Détermination de la morphologie mitochondriale dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons un protocole étape par étape et mettons l’accent sur les détails clés pour déterminer les caractéristiques morphologiques des mitochondries dans les cellules vivantes, y compris la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Cette méthode est couramment utilisée pour examiner la morphologie mitochondriale afin d’étudier diverses conditions.

Résumé

L’équilibre dynamique de la fusion et de la fission mitochondriales contribue directement à l’homéostasie mitochondriale, qui influence de nombreuses fonctions cellulaires en plus de l’homéostasie de l’adénosine triphosphate (ATP). Par conséquent, l’évaluation de la morphologie mitochondriale dans des conditions de stress est essentielle pour la recherche mécaniste. Cette étude décrit un protocole détaillé d’analyse de la morphologie mitochondriale, englobant la préparation d’une solution MitoTracker, la coloration des mitochondries, l’optimisation des paramètres d’imagerie et la détection des caractéristiques morphologiques. Les MitoTrackers sont des colorants spécifiques aux mitochondries couramment utilisés et rentables. Cependant, certains changements dans la morphologie mitochondriale peuvent se produire en raison d’une manipulation inappropriée, qui peut être imperceptible et ne pas refléter le véritable état des mitochondries. Par conséquent, il est nécessaire de comprendre comment analyser les changements de morphologie mitochondriale à l’aide de MitoTrackers. Le protocole a utilisé des cellules SH-SY5Y stimulées par de l’iodure de 1-méthyl-4-phénylpyridinium (MPP⁺) pour illustrer le protocole d’analyse morphologique mitochondriale. Par rapport aux cellules témoins, les cellules stimulées par MPP⁺ présentaient des mitochondries plus petites et plus fragmentées, les paramètres morphologiques indiquant une diminution de l’empreinte mitochondriale. Ces résultats suggèrent que la coloration MitoTracker est une méthode efficace et réalisable pour l’analyse morphologique mitochondriale qui (avec des modifications mineures) peut être appliquée à l’étude de diverses conditions.

Introduction

La morphologie mitochondriale est maintenue par l’équilibre dynamique de la fusion mitochondriale et de la fission, et affecte donc l’homéostasie énergétique et de nombreuses autres fonctions cellulaires, entraînant diverses pathologies telles que les maladies neurodégénératives, le cancer et l’inflammation 1,2,3,4,5 . Pour observer la morphologie mitochondriale, plusieurs colorations sélectives des mitochondries, y compris des sondes et des anticorps, ont été développées pour être utilisées avec un microscope confocal. Certaines sondes spécifiques des mitochondries, comme la tétraméthylrosamine et la rhodamine 123, fonctionnent en fonction du potentiel de membrane mitochondriale (MMP), ce qui limite leur applicabilité dans les études des conditions de perturbation de la MMP ^6,7. À l’inverse, la coloration des anticorps fournit une évaluation morphologique indépendante de la MMP pour examiner la morphologie mitochondriale dans les cellules fixes. Bien qu’une coloration appropriée permette d’évaluer la morphologie mitochondriale dans les cellules fixes, l’examen de la morphologie mitochondriale dans les cellules vivantes altérées par certains inducteurs reste difficile. MitoTracker, une sonde fluorescente cationique perméable aux cellules et spécifique aux mitochondries, offre une solution à ce défi, permettant la coloration de cellules vivantes et fixes. Cette sonde a été largement utilisée pour examiner la morphologie mitochondriale dans l’étude de diverses maladies 8,9,10,11. Néanmoins, certaines études ont signalé des problèmes tels qu’un signal de fond élevé et une liaison non spécifique, même lorsque la sonde est utilisée en stricte conformité avec les directives fournies par le fabricant. Ces observations soulignent l’importance d’une compréhension approfondie de la préparation des échantillons et de l’acquisition d’images pour une analyse réussie de la morphologie mitochondriale.

Pour faciliter l’analyse de la morphologie mitochondriale, divers programmes et algorithmes de traitement d’images ont été développés 12,13,14,15,16. Dans cette étude, nous avons utilisé le macro-outil Mitochondrial Network Analysis (MiNA) dans ImageJ pour analyser la morphologie mitochondriale¹³. Cet outil identifie et caractérise efficacement les caractéristiques morphologiques des réseaux mitochondriaux en calculant neuf paramètres descriptifs, notamment le nombre d’individus (structures sans aucune branche), le nombre de réseaux (nombre d’objets avec au moins un pixel de jonction), la longueur moyenne (longueur moyenne de tous les bâtonnets et branches), la longueur médiane (longueur médiane de tous les bâtonnets et branches), l’écart-type de longueur (écart type des longueurs individuelles), taille moyenne du réseau (nombre moyen de branches par réseau), taille médiane du réseau (valeur médiane du nombre de branches par réseau), écart-type de la taille du réseau (écart-type du nombre de branches par réseau) et empreinte mitochondriale (surface totale du signal après séparation de l’arrière-plan). Dans ce protocole, l’empreinte mitochondriale a été sélectionnée comme paramètre représentatif.

L’objectif de cette étude est de fournir un protocole étape par étape pour l’analyse morphologique mitochondriale, en se concentrant sur les détails clés. Nous avons utilisé des cellules SH-SY5Y induites par MPP⁺ pour démontrer ce protocole. MPP⁺ inhibe le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale dans les neurones dopaminergiques, entraînant des dommages à la morphologie et à la fonction mitochondriales ^8,17. Le protocole d’analyse morphologique décrit dans cette étude permet l’acquisition d’images à haute résolution et l’évaluation de paramètres pertinents pour définir les caractéristiques morphologiques des réseaux mitochondriaux.

Protocole

1. Préparation

1. Dissoudre le MPP⁺ avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir une solution mère de 1 mM et la conserver à -30 °C dans l’obscurité (voir le tableau des matériaux).
2. Dissoudre 50 μg de MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) dans 94 μL de DMSO pour obtenir une solution mère de 1 mM. Aliquoter la solution mère dans plusieurs tubes de microcentrifugation et la conserver à l’abri de la lumière à -30 °C jusqu’à nouvel ordre.
3. Incuber des cellules SH-SY5Y dans des flacons avec le milieu Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 de Dulbecco complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) dans un environnement humidifié avec 5 % de CO₂ et 95 % d’air à 37 °C. Pour le passage, détacher les cellules avec une solution de trypsine à 0,05 % pendant 1 min et centrifuger à 100 × g pendant 3 min.

Stimulation 2. MPP⁺

1. Ensemencez les cellules SH-SY5Y sur des boîtes confocales à fond de verre et maintenez-les dans un milieu DMEM/F12 complété par 1 % (v/v) de FBS pendant la nuit.
2. Remplacez le milieu de culture, puis incubez les cellules avec ou sans MPP⁺ pendant 24 h.

3. Coloration MitoTracker

1. Préchauffez le DMEM/F12, puis diluez la solution mère de MitoTracker avec du DMEM/F12 pour obtenir une solution de travail de 50 nM. Gardez la solution à l’abri de la lumière pendant toute la procédure.
2. Retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les plats confocaux 2 fois avec du DMEM/F12 frais.
3. Incuber des cellules dans chaque boîte avec 1 ml de la solution de travail MitoTracker pendant 15 min à 37 °C dans l’obscurité.
4. Retirez la solution de travail MitoTracker et lavez-la 2 fois avec DMEM/F12.
5. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 dans chaque boîte et incuber dans l’incubateur cellulaire avant l’imagerie.

4. Paramètres d’imagerie pour microscope confocal

1. Prééquilibrez le microscope pour les opérations ultérieures. Sous le panneau d’acquisition, ajustez les paramètres liés au trajet lumineux en réglant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission.
2. Réglez les paramètres comme suit : taille du sténopé, 1,2 AU ; taille du balayage des pixels, 1 024 x 1 024 ; temps de séjour des pixels, 2,4 μs (moyenne 2x)  (maintenez-le cohérent à des fins d’étalonnage).

5. Optimisation des paramètres d’imagerie

ATTENTION : Évitez l’exposition oculaire aux rayonnements directs et diffusés d’un laser visible et/ou invisible.

1. Utilisez la lumière halogène pour faire la mise au point sur les cellules à l’aide d’une lentille d’objectif apochromatique plan 60x (1,4 NA) pour éviter la phototoxicité.
2. Réglez la puissance laser et la haute tension (HV) juste en dessous du niveau de saturation, réglez le facteur de zoom sur 3, puis capturez les images.
3. Déplacez la région d’intérêt et concentrez-vous sur les cellules pour capturer des images sans modifier les paramètres.

6. Analyse des données

REMARQUE : les données ont été analysées à l’aide d’ImageJ préinstallé avec le plug-in^{MiNA 13}. Pour obtenir des mesures précises et pertinentes, les images doivent capturer des mitochondries résolues indépendamment avec une coloration nette et brillante.

1. Pour améliorer la qualité de l’image avant la transformation binaire et la squelettisation, ouvrez l’image et effectuez le traitement préliminaire. Utilisez l’outil ROI pour sélectionner l’aire d’une seule cellule. Appliquer le processus | Filtres | Fonction de masque flou pour améliorer la netteté et utiliser le processus | Fonction d’amélioration du contraste pour réduire la suramplification du bruit. Pour éliminer spécifiquement le bruit du sel et du poivre, utilisez le processus | Filtres | Fonction médiane (voir la figure supplémentaire S1).
2. Pour construire un modèle morphologique simplifié permettant de calculer des paramètres descriptifs, convertissez l’image en binaire via le seuillage (cliquez sur Traiter | Binaire | Make Binary), puis squelettez l’image binaire à l’aide de la fonction Skeletonize (cliquez sur Traiter | Binaire | Squelettisation) (voir la figure supplémentaire S2).
3. Regroupez tous les pixels du squelette à l’aide de l’option Analyser | Squelette | Fonction d’analyse du squelette (2D/3D). Simplifiez l’analyse en utilisant l’outil MiNA pour calculer neuf paramètres descriptifs dans l’image squelettée (voir la figure supplémentaire S3).

Résultats

Ce protocole décrit une procédure détaillée, étape par étape, pour l’analyse morphologique mitochondriale à travers trois modules d’optimisation interdépendants : la normalisation des protocoles de préparation des échantillons, l’optimisation systématique des paramètres optiques pour l’imagerie en microscopie confocale et les directives de traitement d’images computationnelles. Un protocole optimal de préparation des échantillons est essentiel pour obtenir des données d’imagerie mitochondriale fiables. L’évaluation systé...

Discussion

La présente étude établit une méthodologie systématique d’analyse de la morphologie mitochondriale dans des cellules vivantes dans des conditions de stress. Les étapes procédurales cruciales de l’imagerie mitochondriale impliquent : une concentration appropriée des sondes MitoTracker, un lavage minutieux de la vaisselle confocale avant l’acquisition de l’image, la minimisation des perturbations de l’état cellulaire et le réglage de paramètres d’imagerie appropriés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Iodure de 1-méthyl-4-phénylpyridinium (MPP+)	Macklin	M875357	Utilisé pour induire un stress oxydatif
Boîte confocale	NID	801001	Utilisé pour cultiver les cellules
Microscope confocal	Nikon	C2	Utilisé pour capturer des images
Mélange de milieu et de nutriments modifié Eagle de Dulbecco F-12	ThermoFisher Scientific	11320033	Utilisé pour fournir de la nutrition aux cellules
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Beyotime	ST038	Utilisé pour dissoudre la sonde mitotracker
Sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher Scientific	A3161001C	Utilisé pour fournir de la nutrition aux cellules
ImageJ	Instituts nationaux de la santé	ImageJ	Utilisé pour analyser la morphologie mitochondriale
MitoTracker Rouge CMXRos	ThermoFisher Scientific	Référence M7512	Utilisé pour visualiser les mitochondries
Tampon phosphate salin (PBS)	ThermoFisher Scientific	C10010500BT	Utilisé pour laver les cellules sur les plats confocaux
Cellule SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	Utilisé pour démontrer le flux de travail d’analyse de la morphologie mitochondriale
Adaptateur de scène TI-SH-U	Nikon	MEC59110	Utilisé pour sécuriser les échantillons