Préparation mitochondriale à partir de microglie pour l’analyse des glycanes

Résumé

Un protocole a été mis au point pour la préparation de mitochondries purifiées à partir de cellules microgliales, l’isolement de protéines mitochondriales pour la libération de N-glycanes et la détection rapide de glycanes mitochondriaux subcellulaires à l’aide d’une désorption laser assistée par une matrice infrarouge couplée à une spectrométrie de masse précise à haute résolution.

Résumé

Comprendre les modèles de glycosylation des protéines mitochondriales dans la microglie est essentiel pour déterminer leur rôle dans les maladies neurodégénératives. Ici, nous présentons une méthodologie nouvelle et à haut débit pour l’analyse glycomique de protéines mitochondriales isolées de microglies en culture. Cette méthode implique l’isolement des mitochondries à partir de cultures microgliales, l’évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, suivie d’une extraction optimisée des protéines pour maximiser la détection des glycanes, et la spectrométrie de masse de masse précise à haute résolution (HRAM) par désorption par désorption par électronébulisation assistée par matrice infrarouge (IR-MALDESI) pour fournir des profils détaillés de la glycosylation mitochondriale.

Ce protocole met l’accent sur l’importance de maintenir l’intégrité mitochondriale pendant l’isolement et utilise un contrôle de qualité rigoureux pour assurer la reproductibilité, y compris la mesure de la pureté mitochondriale après l’extraction. Cette approche permet d’établir un profil complet des changements de glycosylation dans les mitochondries microgliales dans diverses conditions expérimentales in vitro, ce qui donne un aperçu des changements mitochondriaux associés aux maladies neurodégénératives. Cette approche pourrait être adaptée à d’autres traitements in vitro , à d’autres types de cellules cultivées ou à des cellules primaires. Grâce à cette approche standardisée, nous visons à faire progresser la compréhension des glycanes mitochondriaux microgliaux, contribuant ainsi au domaine plus large de la recherche neurodégénérative.

Introduction

Les microglies sont les cellules immunitaires innées résidentes dominantes dans le cerveau et représentent 10 à 15 % des cellules du cerveau adulte ^1,2. Ils utilisent leur répertoire de récepteurs pour surveiller dynamiquement le microenvironnement cérébral et réguler la fonction cérébrale normale afin de maintenir l’homéostasie cérébrale³. Les microglies sont très sensibles aux changements de leur microenvironnement et subissent des changements dans la morphologie cellulaire, l’immunophénotype et la fonction avec des conditions pathologiques ou diverses stimulations. Les états d’activation microgliale sont influencés par les demandes d’énergie cellulaire nécessaires à leur fonction, telles que la phagocytose, la production de cytokines ou la réparation des tissus. Par conséquent, le métabolisme énergétique cellulaire joue un rôle crucial dans la régulation des modifications de la fonction microgliale⁴. La dérégulation microgliale entraîne une libération excessive de cytokines pro-inflammatoires (par exemple, IL-1β, TNF-α) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), prédisposant le cerveau à la neuroinflammation ^5,6. La dysrégulation microgliale chronique et l’environnement neuro-inflammatoire qui en résulte constituent la base de la neurodégénérescence⁷.

Le cerveau ne représente que 2 % du poids corporel, mais 20 % de la consommation totale d’énergie du corps. Les mitochondries sont la principale source d’énergie dans les cellules cérébrales et jouent un rôle clé dans la pathogenèse des troubles cérébraux aigus et^chroniques8. Des études antérieures ont établi une forte corrélation entre l’activation microgliale et le dysfonctionnement métabolique dans le vieillissement⁹ et les troubles liés à l’âge tels que la maladie d’Alzheimer^10,11, soulignant le rôle central des mitochondries dans la sénescence cellulaire et la neurodégénérescence. L’altération de la fonction mitochondriale entraîne une diminution de la production d’énergie, un stress oxydatif élevé et une augmentation de la neuroinflammation pendant le vieillissement et les maladies liées à l’âge.

Bien que des recherches approfondies aient élucidé le rôle des mitochondries dans le métabolisme énergétique, le vieillissement et les troubles cérébraux, le rôle des modifications post-traductionnelles courantes, telles que la glycosylation, dans la biologie et la fonction mitochondriales reste insuffisamment exploré. La glycosylation, l’ajout enzymatique de fractions de sucre appelées glycanes aux protéines par des enzymes de glycosylation, est la modification post-traductionnelle la plus courante dans la plupart des cellules cérébrales, y compris la microglie. Les microglies activées modulent leur fonction immunitaire sous l’effet de stimuli inflammatoires en régulant l’expression intracellulaire ou de surface cellulaire des glycanes¹². Les réponses pro- et anti-inflammatoires présentées par la microglie après la stimulation sont également régulées par les glycanes¹³. Les protéines mitochondriales ont également ces modifications de glycanes, qui régulent leur fonction et leur localisation. Cependant, l’analyse détaillée des modèles de glycosylation mitochondriale spécifiques à la cellule dans la microglie fait défaut en raison des défis techniques liés à l’étude de la glycosylation subcellulaire. Malgré les rôles bien caractérisés de la glycosylation dans la modulation du phénotype microglial, le rôle des glycanes dans la modulation de la fonction mitochondriale et, par conséquent, de l’immunophénotype cellulaire dans la microglie reste mal compris.

Des études limitées portant sur la glycosylation des protéines mitochondriales se sont principalement concentrées sur l’identification des modèles de glycosylation à l’aide de lectines. Les lectines sont des protéines de liaison aux glycanes qui se lient à des fractions biomoléculaires de glycanes^14,15, qui n’ont pas la spécificité et la capacité de fournir des informations détaillées sur la composition des glycanes. Les modalités de spectrométrie de masse offrent une identification détaillée de la composition des glycanes pour surmonter les défis analytiques présentés par l’analyse des lectines. L’une de ces modalités, l’ionisation par électronébulisation par désorption par désorption assistée par matrice infrarouge (IR-MALDESI), utilise une stratégie d’ionisation hybride, utilisant un laser infrarouge moyen pour exciter de manière résonnante l’eau trouvée dans les échantillons biologiques¹⁶ afin de désorber les espèces neutres et de les soumettre à un panache d’électrospray orthogonal, suivi d’une analyse à l’aide d’un spectromètre de masse Orbitrap précis à haute résolution. L’IR-MALDESI a déjà été démontré pour l’analyse directe des métabolites tissulaires¹⁷, avec des avantages distincts de l’analyse rapide¹⁸, de la méthode d’ionisation douce et de la prévisibilité de la teneur en acide sialique des glycanes liés à l’azote sur la base des modèles de distribution isotopique des adduits de glycanes chlorés¹⁹. Cependant, l’adaptation de cette plateforme pour l’analyse directe des glycanes subcellulaires n’a pas été démontrée.

Ici, nous rapportons un protocole à haut débit pour l’isolement mitochondrial des cellules microgliales, l’isolement des N-glycanes mitochondriaux et la détection et l’analyse des N-glycanes mitochondriaux à l’aide de la spectrométrie de masse IR-MALDESI. Ce protocole sera fondamental pour découvrir de nouvelles connaissances sur le rôle de la glycosylation dans la fonction mitochondriale, ce qui pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles neuroinflammatoires et neurodégénératifs.

Protocole

1. Culture de lignées cellulaires microgliales BV2

1. Maintenir les cellules BV-2 (cellules microgliales dérivées de souris C57BL/6) dans un milieu à faible teneur en glucose DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de pénicillium-streptomycine (PenStrep) et 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA).
2. Cultivez les cellules dans des flacons T-175 et laissez-les atteindre 70-80 % de confluence.
3. Diviser les cellules en les incubant avec les enzymes de dissociation cellulaire pendant 5 min à 37 °C dans 5 % de CO₂, suivi d’une inactivation des enzymes avec un volume égal de milieu cellulaire et d’une centrifugation des cellules pendant 5 min à 500 × g à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Les enzymes de dissociation cellulaire utilisées ici sont plus douces pour les cellules BV2 que la trypsine et peuvent être utilisées pour protéger l’expression de l’antigène de surface cellulaire.
4. Aspirez le milieu, remettez la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu de croissance et comptez les cellules à l’aide de bleu de trypan (voir le tableau des matières).
   REMARQUE : Nous avons utilisé un compteur de cellules automatisé pour cette étape afin de compter les cellules.
5. Pour réaliser l’isolement mitochondrial, procédez si la pastille cellulaire contient 2 × 10⁷ (20 millions de cellules/pastille).

2. Isolement des mitochondries à partir de cellules microgliales

REMARQUE : Travaillez rapidement, en gardant tout sur la glace tout au long de la procédure. Le kit d’isolement mitochondrial utilisé pour l’isolement mitochondrial comporte trois composants : les réactifs A (tampon de lyse cellulaire), le réactif B (tampon stabilisateur) et le réactif C (tampon de lavage mitochondrial). Ajouter des inhibiteurs de protéase au réactif A et au réactif C immédiatement avant l’utilisation.

1. Granuler 2 × 10⁷ cellules par centrifugation des cellules récoltées dans un tube de microcentrifugation de 2,0 mL à 500 × g pendant 5 min. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant.
2. Ajouter 800 μL de réactif d’isolement mitochondrial A (tampon de lyse cellulaire), agiter à vitesse moyenne pendant 5 s et incuber le tube sur de la glace pendant exactement 2 min.
   REMARQUE : Ne pas dépasser les 2 min d’incubation.
3. Ajouter 10 μL de réactif d’isolement mitochondrial B (tampon stabilisateur), agiter le tube à vitesse maximale pendant 5 s et incuber le tube sur de la glace pendant 5 min, en tourbillonnant à vitesse maximale toutes les minutes.
4. Ajouter 800 μL de réactif d’isolement des mitochondries C (tampon de lavage mitochondrial), retourner le tube plusieurs fois pour mélanger et centrifuger le tube à 700 × g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE : Ne pas vortex.
5. Transvasez le surnageant dans un tube neuf de 2,0 mL et essorez-le à 3 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
6. Transférez le surnageant (parties cytosoliques) dans un nouveau tube. La pastille contient les mitochondries isolées.
7. Ajouter 500 μL de réactif d’isolement C des mitochondries à la pastille et centrifuger à 12 000 × g pendant 5 min.
8. Utilisez le granulé pour la quantification et le traitement des protéines ou stockez-le à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Estimation des protéines à l’aide du dosage des microBCA

REMARQUE : L’estimation des protéines pour ce protocole peut être effectuée à l’aide de différents réactifs et dosages. La quantification des protéines cytosoliques ou mitochondriales peut être effectuée en normalisant par rapport à la concentration totale en protéines utilisée dans le dosage.

1. Préparer des étalons d’albumine sérique bovine (BSA) entre 0 μg/mL et 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) et des blancs avec tampon de lyse seulement.
2. Ajouter 150 μL de chaque étalon dans la plaque à fond plat de 96 puits contenant les échantillons.
3. Mélangez 25 parties de Micro BCA Reagent MA (solution d’acide bicinchoninique (BCA)) et 24 parties de Reagent MB (solution de sulfate de cuivre) avec 1 partie de Reagent MC (tampon stabilisant) (25:24:1, Réactifs MA :MB :MC) pour créer un réactif fonctionnel. Ajouter 150 μL de réactif BCA mélangé à chaque échantillon et à chaque étalon.
4. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
5. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurer l’absorbance à 562 nm et quantifier la concentration en protéines à l’aide de la courbe standard. Soustrayez l’absorbance de l’étalon à blanc de la mesure de l’absorbance de tous les autres étalons individuels et des répétitions d’échantillons inconnues pour obtenir les concentrations de protéines de l’échantillon.

4. Contrôle de la qualité de la préparation mitochondriale (western blot)

1. Remettre en suspension le culot mitochondrial dans le tampon RIPA (radio-immunoprécipitation assay buffer) pour effectuer la quantification des protéines. Déterminez la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide du test micro BCA.
2. Dénaturer les échantillons dans le tampon d’échantillonnage à 94 ^°C pendant 5 min.
3. Chargez des quantités égales (20 μg) de protéines mitochondriales dans des gels préfabriqués (voir le tableau des matériaux), ainsi que le marqueur de poids moléculaire.
4. Faites fonctionner le gel pendant 50 min à 100 V.
   REMARQUE : Le temps de fonctionnement peut varier, alors assurez-vous d’arrêter le gel lorsque les protéines ont atteint la fin du gel indiquée par le colorant dans le tampon d’échantillon.
5. Transférez les protéines du gel vers une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide du protocole de transfert sec dans un système de transfert par transfert Western pendant 7 min à 20 V.
6. Retirer la membrane et bloquer à l’aide de la solution bloquante (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante.
7. Ajouter des dilutions appropriées d’anticorps primaires à la membrane dans un tampon de blocage pendant la nuit à 4 ^°C (COXIV = 1:3 000, GAPDH = 1:3 000).
   REMARQUE : L’absence de contamination par le réticulum endoplasmique (RE) nucléaire dans la préparation mitochondriale peut être testée en utilisant des marqueurs supplémentaires tels que lamin (marqueur nucléaire) et ERp57 (marqueur RE) dans les transferts Western.
8. Laver la membrane pendant 3 x 15 min avec le tampon de lavage (Tableau 1).
9. Incuber la membrane avec la dilution appropriée de l’anticorps secondaire conjugué à la HRP dans un tampon de blocage à température ambiante pendant 1 h
10. Laver la membrane pendant 3 x 15 min avec le tampon de lavage.
11. Pour le développement, utilisez un kit de substrat chimiluminescent.
12. Numérisez la membrane à l’aide d’un imageur de gel et de membrane.

5. Isolement des protéines mitochondriales pour l’extraction des N-glycanes à partir de la microglie

1. Remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 μL de tampon d’isolement protéique (tableau 1) et laisser reposer sur de la glace pendant 20 min.
2. Aspirez et distribuez trois fois et laissez reposer 20 min sur de la glace (vortex avant utilisation). Si la pastille mitochondriale n’est pas complètement solubilisée, ajoutez 50 μL supplémentaires du tampon d’isolement et accumulez-le dans le même tube.
3. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 10 min.
4. Récupérer le surnageant, le congeler à -80 ^°C pendant au moins 1 h et le faire sécher autant que possible dans un concentrateur sous vide.
5. Remettre en suspension avant l’isolement des glycanes à l’aide du tampon de digestion PNGase (Tableau 1) pour IR-MALDESI.

6. Préparation de N-glycane mitochondrial pour IR-MALDESI

1. Chargez 25 à 250 μg de protéines (dans un volume maximal de 250 μL) de protéines mitochondriales isolées sur un filtre de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 10 kDa.
2. Réduire les échantillons de protéines pour exposer les fractions glycanes en ajoutant 2 μL de 1 M de dithiothréitol (DTT) à chaque échantillon dans le filtre.
3. Diluez l’échantillon avec 200 μL de tampon de digestion PNGase et agitez légèrement le vortex pour éviter de perturber le filtre.
4. Dénaturer les protéines mitochondriales en incubant l’échantillon à 56 °C pendant 30 min.
5. Utilisez 50 μL d’iodoacétamide 1 M pour alkyler les mitochondries afin d’obtenir une concentration finale de ~200 mM, et incubez à 37 °C pendant 60 min.
6. Pour concentrer davantage les méthodes mitochondriales dénaturées, centrifuger les échantillons à 14 000 × g pendant 40 min. Jetez le flux continu.
7. Lavez l’échantillon avec 100 μL de tampon de digestion PNGase.
8. Concentrez la glycoprotéine sur le filtre à 14 000 × g pendant 20 min et jetez le flux. Répétez l’étape de lavage et de concentration 2 fois, pour un total de 3 fois, ce qui donne un concentré dans le volume mort du filtre (~5 μL). Jetez tous les flux continus.
9. Jetez le flacon de collecte une fois les lavages terminés. Utilisez un nouveau flacon de collecte pour tous les futurs éluants et lavages.
10. Pour séparer les glycanes des glycopatterns mitochondriaux dénaturés, transférez-les dans un flacon de collecte frais et ajoutez 2 μL de PNGase sans glycérol (75 000 unités/mL) au filtre. Ajoutez 98 μL de tampon de digestion PNGase, ce qui porte le volume total à 100 μL et mélangez en pipetant doucement de haut en bas sur le filtre.
11. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 18 h pour cliver enzymatiquement tous les N-glycanes des protéines mitochondriales.
12. Éluer les N-glycanes mitochondriaux libérés en centrifugeant l’échantillon à 14 000 × g pendant 20 min à 20 °C.
13. Lavez les glycanes mitochondriaux en ajoutant 100 μL de tampon de digestion PNGase dans le filtre et centrifugez à 14 000 × g pendant 20 min à 20 °C. Récupérez le nettoyant contenant les N-glycanes restants dans le même flacon de collecte que l’éluant. Répétez l’opération 2 fois et retirez le filtre du flacon de prélèvement.
14. Incuber les échantillons de glycanes mitochondriaux dans le congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient congelés (30 à 60 min) et secs jusqu’à ce qu’ils soient complètement à température ambiante dans un concentrateur sous vide (4 à 6 h pour 400 μL).
    REMARQUE : Les N-glycanes peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 6 mois avant l’analyse.
15. Remettre en suspension les glycanes azotés séchés dans 50 μL d’eau de qualité LC/MS directement avant l’analyse IR-MALDESI.

7. Détection des glycanes libérés par spectrométrie de masse IR-MALDESI

1. Effectuez un étalonnage de masse chaque jour de l’expérience. Chargez la solution d’étalonnage sur un pousse-seringue et poussez à une vitesse de 1,2 μL/min. Appliquez une tension de 3,5 kV pour obtenir un panache d’électronébulisation stable pour l’étalonnage de masse en modes positif et négatif.
2. Pipeter 5 μL de glycanes mitochondriaux remis en suspension sur un point d’échantillon sur une lame de micropuits en téflon.
3. Utilisez un laser infrarouge moyen fonctionnant à une longueur d’onde de 2,97 μm pour l’ablation avec une énergie de 1,8 mJ par rafale.
4. Ioniser et détecter les N-glycanes en mode d’ionisation négative. Utilisez un solvant par électronébulisation composé de 60 % d’acétonitrile et de 1 mM d’acide acétique pour créer un panache d’électropulvérisation stable avec un débit de 2 μL/min à une tension de 3,2 kV.
5. Pour effectuer l’analyse, couplez IR-MALDESI à un spectromètre de masse HRAM réglé sur un pouvoir de résolution de masse de 240 000_FWHM à m/z 200, en analysant entre 500 et 2 000 m/z en mode ionisation négative.
6. Désactivez le contrôle automatique du gain (AGC) et réglez un temps d’injection fixe de 90 ms. Utilisez la source EasyIC pour l’étalonnage interne en temps réel de chaque spectre afin d’obtenir une précision de mesure de masse (MMA) élevée.

8. Analyse des données de N-glycanes mitochondriaux

1. Identifiez manuellement les glycanes liés à l’N en recherchant des masses monoisotopiques et en confirmant les distributions isotopiques à l’aide de l’espacement m/z pour déterminer les ions doublement et triplement chargés qui ont un seuil de flux d’ions minimum de 1 000 ions/s.
2. Convertissez les spectres de masse brute des rapports m/z en masses monoisotopiques neutres.
3. Téléchargez les masses monoisotopiques sur un outil de prédiction de la structure des oligosaccharides en ligne pour déterminer les compositions potentielles des glycanes. Confirmer les annotations à l’aide d’une base de données glycomique organisée expérimentalement²⁰ ; s’assurer que chaque identification se situe dans la marge de 2,5 ppm de MMA, qu’elle contient la structure de base des glycanes liés à l’azote (Hex₃HexNAc₂) et qu’elle exclut les monosaccharides pentose, KDN ou HexA.
4. Dessiner les structures glycanes confirmées à l’aide de la nomenclature SNFG²¹.
5. Obtenez l’abondance relative de glycanes à partir des spectres de masse brute et normalisez-les en fonction de la quantité de protéines mitochondriales en μg pour obtenir des ions/s/μg.
6. Utilisez l’analyse du khi-carré pour tester la qualité de l’ajustement entre les distributions théoriques et expérimentales des glycanes liés à l’azote afin de déterminer le nombre d’adduits au chlore. Cela permet de déterminer directement le nombre d’acides sialiques¹⁹.

Résultats

La figure 1 représente un schéma des étapes impliquées dans l’isolement des mitochondries de la lignée cellulaire microgliale BV2 pour l’analyse des glycanes par spectrométrie de masse. La reproductibilité de l’isolement des protéines mitochondriales entre différentes préparations mitochondriales à partir de la même densité de départ des cellules microgliales est représentée à la figure 2, qui ne montre aucune différence significative entre la concentration de p...

Discussion

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du cerveau, et les modifications des glycanes modulent l’immunophénotype et la fonction de la microglie. Ces fonctions immunitaires exigent une énergie cellulaire substantielle, qui est principalement fournie par les mitochondries. Notamment, les protéines mitochondriales présentent également des modifications des glycanes, qui sont restées largement sous-étudiées en raison des défis technologiques dans l’étude de la glycosylation ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipment
Amersham 600 imager	Cytvia  ;	29194217	Imageur gel et membrane
Countess 3 compteur de cellules automatisé	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
Dry Bath Stdrd 4 blck 100-120V	Thermofisher scientific  ;
i-Blot2 Dispositif de transfert de gel	Invitrogen	IB21001	Système de transfert Western blot
Microscope inversé Cell	Treat	04355223EA
Lecteur		82050-760
Mini réservoir de gel	Invitrogen	A25977
Bascule en plein air	Fisher Brand	88861025
Pipet garçon  ;	BioTek	229310
Mélangeur vortex	Integra- VWR
Réactifs d’isolement des mitochondries  ;
Mitochondrial Kit d’isolation	Thermofisher scientific  ;	89874
Inhibiteur de la phosphotase	Thermofisher scientific  ;
Inhibiteur de protéase	Thermofisher scientific  ;	Isolement des 1861281
<>N-glycane et réactifs IR-MALDESI
acétique fort  ;	Fisher Scientific	A11350	50 % dans le solvant ESI
Acétonitrile  ;	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM dans un solvant ESI
Bicarbonate d’ammonium  ;	Fisher Scientific	A643500	100 mM
Solution d’étalonnage	Thermofisher Scientific	A39239	Pierce FlexMix
Dithiothreitol  ;	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
Iodoacétamide	Sigma Aldrich	A322-10VL
Eau de qualité LC/MS	Thermofisher Scientific	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL, enzyme pour la libération de N-glycanes  ;
Consommables d’isolement <>N-glycane et IR-MALDESI
Amicon Fisher	Scientific  ;	UFC501024	Spectromètre de masse MWCO 10 kDa
	Orbitrap Exploris 240
Mid-IR Laser	JGM Associates, Burlington, MA, États-Unis
Lame de micropuits en téflon	Prosolia, Indianapolis, IN, États-Unis<
Logiciels d’analyse de N-glycanes>Logiciels d’analyse de N-glycanes
GlycoMod  ;	Expasy  ;		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy  ;		https://glyconnect.expasy.org/
Consommables d’isolement des protéines et de western blot  ;
Conseils de chargement de gel Basix ( 10 & micro ; L)  ;	Basix	13-611-102
Embouts de chargement de gel Basix ( 200 µ ; L)  ;	Basix	13-611-116
Racleur de cellules	VWR labs	14-388-100
i-Blot NC piles régulières	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF piles régulières	Invitrogen	IB24001
10  ; µ ; L micropipette	Fisher Scientific	FBE00010
20 & micro ; L micropipette	Invitrogen	FBE00020
200  ; µ ; Micropipette L  ;	Fisher Brand	FBE00200
1000 & micro ; L micropipette	de marque Fisher	FBE01000
10  ; µ ; L pointes de pipette  ;	VWR labs	76322-528
20  ;   ; Pointes de pipette L	VWR labs	76322-134
200  ; µ ; L pointes de pipette  ;	VWR labs	76322-150
1000  ;   ; L pointes de pipette	VWR labs	76322-154
Plaque à puits  ;		14-388-100
de marque Fisher Anticorps
Actin ( Hôte : Lapin )	Cell Signaling Technologies	8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked  ;	Cell Signaling Technologies	7074S
Bolt 4-12 % Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
Bovine Serum Albumin	Fisher bioréactifs	BP9700-100
Anticorps COXIV (Hôte : Lapin)	Cell Signaling Technologies	4844S
Anticorps GAPDH (Hôte : Lapin)	Cell Signaling Technologies	2118S
Kit de dosage des protéines MicroBCA	Thermofisher scientific  ;	23235
Nupage MOPS SDS Tampon de Runing [20x]	Thermofisher scientific  ;	NP0001
PAGE Règle échelle de protéines pré-colorée	Thermofisher scientific  ;	815-968-0747	Dilution = Utilisation 7  ; µ ; L à charger sur le premier puits
Saline tamponnée au phosphate  ;	Aniara Diagnostics	A12-9423-5	Préparer 1x PBS à partir de 10x poudre  ;
Pierce ECL Western Blot Substrat	Thermofisher scientific  ;	32106	Kit substrat chimiluminescent
RIPA Buffer	Thermofisher scientific  ;	89901
Tampon d’échantillonnage	Novex	B0007	Le tampon d’échantillon bolt LDS est préparé dans un rapport de 3:1 entre l’échantillon et le tampon d’échantillon
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
Consommables de culture tissulaire  ;
Countess Lames	Avantor	229411
tubes Eppendorf	Cell Treat	414004-265612-5884
Pipette aspirante 2 mL	Vista lab	5090-0010E
5 mL pipette sérologique  ;	Fisher Scientific	13-678-11D
Pipette sérologique de 10 mL.	Pipette	13-678-11E
25 mL	Pipette sérologique Vista lab	FB012937
50 mL	lab	14955233
15 mL Tube conique	Avantor	229225A
Tube conique de 50 mL	Cell treat	4190-0050
T-75 cm2 Fiole de culture tissulaire	Fisher Scientific
T-180 cm2 Fiole de culture tissulaire	Fisher Scientific	FB012939
Réactifs de culture tissulaire  ;
BV2 lignée cellulaire microgliale  ;	Bioarray créatif  ;	CSC-I2227Z	Microglie de souris immortalisée (BV2) dérivée de la microglie néonatale C57/BL6  ;
Enzymes de dissociation cellulaire  ;	Thermofisher scientific  ;	12563029	TrypLE  ;
Milieu Eagle modifié (DMEM) à faible teneur en glucose de Dulbecco  ;	Gibco	10567014
Sérum de bovin fœtal	Cytiva	SH30071.03HI
Essential Medium (MEM) Acides aminés non essentiels Gibco		11140050
Penicillium Streptomycin	Cytivia	SV30010
Tampon phosphate salin	Corning	21-040-CV
Trypan Blue colorant 0,4 %	Invitrogen	Réf. T10282