Article de méthode

Nouveau modèle d’îlots pour l’étude 3D des interactions endothéliales et β cellulaires : pertinence pour le dépistage des agents cytoprotecteurs

DOI :

10.3791/68220

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17 avril 2026

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1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit une procédure détaillée pour générer des sphéroïdes stables des îlots pancréatiques murins, ainsi que des méthodes détaillées pour la coloration, le nettoyage et le montage en 3D, adaptées à leur petite taille.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille une méthode optimisée pour la production de petits sphéroïdes stables, leur culture et l’imagerie 3D, pour l’étude des interactions endothéliales et cellules β productrices d’insuline dans un modèle 3D des îlots pancréatiques. Les sphéroïdes de 150 à 200 μm, reflétant la plage la plus basse de tailles d’îlots, ont été préparés à partir d’un rapport sélectionné combinant 1 cellule endothéliale intra-îlot (cellules MS-1) à 20 cellules sécrétentes d’insuline (β-TC-6). Les défis de coloration, de défrichage et de montage des petits sphéroïdes ainsi que leur montage par l’utilisation de l’agarose à faible point de fusion et la technique de dégagement CUBIC sont détaillés, ainsi que des points clés pour une analyse efficace de la structure 3D avec différentes sondes. Les données indiquent que la NTPDASE-ectonucléotidase 3 ne colocalise pas avec l’insuline dans le modèle sphéroïde, suggérant des niveaux de maturité et de fonctionnement variables de β-TC6, et que la procédure complète peut également être appliquée aux îlots pancréatiques isolés, avec une sonde claire des vaisseaux intra-îlots. Ces résultats soulignent l’efficacité du protocole d’imagerie 3D pour révéler l’organisation complexe des cellules pancréatiques et les interactions au sein du modèle des îlots.

Introduction

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La transplantation des îlots pancréatiques est souvent compliquée par une réaction inflammatoire instantanée médiée par le sang (IBMIR), qui endommage significativement les cellules endothéliales intra-îlots (CEI) avec un impact sur la perfusion et la fonction des greffons. À long terme, une masse réduite d’îlots fonctionnels et la perte d’indépendance insulinique sont décrites chez les patients, 4 ans après latransplantation 1. Bien que des modèles de greffe d’îlots chez murs ou rats aient été développés, des modèles standardisés pour étudier des cibles pharmacologiques pour le pré-conditionnement des îlots, particulièrement pertinents dans le contexte des dommages des greffons induits par les cytokines par l’IBMIR, font défaut2. En effet, une construction sphéroïde est particulièrement adaptée à l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques et à l’évaluation des molécules cytoprotectrices contre la dysfonction cellulaire induite par les cytokines. De plus, il propose une approche alternative pour limiter l’utilisation de modèles animaux de diabète de type 1 et la transplantation d’îlots.

Trouver des teintures appropriées, un dégagement optique et des conditions de montage pour les petits sphéroïdes d’une gamme d’îlots reste un défi. Dans la littérature, très peu d’études décrivent la manipulation des petits sphéroïdes et leurs caractéristiques structurelles clés. La difficulté découle également de la nécessité d’équilibrer la pénétration tissulaire, la préservation du signal et l’intégrité structurelle tout en maintenant la nature délicate de ces structures cellulaires miniatures en 3D. De plus, les méthodes de coloration conventionnelles peinent souvent à obtenir un étiquetage uniforme des sphéroïdes. Ce problème est aggravé par l’organisation cellulaire dense, qui peut freiner la diffusion des réactifs en raison de la pénétration limitée des anticorps et descolorants 3,4. Enfin, le processus de clairipage optique, crucial pour réduire la diffusion de la lumière en fond et améliorer la profondeur d’imagerie, doit être soigneusement optimisé pour éviter de perturber la structure du sphéroïde ou de modifier les propriétésbiologiques 5.

Monter de petits sphéroïdes pour la microscopie 3D présente un autre défi. Les milieux de montage traditionnels peuvent ne pas fournir un support adéquat à ces structures délicates, ce qui pourrait entraîner leur déformation ou leur effondrement lors de l’imagerie. De plus, l’appariement de l’indice de réfraction nécessaire pour une qualité d’imagerie optimale doit être contrôlé avec précision afin d’assurer une visualisation précise sur toute la profondeur dusphéroïde 6,7. Le développement de protocoles adaptés aux petits sphéroïdes est encore compliqué par la diversité des types cellulaires et des conditions expérimentales utilisées dans les culturessphéroïdes 3. Enfin, la nécessité d’approches spécialisées pour maintenir l’intégrité de plusieurs populations cellulaires tout au long des processus de coloration et de dégagement est cruciale pour l’évaluation des réponses cellulaires.

Pour relever les défis spécifiques de l’étude du stress médié par IBMIR, un modèle sphéroïde de 2000 cellules a été conçu, combinant IEC murien et cellules β sécréteurs d’insuline, avec un ratio de 1:20 de cellules IEC à β cellules similaire à celui observé dans un îlot pancréatique. De plus, des expériences antérieures ont établi que la structure maintient sa viabilité pendant 96 heures, fournissant ainsi un modèle 3D physiologiquement pertinent pour l’observation des réponses cellulaires induites par le stress (jours) ou plus courtes (heures) et leur modulation pharmacologique. Le modèle sphéroïde est constitué de cellules endothéliales intra-îlots murines MS-1, des caractéristiques de la microvascularisation des îlots et des cellules constitutives sécrétant de l’insuline β, β-TC-68. Il a été conçu pour imiter de près la plus petite plage de dimensions des îlots pancréatiques (50-200 μm de diamètre) et leur numéro moyen decellule 9.

Une nouvelle méthodologie de récolte et de coloration spécifiquement optimisée pour la manipulation de petits sphéroïdes (150-200 μm de diamètre) est rapportée, permettant une pénétration optimale des colorants fluorescents et des anticorps dans toute la structure sphéroïde tout au long de la structure sphéroïde et un fond minimal. Le protocole intègre une procédure de montage utilisant de l’agarose à faible point de fusion (LMPA) pour fournir un soutien structurel doux aux sphéroïdes délicats tout en permettant une correspondance optimale de l’indice de réfraction. La LMPA est une forme modifiée d’agarose avec une gélification réduite (environ 27 °C) et une température de fusion (environ 65 °C) qui préserve l’intégrité de l’échantillon lors de l’inclusion et crée une matrice optiquement claire avec une autofluorescenceminimale 4,6. Enfin, la méthode claire et non obstruée d’imagerie cerveau/corps et d’analyse computationnelle (CUBIC)10 est utilisée pour le nettoyage optique afin de permettre une visualisation maximale des structures internes et la préservation de l’intégrité des interactions délicates entre cellules 5,6,10.

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Protocole

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L’utilisation du tissu pancréatique humain et tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Ministère de l’Enseignement supérieur et de la Recherche du gouvernement français (Direction générale de la Recherche et de l’Innovation, Unité de Bioéthique) et enregistrés sous le numéro DC-2019-3439. Le consentement éclairé était obtenu des tuteurs légaux de tous les sujets.

1. Préparation des sphéroïdes

REMARQUE : La lignée IEC murine MS-1 et la lignée cellulaire β-pancréatique murine β-TC6 ont été cultivées simultanément afin d’obtenir une quantité cellulaire suffisante pour la culture sphéroïde. Les MS-1 ont été cultivés dans des flasques à cellules adhérentes T75 dans un milieu DMEM à haute glycémie contenant 4,5 g/L de glucose, avec 5 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine dans une atmosphère humide à 37 °C. Les passages ont été réalisés à la confluence (2 jours de culture) après décollement à l’aide de Trypsine EDTA 1x et trois lavages dans une solution Hank Balanced (HBSS). β-TC6 ont été cultivés en T75 pour des cellules adhérentes difficiles dans un milieu DMEM à glucose élevé contenant 4,5 g/L de glucose, avec 15 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptycine dans une atmosphère humide à 37 °C. Les passages ont été réalisés à la confluence β-TC6 (culture de 10 jours) après décollement par Trypsine EDTA 1x et 3 lavages dans une solution Hank Balanced (HBSS).

  1. Préparez la plaque de culture sphéroïde
  2. Lavez la plaque avec 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence fournie par le fabricant pour prévenir l’adhérence cellulaire et favoriser la formation de sphéroïdes.
  3. Centrifugez la plaque à 1 300 x g pendant 5 minutes dans un rotor à seau pivotant équipé de porte-plaques à température ambiante.
  4. Observez la plaque au microscope optique pour vous assurer qu’aucune bulle ne reste dans les micropuits. Si oui, centrifugez une seconde fois à 1 300 x g pendant 5 minutes.
  5. Jetez le rinçage anti-adhérent et lavez le puits 3 fois avec 1 mL de HBSS tiède.
  6. Écartez le HBSS et remplacez-le par 500 μL de milieu sphéroïde tiède : DMEM High Glucose contenant 4,5 g/L de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine.
  7. Maintenez la plaque à 37 °C dans une atmosphère humide tout en préparant la suspension sphéroïde.
  8. Incubez MS-1 et β-TC6 simultanément avec une solution de trypsine et comptez les cellules vivantes de chaque lignée.
    REMARQUE : Lors de l’ensemencement, les sphéroïdes se forment en utilisant le ratio de cellules 1 IEC à 20 cellules β typique des îlots pancréatiques. Utilisez une plaque de culture sphéroïde à 24 puits, chaque puits contenant 300 micropuits pouvant abriter un sphéroïde composé de 2000 cellules, pour un total de 600 000 cellules par puits. Dans la présente enquête, les mesures ont révélé des volumes sphéroïdes identiques occupés par les lignées cellulaires β-TC6 et MS1 sélectionnées après la culture sphéroïde de 48h.
  9. Mélangez les deux lignées cellulaires ensemble pour obtenir un ratio de 1 à 20 pour 24 puits, puis suspendez-les dans 24 mL de milieu sphéroïde.
    REMARQUE : Utilisez une pipette de 10 mL ou 25 mL en mouvement aspiration-flux pour homogénéiser la suspension.
  10. Pipettez 1 mL pour chaque puits et procédez en mouvement aspiration-flux pour répartir uniformément la suspension de la cellule dans le puits.
  11. Centrifugez la plaque à 130 x g pendant 5 minutes dans un rotor à seau pivotant équipé de supports pour plaques à température ambiante.
  12. Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les cellules sont réparties également entre les micropuits.
    REMARQUE : Pendant cette étape de centrifugation, utilisez des taux élevés d’accélération et de décélération (70 % à 90 % des échelles d’accélération et de décélération), sinon les amas cellulaires se déplaceront sur le côté du micropuits.
  13. Incubez la plaque à 37 °C, 5 % de CO2.
  14. Surveillez la formation et la croissance des sphéroïdes à l’aide d’un microscope optique.
    REMARQUE : Les sphéroïdes β-TC6 / MS-1 devraient commencer à se former après 24 heures de culture, atteignant une forme de sphère après 48 heures. La viabilité peut être surveillée par le bleu de trypan après une perturbation sphéroïde par la trypsine dans des échantillons dupliqués et a été maintenue pendant 96 h (80 %-90 %).

2. Récolte et coloration des sphéroïdes

  1. Suspendez doucement les sphéroïdes avec une pipette P1000 dans leur médium.
  2. Éjectez les sphéroïdes en petits volumes dans un Falcon de 15 mL et centrifugez à 130 x g pendant 5 minutes à température ambiante
  3. Aspirez doucement le milieu en évitant la pastille contenant les sphéroïdes.
  4. Lavez la pellete deux fois avec 2 mL de HBSS, doucement, pour éviter toute dissociation des sphéroïdes, puis centrifugez à 130 x g pendant 5 minutes.
  5. Sous un capot chimique, jetez le HBSS et resuspendez les sphéroïdes dans 1 mL de solution PFA à 4 % toute la nuit à 4 °C pour fixer.
  6. Centrifugez le tube à 130 x g pendant 5 minutes, jetez la solution à 4 % de PFA, puis lavez 3 fois avec 2 mL de 1x PBS (préparé dans de l’eau ultrapure de qualité laboratoire).
  7. Resuspendez avec 2,5 mL de HBSS.
  8. Distribuez la suspension sphéroïde dans une plaque à 6 puits.
  9. Sous une loupe binoculaire, sélectionnez manuellement 20 à 30 sphéroïdes avec une pipette P200 et placez-les dans un tube de 1,5 mL.
    REMARQUE : Chaque tube de 1,5 mL est une condition de coloration contenant 20 à 30 sphéroïdes. Sous 20 sphéroïdes récoltés, il devient difficile de les voir lorsqu’ils sont ensuite resuspendus.
  10. Équilibrez les volumes des tubes de 1,5 mL et centrifugez à 800 x g pendant 5 minutes.
    REMARQUE : À partir de ce moment, toutes les étapes d’aspiration de la solution sont effectuées à l’aide d’une loupe. Il est très difficile de voir les sphéroïdes sous lumière artificielle. Effectuez toujours les étapes suivantes pendant la journée, en tenant les tubes contre la lumière du jour. Toutes les solutions sont aspirées avec une pointe P1000 surmontée d’une pointe P10 à son extrémité.
  11. Retirez autant de HBSS que possible sans resuspendre les sphéroïdes.
  12. Resuspendez les sphéroïdes dans 400 μL de solution de trempe (0,5 M glycine dans 1x PBS (pH 7-7,4)) pour éviter tout bruit de fond futur causé par les aldéhydes restants de la fixation PFA. Incubez à 37 °C pendant 2 heures.
  13. Centrifugez à 800 x g pendant 5 minutes et pipettez à partir de la solution de trempe.
  14. Resuspendez dans 400 μL de tampon de pénétration (0,2 % de Triton X-100, 0,3 M glycine, 20 % de DMSO dans 1x PBS). Cela aidera à améliorer la pénétration des anticorps et des sondes nucléaires. Incubez à 37 °C pendant 2 heures.
    REMARQUE : À partir de ce stade, les sphéroïdes se posent d’eux-mêmes et ne s’accrochent plus à la paroi du tube. La centrifugation n’est plus nécessaire si les volumes sont doucement aspirés sans perturber la pastille sphéroïde. Si nécessaire, centrifugez à 800 x g pendant 5 minutes.
  15. Écartez le tampon de pénétration et incubez dans 400 μL de tampon de blocage (0,2 % Triton X-100, 1 % BSA, 10 % DMSO, 5 % sérum de chèvre dans 1x PBS) pendant la nuit à 37 °C.
  16. Écartez le tampon de blocage et incubez toute la nuit à 37 °C dans 300 μL de solution primaire d’anticorps (0,2 % Tween 20, 1 % BSA, 5 % DMSO, 5 % sérum de chèvre dans 1 PBS).
    REMARQUE : Les anticorps primaires utilisés sont : anti-CD31 (concentration finale de 2,2 μg/mL), anti-Intégrine β1 (1,43 μg/mL), anti-Insuline (0,66 μg/mL) et anti-sourisNTPDase3 11 (dilution 1:1000) ( voir Tableau des matériaux). Les IgG de contrôle des isotypes identiques respectifs doivent être validés sur la même structure afin d’assurer un marquage positif par microscopie fluorescente.
  17. Éliminez la solution primaire d’anticorps et lavez 3 fois avec 400 μL de tampon de lavage (0,2 % Tween 20, 1 % BSA dans 1x PBS). Secouez pendant 5 minutes entre les lavages.
  18. Incuber 300 μL de la solution secondaire d’anticorps (DAPI (2 μg/mL), 0,2 % Tween 20, 1 % BSA, 5 % DMSO, 5 % sérum de chèvre dans 1x PBS) pendant la nuit à 37 °C. Protégez les tubes avec du papier aluminium.
    REMARQUE : Le DAPI doit toujours être ajouté aux conditions de coloration, car cela facilite la détection des sphéroïdes lors de l’imagerie microscopique et aide à éviter le blanchiment des différents fluorophores/colorants. Tous les anticorps secondaires ont une concentration finale de 2 μg/mL (voir le tableau des matériaux).
  19. Éliminez la solution secondaire d’anticorps et lavez 3 fois avec 400 μL d’un second tampon de lavage : 0,2 % Tween 20, 1 % BSA dans 1x PBS. Gardez le dernier lavage et conservez les tubes à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient montés le jour même.

3. Préparation de la solution

  1. Préparation de la solution de dégagement optique
    REMARQUE : La solution de dégagement optique suit la procédure CUBIC10 , et a été préparée comme proposé par Gunasingh etal. 4. Les proportions des composants sont exprimées en pourcentages du poids final de la solution (p/w), car l’éthylèndiamine Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis (2-hydroxypropyl) est trop visqueuse pour être pipettée et doit être pesée.
    1. Dans une bouteille en verre, pèser 9 % (p/w) d’éthylénédiamine N,N,N,N′,N′-Tetrakis (2-hydroxypropyl) d’éthylénidiamine (2 % en mois/p) d’urée, 44 % (en p/w) de saccharose, 0,1 % (en p/p) de Triton X-100 et 24,9 % (p/w) d’eau ultrapure de qualité laboratoire.
      REMARQUE : Environ 60 g de solution sont nécessaires pour dégager une plaque à 24 puits.
    2. Ajoutez une barre magnétique adaptée au diamètre de la bouteille.
    3. Chauffez et remuez la solution à 56 °C. Gardez une bouteille en verre de contrôle remplie d’eau sur la même assiette pour surveiller la montée de température.
    4. Contrôlez la vitesse de brassage pour maintenir un vortex liquide liso, puis agitez la solution jusqu’à ce que tous les composés soient complètement dissous. La solution doit être complètement liquide et claire. Cela peut prendre jusqu’à 1 heure.
    5. À garder à température ambiante, protégé de la lumière.
      REMARQUE : La solution de dégagement doit être préparée au moins 24 heures avant le dégagement optique, afin de permettre à la solution de se dégazer et d’éliminer toute bulle qu’elle pourrait contenir. Pour éviter d’introduire des bulles, ne secoue plus jamais la solution. Ne jamais le stocker en stockage frigorifique.
  2. Préparation de la solution LMPA à 2 %
    1. Pèser 0,5 g de LMPA sur une balance de précision et placez-la dans une fiole Erlenmeyer de 100 mL.
      ATTENTION : Ne prenez pas un Erlenmeyer de plus petit volume, car il y a un risque de brûlures si le débordement.
    2. Dissous dans 25 mL de 1x PBS à température ambiante.
    3. Incorporez soigneusement la poudre dans le PBS 1x en remuant doucement la fiole Erlenmeyer.
      ATTENTION : Pour l’étape suivante, il est essentiel d’utiliser un équipement de protection : des gants et un masque pour les yeux et le visage, afin de se protéger contre les éclaboussures et les brûlures.
    4. Chauffez la fiole Erlenmeyer au micro-ondes.
    5. Observez quand la solution commence à bouillir (présence de bulles dans le liquide), et retirez immédiatement avant qu’elle ne déborde.
    6. Remuez doucement l’Erlenmeyer pour incorporer la poudre.
      ATTENTION : Ne remuez pas trop fort, car le liquide pourrait déborder, excouvrir et éclaboussurer.
    7. Remis l’Erlenmeyer au micro-ondes, répète jusqu’à ce que la LMPA soit complètement dissoute.
    8. Retirez l’Erlenmeyer et, avant que la LMPA ne se solidifie, apliquez rapidement 1 mL de solution LMPA à 2 % dans des tubes de 1,5 mL. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Le processus prend du temps. Préparez la solution à l’avance et stockez-la pour une utilisation ultérieure.

4. Montage et dégagement optique

  1. Préchauffez la centrifugeuse à plaque à 40 °C, en effectuant un long cycle pour préparer la plaque d’échantillon.
    REMARQUE : LMPA gélise à 30 °C. Ne faites pas tourner la centrifugeuse en dessous de 40 °C. Si la centrifugeuse le permet, augmentez à 50 °C.
  2. Liquéfier des aliquotes de LMPA à 2 % dans un bain-marie ou un chauffe-tubes à 70 °C pendant 5 à 10 minutes.
  3. Baisser et maintenir la température du LMPA à 2 % à 55 °C.
  4. Placez doucement la plaque d’imagerie sur le chauffe-plaque préchauffé à 50 °C.
    REMARQUE : Faites attention à ne pas casser ou rayer le polymère fragile utilisé comme base pour les puits.
  5. Faites attention à ce que la plaque soit chaude avant d’ajouter le LMPA à 2 %. À ce stade, ça ne doit pas s’assembler.
  6. Pipeter 200 μL de LMPA à 2 % dans chaque puits. Couvrez tout le bas du support pour obtenir une première base liquide, ce qui permet une distribution plus fluide des sphéroïdes.
  7. Éliminez le tampon de lavage des tubes, resuspendez les sphéroïdes à 300 μL de LMPA à 2 %, et pipettez-les directement dans leur puits. Effectuez toujours une resuspension douce pour éviter les bulles.
  8. Couvrez la plaque de papier aluminium pour protéger les fluorophores.
  9. Pèse rapidement la plaque sans papier aluminium et remets-la dans le chauffe-plaques.
  10. Préparez une plaque à 24 puits, en ajoutant de l’eau pour l’équilibre.
  11. Retirez rapidement la plaque avec le papier aluminium du chauffe-plaques pour protéger les fluorophores couplés aux anticorps secondaires. Gardez en main, ne le placez pas sur une surface froide.
  12. Retirez le papier aluminium et placez-le dans la centrifugeuse à plaques.
  13. Centrifugez à 1000 x g pendant 15 minutes à 40 °C. Vérifie la température du rotor, qui devrait être à température ambiante.
  14. Lors de la centrifugation, préparez un bac à glace : aplatissez la glace afin que la plaque puisse être placée sur une surface plane.
  15. Retirez l’assiette et posez-la sur la glace, en recouvrant le plateau ou l’assiette de papier aluminium. Laissez l’assiette sur la glace pendant 10 minutes.
  16. Retirez la plaque de la glace et laissez-la dans l’aluminium pour qu’elle stabilise à température ambiante pendant 20 minutes.
  17. Pipettez de 1 à 1,5 mL de la solution de dégagement par puits, couvrez de papier aluminium, et laissez faire passer à température ambiante, protégée de la lumière, pendant au moins 48 heures.
    REMARQUE : Ne jamais stocker la plaque à 4 °C. Le LMPA peut se contracter, se détacher du fond du puits et flotter dans la solution de dégagement. Image dans la semaine suivant le déblaiement.

5. Imagerie

  1. Utilisez un microscope à disque tournant confocal, choisissez (au minimum) l’objectif 30x.
  2. Conservez les solutions de clearing, car elles servent à homogénéiser les indices de réfraction et à faciliter l’imagerie 3D.
  3. Trouvez les sphéroïdes en sélectionnant le canal DAPI pour éviter de blanchir les autres fluorophores.
  4. Acquérir des images en utilisant la fonction Z-stack. Sélectionnez le haut et le bas du sphéroïde et espacez les tranches optiques de 10 μm.
    REMARQUE : L’acquisition et l’analyse d’images ont été réalisées sur la plateforme d’imagerie du CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour évaluer l’efficacité du marquage et de l’élimination optique, plusieurs modèles ont été soumis au même protocole puis fixés (Figure 1). Des sphéroïdes avec des rapports de 1 IEC pour 20 cellules de β et de 1 IEC pour 50 cellules de β ont été cultivés selon la méthode décrite ci-dessus. À noter, le ratio de 1 IEC pour 20 cellules de β s’apparente à celui d’un îlot pancréatique humain. L’utilisation du bleu de trypan pour colorer les sphéroïdes perturbés ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un modèle sphéroïde incorporant la CEI murine MS-1 et les cellules β murines β-TC6 a été développé en imitant la structure tridimensionnelle des îlots pancréatiques. Ce modèle convient à l’analyse du dysfonctionnement IEC induit par le stress sur 72 heures et de son impact sur la viabilité et la fonction des cellules β, avec une pertinence pour la recherche sur la transplantation d’îlots. Il est important de noter que le sphéroïde constitué de cellules murines était homogène par nature e...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs doivent beaucoup à Pascal Kessler, de la plateforme d’imagerie PICSTRA, pour son assistance experte lors de la microscopie à disque tournant et de l’extraction des données brutes d’étiquetage de la pile Z. Les auteurs souhaitent saluer le généreux cadeau des îlots humains purifiés par le Dr W. Bietiger, le Dr A. Langlois et le Dr K. Bouzakri du Centre européen d’étude du diabète (CEED, Strasbourg, France)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
µ-plaque 24 puits Noir ID 14 mm  ;IBIDI82426
AggreWell 800 (24 puits)StemCell34815
Solution de rinçage anti-adhérence & nbsp ;StemCell7010
Anticorps anti-CD31 [P2B1]Abcamab24590Concentration finale 2,2 & micro ; g/mL
Anti-Intégrine & bêta ; 1 Anticorps, clone MB1.2MerckMAB1997  ;Concentration finale 1,43 & micro ; g/mL
Flasque de culture cellulaire, T-75, surface, surface  ;: Cellul+, filtre capuchonSarstedt83.3911.302&beta ;-TC6 culture
Flasque de culture cellulaire, T-75, surface : standard, bouchon à vis à 2 positionsSarstedt83.3911.02Culture MS-1
Dihydrochlorure DAPIThermofisher,D1306Concentration finale 2 & micro ; g/mL
Diméthyl Sulfoxyde   ;SigmaD8418-250ML
DMEM, glycémie élevée, GlutaMAX et commerce ; Supplément, pyruvateThermofischer scientifique31966047
Dulaglutide
DulaglutideLillyStylo Trulicity 1,5 mg
Sérum fœtal bovinBiowestS1810-500
GlycineSigmaG7126-1KG
Anti-cochon d’Inde IgG (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor & trade ; 555ThermofischerA21435Concentration finale 2 & micro ; g/mL
Anticorps secondaire anti-souris (H+L) anti-souris hautement adsorbé par la chèvre, Alexa Fluor & trade ; 488Thermofischer  ; A-11029Concentration finale 2 & micro ; g/mL
Anti-IgG anti-lapin (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor & trade ; 633ThermofischerA-21071Concentration finale 2 & micro ; g/mL
Anticorps secondaire anti-Rat IgG (H+L) croisé adsorbé par chèvre, Alexa Fluor & trade ; 555ThermofischerA21434Concentration finale 2 & micro ; g/mL
Sérum de chèvreSigmaS26-100ML
HBSS sans calcium ni magnésium & nbsp ; & Phénol rougeCorning21-022-CV
Insuline (C27C9) Cancer du lapinSignalisation cellulaire3014SConcentration finale 0,66 & micro ; g/mL
Îlot pancréatique humain isolé   ;Centre Europé ; en d’Étude du Diabète (CeeD)Cadeau gentil du Dr Karim Bouzakri. Grade clinique, isolé selon les directives.
Agarose à basse température de gélification.MerckA9414-10G
Cellules MS-1ATCCCRL-2279
Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans PBS 1xFischer scientifique15670799
PBS 10xEuromedexET330-ADilué 1x dans de l’eau ultrapure de qualité laboratoire
Pénicilline-StreptomycinePAN BiotechP06-07100
Anticorps anti-NTPDase3 polyclonal de cochon d’Inde de souris   ;mN3-1CI4 ; mN3-2C (I4,I5) ; mN3-3C(I4,I5)  ;https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpDilution 1:1000
Quadrol/N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tetrakis(2-hydroxypropyl) éthylènidiamine  ;Sigma122262-1L
Olympus IXplore à disque tournant & nbsp ;Solutions Scientifiques Olympus
Saccharose pour la biologie moléculaireSigmaS0389-1KG  ;
Triton X-100 Qualité de laboratoire de bioqualitéEuromedex2000-A
Trypsine/EDTA (10 fois)PAN BiotechP10-025100
Préadolescent-20Euromedex//
UréeSigmaU-5128
&bêta ;-cellules TC6ATCCCRL-11506

Références

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Mod le de sph ro des d lotsInteraction avec les cellules endoth lialesInteraction avec les cellules b taImagerie 3Dlots pancr atiquesCriblage cytoprotecteurCulture de sph ro desClarification CUBICCellules s cr tant l insulineAgarose bas point de fusion

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