsp ;LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles