Analyse multimodale des microplastiques dans l’eau potable à l’aide d’une canalisation d’analyse à nanomembrane de silicium

Summary

Ici, nous présentons un protocole mettant en valeur un substrat optiquement transparent et plat pour la capture et l’analyse rationalisées des particules contaminantes dans l’eau potable. Le Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) est présenté ici : un pipeline flexible pour la capture, la quantification et l’identification des particules dans les milieux liquides.

Abstract

L’impact biologique de la pollution par les microplastiques dans les sources d’aliments et d’eau humaine est largement inconnu, et les sources d’eau potable ne sont pas exemptes de cette contamination par les microplastiques. Ici, nous présentons une approche simplifiée pour capturer, quantifier et identifier les microplastiques dans l’eau potable. Nous présentons un flux de travail analytique appelé Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) qui tire parti de nouvelles nanomembranes de nitrure de silicium qui permettent un « facteur de concentration » significatif, qui consolide les particules en suspension dans une zone d’observation planarisée pour une analyse de particules individualisée, quantifiable et multimodale sur le même substrat. Les principaux avantages de SNAP proviennent de son utilisation de membranes ultraminces à base de nitrure de silicium logées dans des disques filtrants de taille conventionnelle, permettant la capture et l’analyse directes de MP polymères sur un fond non polymère. Des échantillons d’eau potable provenant de la région de Rochester, dans l’État de New York, ont été prélevés à partir de sources résidentielles et analysés à l’aide de SNAP. Les particules de chaque échantillon ont été caractérisées par microscopie optique et électronique à balayage (MEB), spectroscopie Raman et spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX), et divers constituants identifiés ont été quantifiés proportionnellement au total des particules capturées.

Introduction

Les microplastiques sont définis comme des polymères synthétiques mesurant moins de cinq millimètres et dont la taille^{est 1,2}. La pollution par les microplastiques (MP) est une préoccupation croissante pour la santé humaine, l’environnement et l’environnement. La contamination par les MP a été constatée dans des sources d’eau de tous types ; l’eau douce, les océans et même les sources d’eau potable³. Les MP sont générés à partir de la décomposition des sources primaires de plastique⁴, ainsi que des textiles synthétiques ^5,6,7. Les MP sont omniprésents et ont été trouvés dans les tissus humains, tels que le placenta humain, les matières fécales et le sang ^8,9,10. Il y a un intérêt croissant pour la recherche sur les MP, comme en témoignent plus de 4 100 et 4 600 publications en 2023 et 2024, respectivement (données PubMed ; mot-clé « microplastiques »), ainsi qu’une préoccupation croissante du public concernant l’exposition humaine aux MP. En réponse à une préoccupation croissante du public, plusieurs organismes de réglementation gouvernementaux tels que l’État de Californie¹¹ et plusieurs pays de l’UE¹², ont mis en œuvre (ou mettront en œuvre) des règlements sur les concentrations de MP dans l’eau potable. Compte tenu de tout ce qui précède, l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis a récemment annoncé que les MP étaient un nouveau contaminant préoccupant. Cependant, l’évaluation des risques pour l’homme est gravement entravée par le manque de méthodes permettant une détection fiable et reproductible des MP.

La caractérisation des MP s’appuie sur des méthodes analytiques telles que la microscopie optique et électronique¹³, et les techniques spectroscopiques et spectrométriques ^1,14,15 pour comprendre les caractéristiques visuelles des MP⁷ et leur composition, respectivement. Les échantillons contenant des MP doivent faire l’objet de plusieurs analyses visant à caractériser, identifier et quantifier les MP, et nécessiter au moins une spectroscopie ou une spectrométrie (c.-à-d. spectroscopie Raman, spectroscopie infrarouge ou chromatographie en phase gazeuse par pyrolyse-spectrométrie de masse, etc.) conformément à certaines exigences minimales de certaines revues pour la mesure des plastiques dans les échantillons environnementaux, telles que Science of the Total Environment¹⁶. La spectroscopie Raman est plus polyvalente que la spectroscopie infrarouge (IR), en particulier en ce qui concerne l’identification des matériaux dans les échantillons biologiques. La spectroscopie Raman est une technique de diffusion de la lumière, qui lui permet d’analyser plus facilement les particules plus petites que l’IR, une technique d’absorption de la lumière qui nécessite des particules plus grosses et a plus de contraintes sur le placement des échantillons¹⁷. Il a déjà été suggéré que les substrats pour la spectroscopie Raman comprenant du silicium ou de l’oxyde de silicium peuvent donner des résultats fiables avec un bruit de fond minimal¹⁸.

Les substrats de certaines techniques d’analyse qui sont généralement compatibles avec un type d’analyse (c’est-à-dire les substrats recouverts d’or requis pour la spectroscopie IR) ne sont pas souvent compatibles avec la microscopie optique à transmission et/ou à réflectance. Par la suite, le sous-échantillonnage répété est populaire parmi les chercheurs pour produire des échantillons appropriés pour chaque analyse distincte, mais le sous-échantillonnage prend du temps et pourrait exclure les particules de faible abondance ^1,2,6. En règle générale, les transferts manuels de particules d’un substrat à l’autre sont nécessaires pour analyser la même particule à des fins de caractérisation et d’identification par différentes modalités d’analyse, mais ces transferts manuels lents augmentent la probabilité de biais, de contamination et de perte, et limitent l’analyse des MP aux particules de plus grande taille qui peuvent être manipulées^{manuellement13}. Ces flux de travail sous-optimaux présentent de nombreux défis et problèmes de fiabilité, contribuant à la variabilité significative de la quantification des MP signalée dans la littérature ^3,7.

Ici, nous présentons un flux de travail analytique que nous appelons le pipeline d’analyse de nanomembranes de silicium (SNAP) pour capturer, caractériser, identifier et quantifier les MP, et démontrer l’utilité de SNAP en analysant des échantillons d’eau potable provenant de la région de Rochester, dans l’État de New York. La SNAP est rendue possible par des disques filtrants de taille conventionnelle de 25 mm de diamètre avec des nanomembranes de silicium intégrées (voir le tableau supplémentaire S1 pour les propriétés de la membrane), qui offrent un substrat uniforme pour la concentration et l’analyse des MP de l’eau potable à l’aide de plusieurs techniques^15,19. Après avoir concentré et capturé séquentiellement des MP sur des nanomembranes avec des tailles de coupure décroissantes (nitrure de silicium microporeux (MPSN) de 20 μm avec pores cylindriques et nitrure de silicium micro-fendu de 8,0 μm (MSSN) avec pores de prisme rectangulaires), SNAP facilite trois étapes analytiques consécutives : 1) coloration de l’échantillon, microscopie optique et quantification des MP, 2) identification des particules par spectroscopie Raman, suivie de 3) caractérisation des particules par microscopie électronique à balayage (MEB), permettant des analyses multiples des mêmes particules capturées sur un substrat de nanomembrane.

Nous faisons la démonstration de plusieurs pipelines SNAP en utilisant à la fois des disques filtrants à nanomembrane de silicium (SiN) non revêtus et des disques filtrants à nanomembrane de silicium revêtus d’or (Au-SiN) : Pipeline A) SNAP réalisé sur SiN et caractérisant séquentiellement les mêmes MP à l’aide de plusieurs techniques analytiques ; Pipeline B) SNAP réalisé sur Au-SiN avec spectroscopie Raman ; et pipeline C) SNAP réalisé sur Au-SiN avec MEB équipé d’une spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) (figure 1). Les variantes SNAP sont donc des flux de travail analytiques flexibles et rationalisés qui peuvent être utilisés pour un certain nombre de types d’échantillons et de techniques analytiques. Contrairement aux méthodes publiées précédemment qui reposent sur des membranes polymères¹¹, les avantages de SNAP découlent de son utilisation de nanomembranes de silicium, où les MP polymères synthétiques sont capturés sur une membrane non polymère à base de silicium, ce qui permet l’identification de la composition des MP sur un fond non polymère. De plus, les nanomembranes de silicium offrent des plans focaux uniformes contrairement aux membranes polymères, qui ont tendance à se froisser, ce qui permet de multiples techniques de microscopie et de spectroscopie automatisées.

Nous avons précédemment caractérisé l’utilisation des nanomembranes de silicium pour l’analyse des MP par modélisation analytique, défis de particules modèles et échantillons d’eau potable et d’air^19,20, ainsi qu’en comparant leurs propriétés de filtration et de microscopie optique à l’aide de particules modèles par rapport à quatre membranes largement utilisées¹⁵. Dans ce protocole, nous démontrons de manière heuristique l’utilité de SNAP pour l’analyse des MP dans quatre échantillons d’eau potable. Des échantillons ont été prélevés dans quatre sources d’eau distinctes dans la grande région de Rochester, dans l’État de New York. Chaque échantillon inclus dans cette étude provenait d’une source d’eau de surface distincte, comme le lac Ontario, le lac Hemlock, un mélange de pruche et d’Ontario, et le lac Canandaigua (figure 2). Les particules capturées dans ces sources d’eau potable comprenaient des plastiques répandus comme le polystyrène (PS) et le polyéthylène (PE), des métaux lourds comme le fer, la silice et des particules non synthétiques.

Protocol

1. Procédures de contrôle de la qualité et préparations de solutions ultrapures

1. Nettoyage de la cagoule à flux laminaire et des gants
   1. Enfilez l’EPI (équipement de protection individuelle) : blouse de laboratoire 100 % coton et gants en nitrile.
      REMARQUE : L’EPI est continu tout au long du protocole.
   2. Vaporisez des gants en nitrile avec de l’alcool isopropylique à 99 % (IPA). Frottez-vous les mains, puis rincez avec de l’eau filtrée de ~18 MΩ, 0,22 μm. Faites-le 3 fois pour retirer l’agent de démoulage des gants.
   3. Pliez une lingette délicate en fibres naturelles en quartiers, puis vaporisez avec 70 % d’IPA. Essuyez la surface de la capuche de l’arrière vers l’avant en effectuant de longs mouvements, en repliant la lingette délicate sur une surface inutilisée tous les deux coups. Continuez à nettoyer la hotte jusqu’à ce que toutes les surfaces aient été nettoyées, en remplaçant la lingette par une neuve une fois qu’elle a été souillée.
   4. Découvrez le tapis roulant en silicone et roulez sur la surface de la capuche pour ramasser les particules restantes. Pour nettoyer le rouleau en silicone, vaporisez de l’IPA à 99 % et frottez avec une main gantée, puis rincez à l’eau filtrée à 18 MΩ, 0,22 μm. Répétez l’opération 3 fois, puis laissez sécher à l’air libre dans la capuche.
   5. Rincez à nouveau les gants comme à l’étape 1.1.2.
2. Eau ultrapure et production d’IPA.
   1. Remplissez un bécher de 1 L avec 18 MΩ d’eau et placez-le dans la hotte.
   2. Amorcez une seringue de 60 mL et un filtre de seringue de coupure de 0,22 μm en filtrant au moins 200 mL d’eau de 18 MΩ à travers la seringue et le filtre attaché.
      REMARQUE : Un pousse-seringue permet de gagner du temps, mais n’est pas nécessaire pour exécuter le protocole décrit.
   3. Rincer 3 fois un récipient en verre à bouchon à vis avec de l’eau filtrée de 18 MΩ et 0,22 μm. Remplir avec de l’eau filtrée 18 MΩ filtrée par seringue de 0,22 μm.
   4. Répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.3 avec le % de concentration souhaité d’alcool isopropylique au lieu de 18 MΩ, avec une eau filtrée de 0,22 μm pour générer de l’alcool isopropylique ultrapur.

2. Capture de particules à partir d’échantillons liquides par filtration

REMARQUE : Le protocole ci-dessous peut être utilisé avec des échantillons liquides autres que l’eau. Les méthodes de prélèvement d’échantillons validées doivent être laissées à la discrétion de l’investigateur en fonction des besoins de son étude et de l’échantillon.

1. Enfilez l’EPI.
   REMARQUE : Assurez-vous que les gants et les surfaces de la capuche sont nettoyés conformément aux étapes 1.1.2-1.1.5.
2. Vaporisez un joint en silicone avec de l’IPA ultra-pur à 99 %, frottez avec des doigts gantés, puis rincez à l’eau ultrapure. Répétez cette opération 3 fois pour chaque joint.
   REMARQUE : Le nombre de joints à utiliser dans la filtration est égal au nombre de disques filtrants à utiliser, plus 1. Reportez-vous à la Figure 1B pour le graphique d’assemblage visuel.
3. À l’aide de la seringue amorcée à l’étape 1.1.2, rincez l’intérieur de la seringue de 60 ml avec de l’eau ultrapure en absorbant 30 ml d’eau ultrapure et 30 ml d’air dans la seringue. Vissez un filtre de seringue, puis secouez vigoureusement et distribuez. Répétez cette opération 3 fois.
   REMARQUE : N’importe quelle taille de seringue peut être utilisée si nécessaire en fonction du volume de l’échantillon.
4. Assemblez l’appareil de filtration comme indiqué sur le graphique d’assemblage visuel de la figure 1B.
   REMARQUE : Utilisez une pince à épiler propre pour manipuler les disques filtrants et les joints d’étanchéité lors du montage et du démontage.
   1. Pour les filtrations séquentielles, assurez-vous qu’il y a un joint entre le disque et la fritte de support, un joint entre chaque disque et un joint entre le disque et l’entonnoir de filtration.
   2. Assurez-vous que les disques sont ordonnés avec le plus grand filtre de coupure en haut de la pile et le plus petit filtre de coupure en bas.
5. Allumez l’aspirateur sur l’appareil de manière à ce qu’il y ait un écoulement négatif à travers la pile de disques filtrants.
6. Mesure de la contamination de fond
   REMARQUE : Le processus suivant permet d’évaluer le nettoyage de la seringue et la génération de milieux ultrapurs, ainsi que de déterminer les particules de fond apportées par les composants du système.
   1. À l’aide de la seringue rincée, versez lentement 50 ml d’eau ultrapure sur la nanomembrane au centre du disque supérieur pour vous assurer que tout le liquide distribué est filtré.
      REMARQUE : Si vous filtrez de plus grands volumes d’échantillons (c.-à-d. >50 ml), un entonnoir de filtration en verre est suggéré. Nettoyez l’entonnoir de filtration en verre comme à l’étape 2.3. Du matériel de laboratoire supplémentaire peut entraîner un risque supplémentaire de contamination par des particules. Maintenez la diligence dans les procédures de nettoyage et confirmez toujours la propreté avec des filtrations à blanc avant d’utiliser les échantillons d’intérêt.
   2. Laissez filtrer l’eau ultra-pure. Gardez l’aspirateur allumé pendant une minute supplémentaire après la filtration. Une fois que l’échantillon est complètement sec, éteignez l’aspirateur.
   3. Retirez soigneusement les disques filtrants des joints d’étanchéité à l’aide d’une pince à épiler propre et placez les disques dans le récipient propre et étiqueté approprié pour le stockage, comme une boîte de Pétri en verre ou une boîte sombre.
   4. Imagez les disques filtrants au microscope pour l’analyse optique, le comptage des particules, etc.
7. Pour les échantillons liquides, nettoyez un joint supplémentaire comme à l’étape 2.2. Procurez-vous une nouvelle seringue pour chaque échantillon de milieu liquide unique et répétez l’étape 2.3.
8. Prélevez la quantité souhaitée d’échantillon et distribuez lentement l’échantillon sur la nanomembrane au centre du disque supérieur.
9. Une fois la filtration de l’échantillon terminée, effectuez 3 rinçages avec 1 ml d’eau ultrapure pour vous assurer que toutes les particules de l’échantillon ont été suffisamment rincées de toutes les surfaces sur la membrane au centre du disque filtrant.
10. Gardez l’aspirateur allumé pendant une minute supplémentaire pour sécher complètement l’échantillon rincé 3 fois, puis éteignez l’aspirateur.
    1. Répétez les étapes 2.7 à 2.10. pour chaque répétition à effectuer de l’échantillon d’intérêt.

3. Préparation et coloration du colorant fluorescent

REMARQUE : La coloration fluorescente au rouge du Nil et/ou au bleu trypan peut interférer avec les lasers de spectroscopie Raman d’intérêt.

1. Coloration au rouge du Nil (NR)
   1. Enfilez l’EPI.
   2. Nettoyez les gants et la cagoule comme aux étapes 1.1.2 à 1.1.5.
   3. Terminer la filtration de l’échantillon comme indiqué aux étapes 2.7 à 2.10.
   4. Rincez 3 fois deux récipients en verre à bouchon à vis avec de l’eau ultrapure.
   5. Préparez une solution de 0,1 mg/mL de NR dans de l’alcool isopropylique ultrapur à 99 % dans un récipient en verre propre.
   6. Retournez doucement 10x pour mélanger.
   7. Filtrez la solution NR à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm dans le deuxième récipient en verre.
      REMARQUE : Le filtre utilisé pour préfiltrer le NR doit avoir une coupure plus petite que le filtre utilisé pour filtrer les échantillons.
   8. Placez le disque filtrant à teindre sur la fritte de support de la fiole de récupération sous vide.
   9. Pipeter 20 μL de la solution de NR à 0,1 mg/mL sur la nanomembrane au centre du disque filtrant.
      REMARQUE : La teinture doit couvrir entièrement la surface poreuse de la nanomembrane. Si 20 μL ne suffisent pas, ajoutez une coloration supplémentaire jusqu’à ce que toutes les zones poreuses de la nanomembrane soient convenablement recouvertes de colorant.
   10. Incuber la teinture pendant 5 min.
   11. Filtrez la tache sous vide une fois l’incubation terminée.
   12. Rincer 3 fois avec 1 ml d’IPA ultra-pur à 99 % pour éliminer toute tache de NR en excès.
       REMARQUE : Passez à la section Coloration au bleu trypan ci-dessous après cette étape si une contre-coloration doit être effectuée.
   13. Laissez le disque filtrant reposer sur la fritte de support avec l’aspirateur allumé pendant 2 min pour filtrer et sécher tout liquide résiduel. S’il n’est pas sec après 2 min, transférez le disque filtrant à l’aide d’une boîte de Pétri en verre propre dans un four à 70 °C pendant 2 à 5 min.
   14. Une fois sec, effectuez la microscopie à fluorescence comme décrit à l’étape 2.6.4 et passez à la section 4.
2. Coloration au bleu trypan (TB)
   1. Enfilez l’EPI.
   2. Nettoyez les gants et la cagoule comme indiqué aux étapes 1.1.2 à 1.1.5.
   3. Terminez la filtration de l’échantillon des étapes 2.7 à 2.10 ou commencez par l’étape 3.2.4.
   4. Rincez 3 fois deux récipients en verre à bouchon à vis avec de l’eau ultrapure.
   5. Préparez une teinture à 0,4 % de TB dans un récipient.
      REMARQUE : Le filtre utilisé pour préfiltrer le TB doit avoir une limite plus petite que le filtre utilisé pour filtrer les échantillons.
   6. Retournez doucement 10x pour mélanger.
   7. Filtrez la solution de coloration TB à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm dans le deuxième récipient à bouchon à vis en verre.
      REMARQUE : Le filtre utilisé pour préfiltrer le TB doit avoir une limite plus petite que le filtre utilisé pour filtrer les échantillons.
   8. Placez le disque filtrant à teindre sur la fritte de support de la fiole de récupération sous vide.
   9. Pipette 20 μL de la coloration à 0,4 % de TB sur la nanomembrane au centre du disque filtrant.
      REMARQUE : La teinture doit couvrir entièrement la surface poreuse de la nanomembrane. Si 20 μL ne suffisent pas, ajoutez une coloration supplémentaire goutte à goutte jusqu’à ce que toutes les zones poreuses de la nanomembrane soient convenablement recouvertes de la tache.
   10. Incuber la teinture pendant 5 min.
   11. Filtrez la tache sous vide après l’incubation pendant 5 min.
   12. Rincer 3 fois avec des volumes de 1 mL d’eau ultrapure.
   13. Laissez le disque filtrant reposer sur la fritte de support avec l’aspirateur allumé pendant 2 min pour filtrer et sécher tout liquide résiduel. S’il n’est pas sec après 2 min, transférez le disque filtrant à l’aide d’une boîte de Pétri en verre propre dans un four à 70 °C pendant 2 à 5 min.
   14. Une fois sec, effectuez la microscopie à fluorescence comme décrit à l’étape 2.6.4 et passez à la section 4.

4. Quantification des particules par microscopie à fluorescence

1. Capture d’images en microscopie optique
   1. Immobilisez le disque filtrant sur une lame de microscope à l’aide d’un joint en silicone, ou utilisez une lame d’alignement spécifique au disque filtrant utilisé avec une platine de microscope. Déplacez le disque filtrant à imager jusqu’à la platine du microscope.
   2. Imagez la nanomembrane à l’aide d’un éclairage en fond clair de sorte que le nombre maximum détecté soit ~ 90  % de la portée maximale de la caméra du détecteur.
      REMARQUE : Cette valeur de 90 % est de ~59 000 pour un détecteur 16 bits avec des niveaux de blanc à 65 535.
   3. Imagez la nanomembrane à l’aide d’un éclairage fluorescent de sorte que les intensités maximales des pixels soient d’environ ~25 % de la portée maximale de la caméra du détecteur.
   4. Enregistrez l’image dans un format TIFF composite 16 bits.
2. Quantification des particules par microscopie à fluorescence
   1. À l’aide de la plate-forme d’analyse d’images, séparez le(s) canal(s) fluorescent(s) du TIFF composite généré en 4.1.4 du canal en fond clair à l’aide de la fonction Split-Channels .
   2. Limitez les intensités de pixels à l’aide de la fonction Threshold à une valeur de 10 000.
      REMARQUE : Si une floraison est présente sur les particules, le seuil est trop bas et doit être élevé.
   3. Enregistrez une image distincte au format PNG.
   4. Supprimer l’image pour supprimer les pixels de bruit à l’aide de la fonction Supprimer les taches .
   5. Plage d’extension de l’image à l’aide de la fonction Plage d’ouverture .
      REMARQUE : Cette fonction sépare les particules adjacentes de taille similaire, au prix de la fragmentation de grosses particules contiguës en morceaux plus petits. Comme il y a souvent beaucoup plus de petites particules que de grosses particules, cela peut être un bon compromis, mais peut avoir des effets involontaires, tels que la fragmentation de longues fibres en brins de petites particules. Inspectez les résultats de l’image avant d’accepter les données.
   6. Réglez l’échelle des images fluorescentes seuillées en mesurant la largeur d’un pore dans l’image en fond clair. Utilisez la largeur des pores mesurée pour définir l’échelle en pixels/μm.
      REMARQUE : Pour les pores rectangulaires, la plus petite largeur correspondra à l’étiquette du produit. Pour les pores circulaires, le diamètre correspondra à celui de l’étiquette du produit spécifiant la taille des pores (c’est-à-dire la coupe) de la nanomembrane.
   7. Appliquez la fonction Compter les particules de la plate-forme d’analyse d’images à l’image fluorescente seuillée, en évaluant la zone, min et max.
   8. Traitez les images fluorescentes et en fond clair pour créer des composites qui visualisent les domaines fluorescents.
   9. Seuilz l’image fluorescente en utilisant la même valeur qu’à l’étape 4.2.2.
   10. Fusionnez les canaux à l’aide de la plate-forme d’analyse d’images. Attribuez le canal fluorescent au canal Rouge et l’image en fond clair au canal Gris .
   11. Enregistrez le composite sous forme de fichier PNG.

5. Spectroscopie Raman

1. Allumez l’instrument Raman et son ordinateur associé, en leur permettant de démarrer.
2. Ouvrez le logiciel sur l’ordinateur connecté à l’instrument Raman.
3. Lorsque le logiciel est initialisé, assurez-vous que l’activité actuelle du système et l’état du détecteur sur le ruban inférieur de l’écran du programme indiquent Prêt et sont de couleur verte, respectivement.
4. Si le bouton d’autoétalonnage (AC) en bas de l’écran est rouge, exécutez l’autoétalonnage souhaité et laissez-le se terminer avant de continuer.
5. Si vous n’utilisez qu’un seul laser et un seul réseau :
   1. Cliquez sur Quitter sur l’écran d’étalonnage automatique, puis sélectionnez le laser et le réseau souhaités dans leurs listes déroulantes respectives sous Configuration de l’instrument dans l’onglet Acquisition.
   2. Revenez au bouton AC rouge en bas de l’écran et cliquez sur Laser/Réseau actuel et laissez la routine d’étalonnage s’exécuter.
6. Si vous utilisez tous les lasers et réseaux, sélectionnez simplement Tous les lasers et réseaux et laissez le système fonctionner.
7. Si vous utilisez plus d’un laser et/ou réseau, sélectionnez les lasers/réseaux personnalisés et sélectionnez tous les paramètres souhaités. Ensuite, laissez l’étalonnage s’exécuter.
8. Sélectionnez l’objectif 20x longue distance de travail (LWD) sur la tourelle d’instruments et dans le logiciel sous Paramètres de l’instrument dans l’onglet Acquisition .
9. Si cet objectif n’est pas disponible, utilisez un autre objectif à faible grossissement (par exemple, 5x ou 10x) avec une distance de travail adaptée à la hauteur du disque filtrant.
   REMARQUE : Commencez avec un objectif de grossissement plus faible pour faciliter la navigation initiale à travers la nanomembrane du disque filtrant.
10. Placez le disque filtrant sur la platine du microscope de manière à ce qu’il se trouve dans le chemin optique.
11. Cliquez sur Acquisition vidéo dans le ruban supérieur pour activer l’optique de visualisation.
12. Utilisez les roues de mise au point grossières et fines de l’instrument pour mettre au point la nanomembrane du disque filtrant.
13. Équarrissez grossièrement les pores avec les lignes de curseur sur l’écran de l’ordinateur.
14. Faites pivoter doucement le disque filtrant sur la platine pour obtenir cet alignement carré, ou utilisez une lame d’alignement spécifique pour une utilisation du disque filtrant dans une platine de microscope.
15. Sous l’onglet Acquisition en haut à droite, assurez-vous que le mode d’éclairage sélectionné est Fond sombre pour de meilleurs résultats.
16. Pour acquérir une image assemblée, accédez à l’onglet Vidéo dans le ruban Onglets de données.
17. Naviguez jusqu’au premier champ de vision souhaité, puis cliquez sur le bouton Mosaïque en haut à droite de la fenêtre vidéo et ajoutez-l’ajouter à la carte. Naviguez vers le coin extérieur opposé de la zone souhaitée avec le joystick d’instrument et ajoutez-là à la carte.
18. Exécutez l’acquisition de la mosaïque avec ViewSharp pour vous assurer que toutes les zones sont correctement nettes dans l’image finale.
    REMARQUE : Les objectifs à faible grossissement prendront moins de temps pour l’acquisition de la mosaïque d’images, tandis que les objectifs à fort grossissement prendront plus de temps.
19. Une fois la mosaïque d’images créée, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image et appuyez sur Envoyer à ParticleFinder.
20. Accédez à l’onglet ParticleFinder dans le ruban en haut à droite pour interagir avec les paramètres de seuillage.
21. Pour vous assurer que les particules appropriées sont sélectionnées, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’image sous l’onglet de données ParticleFinder pour cocher les cases Centre, Particule et Transparence. Réglez le curseur de transparence sur 50 % et la taille de pixel du centre sur 2 px.
    REMARQUE : la sélection Centre placera un point au centre de chaque particule, et la sélection Particule placera une superposition sur chaque zone déterminée comme étant une particule, avec une transparence de 50 %. Ces paramètres localisent chaque particule et définissent les bords de chaque particule.
22. Si nécessaire, modifiez les paramètres de seuillage des particules et de sélection de la morphologie/taille sous l’onglet ParticleFinder sur le côté droit du programme pour vous assurer que toutes les particules et leurs paramètres de taille/forme sont correctement identifiés. Voir le tableau supplémentaire S2 pour un exemple de la façon dont les paramètres morphologiques peuvent être appliqués.
    1. Si la détection automatique des particules n’est pas suffisante, passez en mode manuel et ajustez progressivement les valeurs de seuillage jusqu’à ce que la majorité des objets corrects soient identifiés comme des particules.
    2. Si la morphologie des particules détectées doit être affinée, cochez la case Appliquer des filtres morphologiques. Sélectionnez les paramètres appropriés et leurs intensités dans les menus déroulants résultants.
       REMARQUE : L’ordre dans lequel les paramètres sont sélectionnés peut avoir un impact sur la sortie.
23. Si la taille, la forme ou d’autres qualités morphologiques des particules sont des facteurs critiques, cochez la case Appliquer le préfiltre des particules, puis sélectionnez et modifiez les paramètres selon vos besoins.
24. Une fois que les particules ont été identifiées et que leurs formes/bords sélectionnés sont acceptables, naviguez dans la liste d’aperçu déroulante des images de particules dans la section Résultats . Sélectionnez la ou les particules d’intérêt en cliquant sur l’image de particule associée.
25. Activez l’affichage en direct à l’aide du bouton de la caméra vidéo en haut de l’écran.
26. Passez à l’objectif 50x LWD en cliquant sur le nombre de grossissement et en sélectionnant l’objectif correspondant dans le menu déroulant, dans l’application au bas du ruban.
27. Remettez la ou les particules au point à l’aide du bouton de réglage fin, si nécessaire.
28. Capturez des images de particules individuelles à analyser avec la spectroscopie Raman et enregistrez les images dans des fichiers séparés avec des noms appropriés.
29. Assurez-vous que la zone souhaitée de la particule à analyser par spectroscopie Raman est correctement positionnée sous l’emplacement du faisceau laser.
30. Une fois que la zone appropriée de la particule est sélectionnée pour l’analyse, appuyez sur le bouton STOP ALL en haut de la fenêtre pour désactiver l’optique de visualisation.
31. Réglez le laser sur 532 nm, à 1 % de puissance pour les particules non colorées, et à 785 nm ou 830 nm pour les particules colorées par fluorescence.
32. Réglez le temps d’acquisition sur 10 s et les accumulations sur 5.
33. Sélectionnez l’onglet Spectra dans le menu des onglets de données, puis appuyez sur le bouton de lecture pour lancer l’affichage en temps réel (RTD).
    REMARQUE : Utilisez les informations obtenues lors du RTD pour optimiser les paramètres.
34. Une fois satisfait des paramètres et des résultats, appuyez sur STOP ALL pour arrêter le RTD.
35. L’acquisition finale peut maintenant être récupérée en appuyant sur le bouton circulaire Spectrum Aquisition à côté du bouton RTD.
36. Enregistrez les spectres collectés dans des fichiers séparés avec les noms appropriés.
37. Répétez les étapes 5.28 à 5.36. pour chaque particule d’intérêt.
38. Une fois l’échantillon terminé, retirez le disque filtrant et renvoyez l’objectif dans le 20X LWD à la fois manuellement sur l’oscilloscope et dans le logiciel.
39. Répétez l’étape 5.10-5.37 pour les nouveaux échantillons.

6. Identification spectrale

1. Si vous n’avez pas accès à une base de données spectrale Raman achetée ou créée par vous-même, accédez à la bibliothèque de spectroscopie open source à l’adresse suivante : https://www.openanalysis.org/openspecy/
   REMARQUE : OpenSpecy est une base de données de spectroscopie Raman et IR open source qui comprend 636 spectres provenant de trois bibliothèques différentes de 276 polymères et matériaux applicables à l’identification des MP et des fibres^{environnementales 21}. Les données spectrales pré- et post-traitées sont tout aussi viables pour une utilisation avec cette ressource.
2. Enregistrez les spectres Raman sous forme de fichiers .csv individuels.
   1. Étiquetez la colonne A comme numéro d’onde suivi des numéros d’onde des spectres, et la colonne B doit être étiquetée Intensité suivie des valeurs d’intensité de crête par numéro d’onde.
3. Ouvrez les spectres en faisant glisser et en déposant le fichier .csv dans la barre de navigation en haut à gauche.
4. Activez Prétraitement et identification.
5. Sous Prétraitement, activez Bruit de signal de seuil, Normalisation min-max, Lissage/Dérivée, Numéros d’onde conformes et Correction de base.
   REMARQUE : Les paramètres spécifiques peuvent être ajustés en fonction des caractéristiques individuelles des spectres analysés.
6. Sous Identification, sélectionnez Raman comme type de spectre et Dérivé comme Transformation de bibliothèque.
   REMARQUE : Cette bibliothèque peut également être utilisée pour la spectroscopie IR. La fenêtre d’analyse affiche un spectre blanc, le spectre téléchargé pour l’analyse, et un spectre rouge, la correspondance d’identification suspectée.
7. Pour tout spectre qui ne renvoie pas de correspondance r > 0,70, ou des corrélations raisonnables de forme de pic, utilisez les 5 premiers résultats suggérés comme point de départ pour rechercher des correspondances potentielles selon vos préférences.
8. Assurez-vous que les valeurs de crête mesurées sont à ± 10 numéros d’onde d’un pic correspondant dans les spectres de référence sélectionnés avant de confirmer une correspondance pour ce pic.
9. Enregistrez les corrélations spectrales, leurs valeurs de corrélation et la base de données d’où provient la correspondance suspectée.
10. Téléchargez des fichiers en fonction de vos besoins individuels.

7. Microscopie électronique à balayage

REMARQUE : Si le disque filtrant n’est pas recouvert de métal avant l’analyse MEB, passez à la section 7.2.

1. Revêtement métallique d’échantillons pour MEB
   1. Montez le disque filtrant sur un talon de MEB en acier à l’aide de ruban de carbone.
   2. Insérez dans un pulvérisateur et pompez la chambre à 50 mTorr.
   3. Ouvrez la vanne d’isolement Ar (Argon) de pulvérisation.
   4. Purger le système en introduisant Ar dans la chambre à l’aide d’une vanne à pointeau jusqu’à une pression de 300 mTorr, puis évacuer la chambre jusqu’à 50 mTorr. Répétez l’opération 3 fois.
   5. Ajuster la pression finale à 100 mTorr à l’aide d’une vanne à pointeau.
   6. À l’aide d’une cible Au, déposez l’Au sur le disque filtrant par pulvérisation.
      REMARQUE : D’autres sources cibles (par exemple, Pt, Ir, Si, etc.) peuvent également être utilisées à la place de Au ; Un courant de 20 mA produit 0,1 angströms/s de dépôt à 100 mTorr.
   7. Ventilez le système et retirez le disque filtrant. Gardez le disque filtrant collé sur le talon en acier inoxydable.
2. Capture d’image MEB
   1. Fixez le talon au support Zeiss Auriga à plusieurs étages à l’aide d’une vis de réglage.
   2. Allumez le SEM et les ordinateurs qui l’exécutent, et autorisez-les chacun à démarrer.
   3. Ouvrez le logiciel attaché au SEM.
   4. Vérifiez que le système est sous vide (5e-6 Torr).
   5. Ventez le sas en appuyant sur Vent sur le corps principal de la chambre du sas et ouvrez le verrou.
   6. Montez le support à plusieurs étages sur le gabarit d’insertion revêtu de téflon et fixez le bras de transfert à l’aide de la plaque à vis fournie.
   7. Fermez le sas de charge et pompez le verrou de charge en appuyant sur Store sur le corps principal de la chambre de verrouillage de charge.
      REMARQUE : La fin se produit lorsque les voyants verts cessent de clignoter sur le bouton Store .
   8. Chargez le support à plusieurs étages sur la platine dans la chambre d’observation principale en ouvrant la porte de transfert.
   9. Appuyez sur Transfer sur le corps principal du verrou de charge. La porte tombera et exposera la chambre intérieure.
   10. Insérez le bras de verrouillage (vissé dans le support multi-étages) et fixez le support multi-étages à la scène.
   11. Dévissez le bras de transfert du verrou de charge et rétractez-le complètement pour qu’il réside dans le verrou.
   12. Fermez la porte de transfert en appuyant sur Transférer.
   13. Ouvrez la vanne d’isolement en appuyant sur EHT dans le coin inférieur droit du logiciel.
   14. Ajustez la distance de travail à 5 mm dans la zone de données du logiciel et la tension d’accélération à 20 kV.
   15. Localisez la membrane du disque filtrant à l’aide des joysticks XY et Z.
   16. Soulevez la platine à l’aide du joystick Z jusqu’à ce que l’image soit nette.
   17. Corrigez l’astigmatisme en ajustant les boutons de stigmatisation XY et la molette de mise au point sur la console centrale.
   18. Imagez des particules d’échantillon au grossissement souhaité en ajustant la molette de grossissement sur la console centrale, capturant des images d’une résolution de 2 048 x 1 536 au format TIFF 8 ou 16 bits.
3. Analyse des particules EDX
   1. Désactivez le CCD ChamberScope sur le bureau de l’ordinateur SEM.
      REMARQUE : Si cette étape n’est pas terminée, le détecteur EDX sera submergé de signal et aucune donnée ne sera enregistrée.
   2. Refroidissez le détecteur EDX en ouvrant le logiciel APEX EDX sur l’ordinateur EDX, en allumant le détecteur dans le menu du coin supérieur droit.
   3. Capturez une image MEB basse résolution qui peut être utilisée pour le mappage, en cliquant sur Capturer l’image.
   4. Ouvrez le menu de l’onglet Mappage en haut de l’écran du logiciel.
   5. Sous Paramètres, ajustez la résolution (256 x 256), le temps de séjour des pixels (0,16 μs) et le numéro d’image (32-64) pour fournir une estimation du temps de capture qui doit durer ~5 min.
   6. Cliquez sur Créer une carte dans le coin supérieur gauche du menu.
   7. Sélectionnez Confirmer l’aperçu de l’élément pour ajuster manuellement la recherche d’élément ou utilisez les pics identifiés automatiquement du logiciel.
   8. Générez un rapport à l’aide de la fonction AutoReport dans la section supérieure droite du logiciel de cartographie une fois terminé.

Results

Ébauches de processus et contamination de fond
Un résultat blanc acceptable est un résultat qui ne contient aucune particule ou si peu de particules que la contamination de fond (c’est-à-dire le processus) (le cas échéant) ne présente pas une forte probabilité de confondre ou de perturber les résultats de l’expérience. Un résultat à blanc sous-optimal est un résultat qui contient de nombreuses particules que les particules d’intérêt seront difficiles à distinguer de la contamination de fond.

Le niveau acceptable de contamination du procédé doit être égal ou aussi proche que possible de zéro, mais si zéro ne peut être atteint, la cohérence du nombre de particules de fond observées est essentielle. Exécutez plusieurs échantillons vierges pour déterminer la cohérence des résultats. La diligence dans les protocoles de contrôle de la qualité (voir la section 1), l’atténuation de la contamination et de bonnes conditions environnementales pendant le traitement sont primordiales pour maintenir de faibles niveaux de contamination de fond. Les résultats de contamination de fond et l’acceptabilité peuvent également dépendre fortement de la coupure des nanomembranes utilisées et de la propreté globale des conditions de laboratoire. Il faut tenir compte du fait que lors de l’analyse de particules plus petites avec des membranes de coupure plus faibles (p. ex., < 8 μm), l’abondance relative des particules d’intérêt et des contaminants de fond de taille similaire augmentera de façon exponentielle, ce qui nécessitera l’application de niveaux plus élevés de rigueur dans le contrôle de la qualité²². Bien que tout niveau de contamination ne soit pas acceptable, tant que les conditions sont étroitement contrôlées et qu’un degré élevé d’uniformité est atteint, de bonnes analyses des microplastiques environnementaux ou des analyses d’intérêt peuvent tout de même être effectuées.

Filtration des échantillons
Une filtration d’échantillon idéale est nécessaire pour générer une analyse multimodale fidèle, comme le montre l’exemple de cascade de données de la figure 3. Une telle filtration de l’échantillon entraînera des particules bien dispersées à la surface de la nanomembrane (par exemple, avec une couverture d’environ un tiers de la surface de la membrane). Des particules mal dispersées, comme dans le cas de l’agrégation de particules (grands amas de particules qui se chevauchent), confondront les méthodes de comptage de particules manuelles et automatisées, car les particules qui se chevauchent ne sont pas facilement différenciées avec confiance. Ces données sont généralement exclues de l’analyse, ce qui peut entraîner la perte d’informations précieuses d’intérêt. Les particules bien dispersées, comme le montrent les figures 4A et B, garantissent que toute analyse spectroscopique ou de quantification n’est pas compliquée par des particules empilées ou chevauchées de compositions variables, qui pourraient donner des résultats plus difficiles à interpréter, à identifier et à quantifier avec précision.

Coloration rouge du Nil et bleu trypan
Des images représentatives d’instances optimales de coloration des particules fluorescentes sont présentées à la figure 3B sur un disque filtrant SiN de coupure de 20 μm. Un rinçage insuffisant de la coloration NR ou TB de la surface de la nanomembrane peut créer des résultats faussement positifs. Les particules résiduelles composées de l’une ou l’autre des taches retenues à la surface de la membrane en raison d’un rinçage insuffisant peuvent être interprétées à tort comme des particules tachées. Un signe qu’un rinçage insuffisant s’est produit est si des zones de la nanomembrane sans particules ou films/résidus résiduels détectables de l’échantillon filtré sont fluorescentes pendant l’observation, comme le montre la figure 5A. Après l’imagerie, tant que le disque filtrant a été maintenu dans des conditions propres, un nouveau rinçage peut être effectué en replaçant le disque filtrant à nanomembrane individuel sur l’appareil de filtration sous vide (sans les joints), en allumant le vide et en filtrant un autre volume d’IPA ultra-pur à 99 % (pour NR) ou d’eau ultrapure (pour TB) sur la nanomembrane du disque filtrant. Notez le volume total de produit de rinçage supplémentaire utilisé. Pour de meilleurs résultats, prenez des images microscopiques de toute la surface de la nanomembrane avant d’effectuer un nouveau rinçage afin de tenir compte de toute contamination potentiellement encourue par l’étape de rinçage.

Spectroscopie Raman
La spectroscopie Raman réalisée sur du SiN non enrobé peut produire un pic proéminent en fonction de la longueur d’onde du laser, et ce pic peut masquer des signaux de faible abondance approximativement dans la région de nombre d’onde de 520 ^{cm-1 23}. Si les spectres Raman d’intérêt sont suffisamment séparés du pic de fond de silicium ou de nitrure de silicium, l’utilisation de disques filtrants SiN non revêtus devrait donner des résultats de spectroscopie Raman adéquats. Dans le présent rapport, les pipelines B et C utilisaient tous deux des disques filtrants Au-SiN. Le revêtement doré d’Au-SiN masque le pic de Si inhérent, ce qui permet de collecter de manière plus fiable les spectres de faible abondance à proximité ou à des numéros d’onde de 520 ^cm-1 . De plus, Au-SiN peut être utilisé avec la spectroscopie IR si Raman n’est pas disponible. Commencez toujours par les réglages de puissance les plus bas (c’est-à-dire l’intensité laser) sur l’instrument, puis augmentez progressivement, car certaines particules d’intérêt peuvent être fragiles, telles que les particules oxydées, et peuvent être endommagées ou détruites par le laser.

Lors de l’analyse de particules choisies avec la spectroscopie Raman, il est crucial de déterminer la fiabilité d’un spectre renvoyé. Certaines particules peuvent s’auto-fluorescentes, et cette fluorescence ajoutera du bruit dans la mesure spectrale, ce qui peut masquer ou compliquer l’interprétation du signal des particules. Ce bruit prendra la forme d’une bande de haute intensité qui s’étend sur une large gamme de numéros d’onde, confondant les données sous-jacentes. Les spectres appropriés, démontrés dans les figures 3C et 4C, D, même avant la correction de la ligne de base, auront des pics clairement définis sur des plages plus courtes de numéros d’onde. S’il n’y a pas de pics au moins trois fois plus importants que les signaux environnants, il est probable que les spectres collectés sont soit du bruit de fond, soit que différents réglages d’instruments sont nécessaires pour analyser la particule en question. Assurez-vous que la longueur d’onde laser appropriée est sélectionnée pour chaque échantillon. Les lasers de longueur d’onde inférieure, tels qu’un laser de 532 nm, ne peuvent pas gérer suffisamment le signal généré par la fluorescence. Un laser de longueur d’onde plus élevée, tel qu’un laser de 782 nm ou de 830 nm, peut ignorer suffisamment de fluorescence pour renvoyer un spectre. Selon le type d’échantillon, différents lasers conviendront à différents types de particules et, si possible, pourront être interchangés lors de la collecte de données sur un seul disque filtrant.

Pour déterminer la composition des particules, leurs spectres collectés sont comparés à ceux d’une base de données de spectres de référence. L’identification fiable d’un spectre de particules donné donnera un coefficient de Pearson (r) supérieur à 70 % (r > 0,70). Les données Raman sous-optimales sont illustrées à la figure 5B, où sont < 0,70. Les résultats de l’identification des MP sont utiles pour déterminer les sources potentielles de pollution par les MP. Pour afficher les résultats de l’identification des particules, une image et des spectres de la particule analysée peuvent être présentés comme dans les figures 3C et 4C.

Microscopie électronique à balayage
Les disques filtrants SiN et Au-SiN sont compatibles avec le MEB immédiatement après la capture des particules par filtration. Si les disques filtrants SiN ne sont pas recouverts d’Au ou de Pt avant le MEB et après la capture des particules, certaines particules peuvent être plus facilement « chargées » par le faisceau d’ionisation du MEB, ce qui peut faire briller la particule ou l’afficher très brillante sur les images. Cette luminosité/lueur peut entraîner des problèmes de visualisation en raison d’un faible contraste, comme le masquage de la morphologie de la particule. Pour atténuer les effets, effectuez une microscopie optique/de fluorescence et une spectroscopie Raman avant MEB pour marquer toute particule difficile à analyser ou de petite taille d’intérêt pour une analyse MEB/EDX ultérieure, puis enduire la nanomembrane d’Au ou de Pt comme indiqué à la section 7 du protocole, et effectuer MEB/EDX.

Le revêtement SiN ou Au-SiN avec de l’Au ou du Pt après la capture des particules et avant l’analyse MEB permet de prévenir cet effet de charge pendant l’imagerie, car les particules ne sont plus sensibles à l’ionisation sous la couche métallique éliminée. Ce revêtement améliore le contraste et la résolution, de sorte qu’une meilleure compréhension morphologique d’une particule donnée peut être obtenue, comme le montre la figure 3D (fibre vs fragment) ou des morphologies de surface, telles que les puits et les fissures sur les particules oxydées. Les particules de revêtement métallique avant l’analyse MEB les empêcheront définitivement d’être analysées davantage par spectroscopie ou imagerie par fluorescence, ce qui rendra seules les analyses MEB/EDX encore possibles. L’enrobage des particules et la réalisation de MEB/EDX devraient donc être les dernières étapes de tout processus, si elles sont prévues.

Les mesures EDX peuvent être effectuées sur des particules capturées avant et après le revêtement métallique. EDX peut révéler la composition élémentaire spécifique d’une particule ou d’une zone donnée, qui se marie bien avec toutes les particules plus petites que la limite de taille de détection pour l’analyse Raman, ou les compositions élémentaires qui peuvent être difficiles à analyser avec certaines longueurs d’onde laser Raman telles que le métal, les alliages, les particules saturées d’eau et les particules qui deviennent fortement fluorescentes lorsqu’elles sont exposées au(x) faisceau(x) laser Raman disponible(s). Dans cette étude, les particules ont été recouvertes d’une couche d’or de 6 nm d’épaisseur. L’imagerie MEB a été réalisée avec un grossissement de 200x à 3 000x avec une puissance de faisceau de 20 kV et une distance focale de 5 mm. Les images MEB respectives des particules sélectionnées sont présentées à la figure 3D.

Des résultats EDX représentatifs sont présentés à la figure 3F. Les éléments détectés avec un pourcentage en poids inférieur à 1 % peuvent être considérés comme traces ou peu fiables en fonction de la sensibilité de l’instrument ; Par conséquent, nous avons fixé un seuil à 1 %. Si les particules sélectionnées pour l’analyse EDX ont été revêtues, une quantité détectable du revêtement sera présente dans le rapport de données élémentaires. Si vous utilisez des disques filtrants SiN non revêtus, des signaux Si et N seront observés, comme le montre la figure 3F. La plupart des particules de polymère synthétique contiennent également les éléments C, H et O, malheureusement, car la plupart des particules non synthétiques de sources biologiques sont également constituées des mêmes éléments, mais les particules non synthétiques pourraient également inclure des éléments tels que S, comme dans le cas des protéines. Cette similitude de composition est la raison pour laquelle la méthode de contre-coloration avec Nile Red et Trypan Blue est utile pour différencier les particules synthétiques des particules non synthétiques, mais n’est pas un outil d’identification exhaustif, car Nile Red est également capable de colorer les particules non synthétiques dans certains cas également. Des paramètres d’analyse supplémentaires tels que ceux suggérés ci-dessus doivent être utilisés conjointement avec toute procédure de coloration pour confirmer les résultats. De plus, EDX peut être un outil utile pour identifier potentiellement les particules qui sont en dehors de la limite de taille de détection pour la spectroscopie Raman (c’est-à-dire les nanoplastiques mesurant < 1 μm).

Figure 1 : Pipelines SNAP. (A) Schémas des pipelines SNAP, caractérisant les mêmes particules sur la même nanomembrane via une série de techniques analytiques différentes. Pipeline A) démontre 1) Les particules d’intérêt capturées dans des échantillons d’eau potable par filtration sous vide sont 2) colorées au rouge du Nil et au bleu trypan pour différencier les particules polymères synthétiques et non synthétiques, respectivement, suivies de 3) identification des particules par spectroscopie Raman, et 4) MEB/EDX pour caractériser la morphologie des particules et l’identification élémentaire. Pipeline B) démontre 1) la capture de particules sur Au-SiN suivie de 2) la spectroscopie Raman. Pipeline C) démontre 1) la capture de particules sur Au-SiN suivie d’un MEB/EDX. (B) Schéma du disque filtrant et du joint en silicone dans la configuration de filtration de l’appareil à vide, représentant la filtration séquentielle à travers une nanomembrane MPSN de 20 μm, puis MSSN de 8,0 μm, séparée par des joints en silicone. Abréviations : SNAP = Pipeline d’analyse de nanomembranes de silicium ; MEB = microscopie électronique à balayage ; EDX = spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie ; MPSN = nitrure de silicium microporeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Sources de prélèvement d’échantillons d’eau potable. Une carte régionale publiée par la Monroe County Water Authority illustrant les emplacements où chacun des quatre échantillons d’eau potable a été prélevé dans la région du Grand Rochester, dans l’État de New York. Les échantillons provenaient de différentes sources d’eau de surface : lac Ontario (bleu), lac Hemlock (vert), lac Hemlock et lac Ontario (jaune) et lac Canandaigua (violet). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résumé des analyses de la canalisation A de SNAP sur des particules capturées dans des échantillons d’eau potable. (A) Image en niveaux de gris des particules capturées à partir d’un échantillon représentatif d’eau potable sur une coupure de 20 μm SiN. (B) Image superposée faussement colorée de particules contre-colorées pour représenter le rouge du Nil (particules rouges faussement colorées) et le bleu trypan (particules bleues faussement colorées). (C) Spectres Raman de référence (rouge) et collectés (blanc) identifiant une particule colorée au rouge du Nil comme étant du polyéthylène avec une valeur r de Pearson de 0,97, avec une image représentative de la particule analysée. (D) Micrographie électronique de deux types de particules différents montrant l’analyse morphologique d’une fibre (panneau supérieur) et d’un fragment (panneau inférieur), tous deux reprenant la coloration au bleu trypan. (E) Quantification des particules colorées au rouge du Nil capturées séquentiellement sur des nanomembranes de coupure de 20 μm et 8 μm. (F) Analyse élémentaire EDX résumée d’un fragment sélectionné au hasard et détails analytiques des résultats avec image MEB représentative de la particule analysée. Abréviations : SNAP = Pipeline d’analyse de nanomembranes de silicium ; MEB = microscopie électronique à balayage ; EDX = spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résumé des analyses de la canalisation SNAP B effectuées sur des particules capturées dans des échantillons d’eau potable. Analyse spectrale Raman de trois particules aléatoires provenant de quatre échantillons d’eau potable domestiques capturés sur des disques filtrants Au-SiN de 20 μm MPSN et 8,0 μm MSSN. Des images représentatives en fond noir de la surface totale active de la membrane pour les 20 μm et 8 μm Au-SiN sont respectivement présentées en A et B. Les particules apparaissent jaunes dans ce mode d’imagerie tandis que l’arrière-plan reste sombre, ce qui facilite le comptage automatique des particules. Spectres Raman représentatifs de particules synthétiques et non synthétiques sur (C) 20 μm et (D) 8,0 μm Au-SiN. Le nombre total de particules pour (E) 20 μm et (F) 8,0 μm Au-SiN est regroupé par plages de tailles déterminées par le logiciel de recherche automatisée de particules. Abréviations : SNAP = Pipeline d’analyse de nanomembranes de silicium ; MEB = microscopie électronique à balayage ; EDX = spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie ; MPSN = nitrure de silicium microporeux ; MSSN = nitrure de silicium à microfente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résultats sous-optimaux de l’imagerie de fluorescence et de la spectroscopie Raman. (A) Une image de fluorescence sous-optimale de particules colorées (panneau de gauche), où la membrane a conservé la coloration rouge du Nil, probablement due à un sous-rinçage. Deux particules, une fibre colorée au bleu de Trypan et un fragment coloré au rouge du Nil (panneau de droite), ont été sélectionnées pour la spectroscopie Raman. (B) Résultats de spectroscopie Raman sous-optimale où le coefficient de Pearson (r) est inférieur à 70 % (r < 0,70). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Propriétés des nanomembranes de silicium dans les disques filtrants. Ce tableau illustre les propriétés des membranes à l’intérieur des disques filtrants en SiN, y compris la taille minimale des pores, le pourcentage de porosité, l’épaisseur des membranes avec et sans revêtement Au, la surface active de la membrane et la perméance aux gaz à travers la membrane avec une pression positive appliquée à une pression constante définie. La coupure (c’est-à-dire la taille des pores), la porosité, l’épaisseur et la surface de la membrane sont déterminées en mesurant les caractéristiques sur les images MEB. Les données de perméance aux gaz sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 10) pour une pression positive N 2 appliquée à 103,42 kPa. Abréviations : Au = Or ; Si_x N_y = nitrure de silicium non stœchiométrique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Nombre de particules et paramètres de ParticleFinder. Des mosaïques d’images de toute la surface de la membrane ont été prélevées sur chaque échantillon, et chaque mosaïque d’images a été analysée pour recueillir le nombre total de particules. Ce tableau présente les paramètres utilisés et l’ordre dans lequel déterminer le nombre total de particules pour chaque image d’échantillon, ainsi que le nombre de particules à des fractions de taille données. Les paramètres varient d’un échantillon à l’autre en fonction du type, de la quantité et de la forme des particules, ainsi que de la réflectivité spécifique de chaque membrane lors de l’imagerie. Les données de ce tableau sont illustrées à la figure 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’atténuation de la pollution par les microplastiques est un sujet de préoccupation croissant. Et la première étape de l’atténuation consiste à identifier la présence d’une contamination. Une méthode rationalisée de capture et d’analyse immédiate est essentielle pour faire gagner du temps aux enquêteurs et préserver les indicateurs sensibles. Ce rapport décrit des flux de travail flexibles basés sur des variantes de nos méthodes SNAP développées pour l’analyse de ces MP dans des échantillons liquides, en utilisant un seul substrat pour toutes les analyses effectuées. L’échantillon doit être filtré sous vide de sorte que les particules soient capturées et isolées sur une nanomembrane de silicium logée à l’intérieur d’un disque filtrant. Une atténuation suffisante de la contamination de fond est essentielle pour obtenir des résultats significatifs. Toute particule contaminante sur la seringue de distribution ou l’entonnoir à vide en verre pendant la filtration peut contaminer l’échantillon et être capturée simultanément, de sorte qu’il est essentiel de suivre avec diligence les protocoles de contrôle de la qualité de la section 1 pour obtenir des résultats précis. Il est recommandé d’utiliser uniquement des supports pour informer les enquêteurs de la contamination de fond propre à chaque procédé et aux conditions de laboratoire. Le protocole décrit dans le présent document repose sur la filtration sous vide d’un échantillon liquide, ainsi que sur la capture et l’isolement des particules de l’échantillon sur deux disques filtrants SiN de coupure différents. Pour tous les pipelines, la capture et l’isolement des particules doivent précéder les autres méthodes, mais toutes les autres méthodes d’identification peuvent être effectuées dans l’ordre le plus approprié pour l’enquêteur.

Deux microscopes fluorescents ont été utilisés pour cette étude afin de démontrer la répétabilité des résultats entre les instruments. Les étapes d’instruction détaillent spécifiquement l’utilisation d’un Olympus BX61 pour la microscopie fluorescente en raison de la prédominance de son utilisation et a été utilisé selon les instructions de l’instrument en utilisant le fond clair pour l’imagerie en niveaux de gris, le canal TRITC (Ex. ~543 nm ; Em. ~593 nm) pour l’imagerie de particules colorées NR, et le canal Cy5 (Ex. ~649 nm ; Em. ~667 nm) pour l’imagerie de particules colorées au TB, le cas échéant. Pour afficher les résultats de la coloration, nous recommandons de construire une superposition des images du canal (nous utilisons FIJI/ImageJ pour le traitement de l’image, ci-après dénommé plate-forme d’analyse d’image), à une résolution de 2 048 x 2 040 pixels et à une profondeur de 16 bits. Des images entières de nanomembranes peuvent être affichées comme dans la figure 4A,B ou comme des régions d’intérêt sélectionnées comme le montre la figure 3A,B.

Le rouge du Nil est couramment utilisé pour colorer les polymères synthétiques MP, mais peut colorer les polymères non synthétiques de sources biologiques en raison de sa nature lipophile et hydrophobe, introduisant potentiellement des faux positifs qui faussent les résultats de quantification des MP 24,25,26. Une étape de contre-coloration au bleu trypan, telle que décrite dans la section 3 du protocole, est recommandée pour aider à différencier les événements faussement positifs, mais n’est pas une solution exhaustive et doit être associée à des mesures d’analyse supplémentaires pour confirmer les résultats. La fluorescence des particules du rouge du Nil est un problème avec l’analyse par spectroscopie Raman car elle peut augmenter considérablement le signal de fond. Dans cette étude, cependant, nous avons contre-coloré des polymères avec du rouge du Nil et du bleu trypan avant la spectroscopie Raman avec un laser de 830 nm, et peu de bruit a été observé, comme le montre la figure 3.

Certaines longueurs d’onde des lasers adaptés à la spectroscopie Raman ne sont pas capables d’ignorer la fluorescence des particules colorées, comme un laser de 532 nm, et peuvent donc introduire une difficulté significative dans l’estimation correcte de la composition de la particule d’intérêt. Le revêtement métallique des particules après la capture est utile pour améliorer le contraste lors de l’imagerie MEB, mais est incompatible avec toute analyse spectroscopique ou fluorescente ultérieure. Prenez note de toutes les mesures souhaitées avant la configuration expérimentale pour vous assurer que le flux de processus et les types de revêtement sont correctement pris en compte. Les disques filtrants Au-SiN peuvent être utilisés pour toutes les analyses mentionnées où la microscopie en transmission n’est pas cruciale pour le flux de travail, ou lorsque la spectroscopie Raman ou IR est utilisée.

Les méthodes présentées ici, ainsi que les nanomembranes utilisées pour capturer et isoler les particules d’intérêt, peuvent être modifiées pour répondre aux besoins de chaque chercheur. Les nanomembranes conviennent à un certain nombre d’analyses spectroscopiques, et l’enquêteur peut échanger le média filtré contre un autre milieu d’échantillon d’intérêt, y compris, mais sans s’y limiter, des tissus animaux digérés²⁷, des produits pharmaceutiques injectables et des échantillons d’huile. Deux instruments de spectroscopie Raman ont été utilisés pour cette étude, et les étapes d’instruction détaillent spécifiquement l’utilisation d’un instrument Raman Horiba XploRA Plus, qui a collecté et traité toutes les données présentées à la figure 4. Il est également important de respecter la limite de taille de détection pour chaque microscope Raman, afin de s’assurer que les particules d’intérêt peuvent être correctement analysées avec la taille du spot des lasers de l’instrument. Pour afficher les résultats d’identification des particules avec Raman, les spectres de référence et d’échantillon, ainsi qu’une image de la particule analysée, peuvent être représentés comme dans les figures 3C et 4C.

La section 6 du protocole détaille les instructions pour l’identification des particules à l’aide d’une bibliothèque spectrale open source. La capture planarisée des particules sur une membrane uniformément plane, ainsi que le réseau régulier de pores de la membrane, permettent une imagerie prévisible et automatisée. L’épaisseur de 400 nm ou 1 000 nm du SiN et sa composition en nitrure de silicium leur confèrent une excellente transparence optique, mais peuvent également renvoyer un pic de silicium intense dans certains paramètres d’instruments spectroscopiques. Des précautions doivent être prises lors de l’utilisation de SiN nu, non revêtu de métal, avec analyse Raman. Le pic Si peut fonctionner comme un signal d’étalonnage, mais l’intensité du pic peut également masquer les signaux des spectres de plus faible intensité dans la même région de numéro d’onde que le signal Si. De tels pics de Si n’ont pas été observés lors de l’utilisation du laser à 830 nm dans cette étude.

La nature ultramince du SiN (400 nm ou 1 000 nm d’épaisseur) et de l’Au-SiN (520 nm ou 1 120 nm d’épaisseur) utilisés ici leur confère leurs excellentes propriétés de filtration, optiques et spectroscopiques. Cependant, ces membranes doivent être protégées contre les dommages physiques, tels que la pression différentielle excessive (c’est-à-dire ≥-206 kPa), le contact direct avec une pince à épiler ou les doigts, ou un mauvais placement du joint d’étanchéité. Le disque filtrant qui abrite les membranes les protège et permet une manipulation facile dans des conditions normales d’utilisation. Lorsque vous manipulez les disques filtrants, ne touchez que l’anneau extérieur noir, et jamais la zone active de la membrane. Bien qu’elle ne soit pas rapportée quantitativement ici, la collecte des particules capturées sur une petite quantité de surface de membrane (3 x 3 mm pour les membranes de coupure de 20 μm et 3 x 0,7 x 3 mm pour les membranes de coupure de 8,0 μm, respectivement) réduit potentiellement le temps total d’analyse des échantillons, en réduisant le temps nécessaire pour trouver et analyser les particules d’intérêt. Ce « facteur de concentration » mérite d’être exploré ultérieurement et pourrait offrir un avantage unique des disques filtrants SiN pour les chercheurs. En combinaison avec leurs débits normalisés en surface plus élevés par rapport à d’autres membranes largement utilisées pour la caractérisation MP¹⁵, les routines d’imagerie automatisée des particules qui ne nécessitent d’imager qu’une zone relativement plus petite de SiN uniformément plat et net peuvent réduire davantage les temps d’analyse totaux. Cependant, tous les avantages liés au facteur de concentration hypothétique doivent encore être démontrés empiriquement en comparant les temps de traitement totaux (de la filtration à l’analyse d’image) sur des disques filtrants conventionnels et SiN.

Nous avons démontré de manière heuristique l’utilité des variations SNAP sur des échantillons locaux d’eau du robinet. Le protocole décrit ici se concentre sur le captage des MP à partir de sources d’eau potable autour de Rochester, dans l’État de New York. Le prélèvement des échantillons s’est déroulé de la manière suivante : pour chaque prélèvement d’échantillons, au moins un litre d’eau a été coulé dans le robinet avant le début de la collecte. De nouvelles bouteilles en polypropylène scellées ont été acheminées au robinet et ouvertes directement avant la collecte. Les bouteilles n’ont pas été rincées à l’eau potable avant le début de la collecte. Chaque échantillon était constitué de deux bouteilles de 500 mL prélevées, l’une après l’autre. Chaque échantillon d’eau provenait du système de tuyauterie d’un ménage distinct, et le matériau de la tuyauterie n’était pas uniforme tout au long de l’échantillonnage. Des variables telles que la quantité d’eau utilisée récemment, le moment de la collecte, l’âge des tuyaux et l’âge de la maison d’où provient l’échantillon n’ont pas pu être contrôlées dans cette étude. Il ne s’agissait pas d’un protocole de prélèvement d’échantillons validé. Chaque chercheur doit élaborer et valider ses propres procédures de collecte. Toutefois, par souci de divulgation complète des méthodes, la description ci-dessus est incluse. Les disques filtrants permettent des analyses répétées sur le même substrat pour un certain nombre de méthodes analytiques. Il n’est pas nécessaire d’effectuer un sous-échantillonnage ou d’échantillonner plusieurs échantillons en dehors des répétitions d’essai standard. L’élimination du besoin de sous-échantillonnage et de plusieurs échantillons augmente la confiance dans la collecte d’information sur les cibles de faible abondance. En plus de la mise en œuvre de méthodes d’analyse multimodales, les disques filtrants SiN offrent un avantage certain par rapport à d’autres médias de filtration analogues en raison de la qualité rapide d’un taux de filtration plus rapide par unité de surface¹⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Bécher en verre	Pyrex	1000-1L
1 L Flacon de collecte sous vide en verre	Millipore Sigma	Z290459-1EA
Blouse de laboratoire 100 % coton	Landau	LA-3172
100 mL entonnoir de filtration en verre  ;	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
Alcool isopropylique à 99 %	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		Logiciel utilisé pour effectuer l’analyse EDX sur les particules capturées.
Denton Prep Système de pulvérisation cathodique	Denton Vacuum	DESK II : 293618089	Système de revêtement Gold
FIJI, plate-forme d’analyse d’images	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI est simplement ImageJ) - une distribution de ImageJ  ;
Bouteille en verre à bouchon à vis	Corning  ;	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Horiba Raman logiciel contenant ParticleFinder et ViewSharp
Capot à flux laminaire	Air Science	VLF-72A
Microscope  ;	Olympus  ; / Nikon	BX61 / Ti2e	Tout microscope avec une fluorescence appropriée peut être utilisé pour la microscopie optique.  ;
MPSN Filtres SiN	SiMPore Inc.	FD25-8.0-Au ; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Seringues Monoject 60 mL	Coviden	8881560265
Nile Red poudre	TCI	N0659
Gants en nitrile	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		Open source, bibliothèque spectrale
Four	VWR	1310	Gravity Four utilitaire à convection
P20 Pipette	Brandtech	705872
Pointe de pipette	Premium Vials	GS 151140R
Support pourous frit	Advantec	311000	Fait partie du bundle
Instrument Raman	Horiba	Xplora PLUS
Bouchon en caoutchouc	Advantec	311000	Fait partie du bundle
Instrument SEM	Ziess	Auriga	Auriga Series, poste de travail modulaire à poutres transversales
Joints en silicone	SiMPore	GASKET-25-R	Joints PDMS en fonte transparente, 0,8 mm d’épaisseur
Rouleau	en silicone Sanyue	;( ASIN : B07XDTNPS3)	Rouleau en silicone -  ; 8 x 5 x 2 pouces
SmartSEM	Zeiss	V8	SEM logiciel utilisé pour faire fonctionner les filtres à seringue Zeiss Auriga
Spray	bottle Uline	S-7273
;	Thermo Scientific	CH2225-PES	0.22 & micro ; Filtres pour seringues M Luer Lock, 25 mm  ;
Pompe à seringue	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	En option, mais recommandé
Bleu Trypan - 0.4 %	Millipore Sigma	T8154-20ML
Pince à épiler	SiMPore	K6TWZR
Pompe à vide	Welch	847-676-8800
Tube à vide	Grainger	ZUSA-HT-4037