Identification d’espèces de mycobactéries par la méthode d’une puce à ADN

Résumé

Ici, nous présentons une méthode de puce à ADN pour identifier les espèces de Mycobacterium , ce qui améliorera la précision du diagnostic et l’efficacité des maladies associées à des fins cliniques.

Résumé

Cette étude présente une méthode de puce à ADN conçue pour l’identification précise des espèces de Mycobacterium . En s’appuyant sur les principes de l’amplification et de l’hybridation de la PCR asymétrique, cette méthode cible 17 mycobactéries courantes, y compris celles du complexe Mycobacterium tuberculosis et diverses mycobactéries non tuberculeuses. Il est applicable à un large éventail d’échantillons cliniques tels que les expectorations, le pus, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide céphalo-rachidien et le liquide de ponction de patients suspectés de maladies mycobactériennes. Le test consiste à amplifier les séquences cibles du génome de Mycobacterium par PCR asymétrique, suivie d’une hybridation avec les sondes de la puce de la puce à puce. La disposition unique de la sonde (répétée 5x dans une puce à 12 rangées x 10 colonnes) et l’utilisation de sondes de contrôle améliorent sa fiabilité. Les essais cliniques portant sur 1 724 échantillons ont démontré des performances élevées. La méthode a atteint une spécificité clinique, une sensibilité et une concordance globale de 100 % par rapport aux résultats de séquençage, à l’exception de deux rares échantillons mycobactériens non tuberculeux au-delà de son champ de détection. Cette méthode de puce à ADN offre une amélioration significative par rapport aux techniques de diagnostic traditionnelles, raccourcissant le temps de diagnostic et fournissant une détection plus complète, ayant ainsi un grand potentiel dans le diagnostic et la gestion des maladies mycobactériennes.

Introduction

Mycobacterium, un genre de bactéries, englobe un groupe diversifié d’organismes ayant des implications importantes pour la santé humaine et animale. Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose (TB), est un fléau de longue date pour la santé mondiale. Malgré des décennies d’efforts en matière de prévention et de traitement, la tuberculose reste une menace majeure pour la santé publique, responsable d’un nombre stupéfiant de décès annuels et de nouvelles infections dans le monde ^1,2. Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) sont également de plus en plus reconnues comme des agents pathogènes importants, en particulier dans des populations de patients et des environnements spécifiques.

L’identification précise des espèces de Mycobacterium est la pierre angulaire d’une gestion efficace de la maladie ^3,4. Les méthodes de diagnostic traditionnelles ont des limites inhérentes. Les techniques basées sur la culture, qui ont toujours été utilisées, sont notoirement chronophages. Le processus d’isolement et de culture des mycobactéries peut prendre des semaines ou des mois, au cours desquels les patients peuvent constater une progression de la maladie et une transmission potentielle à d’autres. De plus, certaines espèces mycobactériennes sont extrêmement difficiles à cultiver, ce qui entraîne des résultats faussement négatifs et un traitement retardé ou incorrect ^5,6.

La coloration acido-résistante, une autre méthode couramment utilisée, peut identifier les mycobactéries en fonction de leurs propriétés uniques de paroi cellulaire qui résistent à la décoloration. Cependant, il n’a pas la spécificité nécessaire pour distinguer les différentes espèces de Mycobacterium , ne fournissant qu’une indication générale de la présence mycobactérienne⁷. Des méthodes moléculaires telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont apparues comme des alternatives pour surmonter certains de ces inconvénients. La PCR peut détecter l’ADN mycobactérien plus rapidement que les méthodes de culture, ce qui permet un diagnostic plus rapide. Cependant, les tests PCR conventionnels ciblent généralement un nombre limité de gènes et peuvent ne pas offrir une identification complète des espèces, en particulier lorsqu’il s’agit d’espèces de Mycobacterium ⁵ étroitement apparentées.

La technologie des microréseaux d’ADN a révolutionné les domaines de la microbiologie et du diagnostic. Il offre la possibilité d’analyser simultanément plusieurs cibles génétiques, offrant une vue plus complète et détaillée de la population microbienne ^8,9. Des recherches récentes dans ce domaine ont mis en lumière le potentiel et l’importance des techniques moléculaires avancées pour l’identification des mycobactéries. Par exemple, une étude de Wang et ^al.10 a démontré la sensibilité et la spécificité accrues d’une puce à ADN modifiée pour détecter des espèces rares de Mycobacterium dans un cadre clinique. Leurs résultats ont souligné la valeur de l’optimisation continue de la technologie des microréseaux. Une autre étude menée par Wang et ses collègues^s’estconcentrée sur l’intégration des données des puces à ADN avec les résultats cliniques chez les patients atteints de tuberculose. Les résultats ont donné un aperçu de la valeur pronostique d’une identification précise des espèces de Mycobacterium et du potentiel de la médecine personnalisée.

Principe de test
Ce kit utilise la technologie des puces à ADN, combinée à l’amplification et à l’hybridation de la réaction en chaîne par polymérase asymétrique (PCR), pour l’identification des espèces de Mycobacterium . Le kit comprend une puce d’identification des espèces de Mycobacterium et des réactifs d’amplification PCR asymétriques. La puce est fixée avec des sondes spécifiques à l’espèce pour la détection et l’identification des espèces de Mycobacterium . Les cibles de détection comprennent 17 espèces ou groupes cliniquement communs, tels que le complexe Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae et Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum et Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai et Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi et Mycobacterium smegmatis.

La détection de ces 17 espèces de Mycobacterium est essentielle pour un diagnostic clinique précis et une prise en charge personnalisée des patients. Le complexe Mycobacterium tuberculosis (CMTB) est prioritaire en raison de son rôle dans la tuberculose, nécessitant un isolement immédiat et une multithérapie pour freiner la transmission et lutter contre la résistance aux médicaments. Les espèces du complexe Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), telles que M. avium et M. intracellulare, affectent principalement les personnes immunodéprimées (p. ex., VIH/sida) ou celles atteintes d’une maladie pulmonaire chronique, nécessitant des régimes prolongés à base de macrolides. Les mycobactéries à croissance rapide (RGM) comme M. abscessus et M. fortuitum sont connues pour leur résistance aux antibiotiques et provoquent souvent de graves infections de la peau, des tissus mous ou des poumons, nécessitant des combinaisons agressives de chirurgie et d’antibiotiques ciblés (par exemple, amikacine, macrolides). Les espèces environnementales telles que M. gordonae ou M. smegmatis sont des contaminants fréquents, mais peuvent provoquer des infections opportunistes dans des contextes spécifiques, nécessitant une corrélation clinique minutieuse pour éviter un traitement inutile. Les agents pathogènes comme M. marinum (associé à l’exposition aquatique) et M. ulcerans (causant l’ulcère de Buruli) ont des niches épidémiologiques distinctes, guidant l’évaluation des antécédents d’exposition. Des espèces rares, mais cliniquement pertinentes (p. ex. M. szulgai, M. malmoense) imitent la tuberculose et nécessitent des schémas thérapeutiques spécifiques à l’espèce. Une identification précise est primordiale, car la durée du traitement, le choix des médicaments (par exemple, la sensibilité à la rifampicine chez M. kansasii par rapport à la résistance intrinsèque dans les MNT) et le pronostic varient considérablement. Le diagnostic moléculaire et les tests de sensibilité aux antimicrobiens sont essentiels pour optimiser les résultats, en particulier dans les populations immunodéprimées ou les infections complexes.

Tout d’abord, les séquences cibles du génome de Mycobacterium sont amplifiées par PCR asymétrique. Ensuite, les produits amplifiés sont hybridés avec les sondes sur la puce. Si la mycobactérie cible est présente dans l’échantillon, les produits amplifiés se lieront spécifiquement aux sondes correspondantes sur la puce. Enfin, en scannant les signaux d’hybridation sur la puce, l’espèce de Mycobacterium dans l’échantillon peut être déterminée.

À l’aide de la technologie de micro-array de puce génétique, des sondes spécifiques pour la détection des gènes susmentionnés et diverses sondes de contrôle sont fixées sur le substrat. Chaque sonde de détection et sonde de contrôle est répétée 5 fois, formant une micropuce de 12 rangées x 10 colonnes. La disposition des sondes est illustrée à la figure 1. Chaque puce contient quatre microréseaux identiques, et chaque microréseau peut détecter un échantillon.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital de Quanzhou affilié à l’Université médicale du Fujian (approbation n° 2024-K035). Le consentement éclairé de tous les patients a été obtenu avant le prélèvement des échantillons cliniques. Les patients ont été informés de l’objectif de l’étude, des procédures à suivre et de leur droit de se retirer à tout moment sans affecter leurs soins médicaux.

1. Exigences en matière d’échantillons

REMARQUE : Lorsque vous prélevez des échantillons de patients atteints de tuberculose et de mycobactéries non tuberculeuses (MNT) cliniquement suspectées pour des tests avec ce kit, suivez ces étapes :

1. Prélevez des échantillons tels que des expectorations, du pus ou des sécrétions, du liquide de lavage broncho-alvéolaire, du liquide de ponction (y compris le liquide céphalo-rachidien, le liquide pleural et péritonéal, le liquide péricardique, le liquide articulaire et la bile) et l’urine des patients.
   1. Pour les échantillons d’expectorations :
      1. Demandez au patient de se rincer la bouche à l’eau claire le matin, puis de tousser des expectorations profondes dans un récipient de stockage d’échantillons stériles, de le sceller et de l’envoyer pour analyse.
      2. Ajoutez 1 à 2 fois le volume de 4 % de NaOH, secouez et mélangez uniformément.
      3. Après 15 à 20 minutes, ajoutez un volume égal de tampon phosphate pH 6,8 et mélangez uniformément.
      4. À température ambiante, centrifuger à 2 000 × g pendant 15 min et jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de NaCl à 0,9 % à l’aide d’une pipette et bien mélanger ; à utiliser pour la détection.
   2. Pour les échantillons de pus ou de sécrétion :
      1. Rincez la surface avec une solution saline normale stérile. Prélevez le pus ou la sécrétion à l’aide d’un écouvillon stérile, scellez-le et envoyez-le pour analyse.
      2. Ajoutez 3 fois le volume de 4 % de NaOH et secouez-le soigneusement pour bien mélanger.
      3. Laissez-le reposer à température ambiante pendant 20 min (secouez-le manuellement 2 fois pendant cette période), centrifugez-le à 2 000 × g à température ambiante pendant 15 min, puis jetez le surnageant. Ajouter 1 mL de NaCl 0,9 % à l’aide d’une pipette et mélanger uniformément ; à utiliser pour la détection.
   3. Pour le liquide de lavage broncho-alvéolaire :
      1. Injecter 10 à 20 ml de solution saline normale à travers une sonde de lavage broncho-alvéolaire protégée (PBAL).
      2. Prélever l’échantillon dans une bouteille stérile par aspiration à pression négative et l’envoyer pour analyse.
   4. Pour le liquide céphalo-rachidien :
      1. Prélever au moins 2 mL d’échantillon en utilisant la technique aseptique.
      2. Centrifuger à 2 000 × g pendant 15 min à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajouter 1 mL de solution de chlorure de sodium à 0,9 % à l’aide d’une pipette, bien mélanger et utiliser pour l’analyse.
   5. Pour les échantillons d’urine :
      REMARQUE : Il est conseillé d’utiliser la première quantité complète d’urine le matin ou l’urine du milieu et de la fin de la nuit. L’urine peut également être recueillie par cathétérisme.
      1. Prélever l’échantillon dans un récipient stérile et laisser reposer l’échantillon d’urine prélevé pendant 4 à 5 h.
      2. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 15 min à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajouter 1 mL de solution de chlorure de sodium à 0,9 % à l’aide d’une pipette, bien mélanger et utiliser pour l’analyse.
2. Stockage des échantillons
   REMARQUE : Les échantillons sur support solide ne doivent pas être conservés congelés, car la congélation peut affecter les opérations ultérieures.
   1. Conserver les échantillons existants dans le milieu liquide à -70 °C pendant 5 ans au maximum.
   2. Conservez tous les échantillons à une température de 2 à 8 °C pendant 2 mois au maximum.
3. Transport d’échantillons
   1. Lorsque vous transportez les échantillons d’isolats d’essai, assurez-vous d’utiliser un contenant fermé qui répond aux exigences de biosécurité dans les conditions permises par la réglementation.

2. Préparation de l’expérience

1. Préparation des solutions de lavage des copeaux
   REMARQUE : Préparez la solution de lavage des copeaux I et la solution de lavage des copeaux II en fonction du nombre de copeaux. Le volume doit être tel que les copeaux puissent être complètement immergés pendant le lavage. Mélangez-les uniformément et équilibrez-les à température ambiante (10-30 °C). La concentration finale de SSC est de 2x et la concentration finale de SDS est de 0,2 %.
   1. Pour préparer la solution de lavage des copeaux I, mélangez 20 fois la SSC, l’eau distillée (ou l’eau purifiée) et 10 % de SDS dans le rapport de 10:88:2 dans l’ordre pour préparer la solution de lavage des copeaux I. Par exemple, lorsque vous préparez un volume total de 600 ml, mesurez d’abord 60 ml de 20x SSC et 528 ml d’eau distillée (ou d’eau purifiée) et placez-les dans un bécher de 1 L et mélangez uniformément avec une tige d’agitation. Ajouter ensuite 12 ml de SDS 10 % et mélanger à nouveau uniformément.
   2. Pour préparer la solution de lavage de copeaux II : La concentration finale de SSC est de 0,2x. Mélangez 20x SSC et de l’eau distillée (ou de l’eau purifiée) dans un rapport de 1:99 pour obtenir la solution de lavage des copeaux II. En prenant l’exemple de la préparation d’un volume total de 600 ml, mesurez 6 ml de 20x SSC et 594 ml d’eau distillée (ou d’eau purifiée) et placez-les dans un bécher de 1 L et mélangez uniformément.
      REMARQUE : Si la solution SDS à 10 % développe des précipités floculants blancs, chauffez-la à 50 °C, mélangez soigneusement, puis préparez le tampon de lavage de la puce à microréseaux. Si le tampon de lavage I développe des précipités floculants blancs, chauffez-le à 50°C, mélangez soigneusement, équilibrez à température ambiante avant utilisation.
2. Préparez 350 ml du mélange d’eau glacée.
3. Préparez de l’eau distillée (ou de l’eau purifiée).

3. Préparation des instruments et du matériel

1. Sélection et configuration de l’instrument
   1. Identifiez et préparez le scanner de puces de microarray, en vous assurant qu’il est calibré et prêt à l’emploi.
   2. Installez l’instrument d’extraction d’acide nucléique, vérifiez ses fonctions et chargez les réactifs nécessaires.
   3. Placez la boîte d’hybridation de puce de gène de puce à ADN à l’endroit approprié et confirmez son bon état de fonctionnement.
2. Préparation des outils de pipetage
   1. Prélevez des micropipettes dont les spécifications sont de 0,1 à 10 μL, de 2 à 20 μL et de 20 à 200 μL, ainsi que leurs pointes de pipette propres et stériles correspondantes. Assurez-vous que les micropipettes sont calibrées avec précision et que les pointes sont correctement ajustées.
3. Disposition de l’équipement auxiliaire
   1. Préparez un bain-marie à température constante et réglez-le à la température requise (50 °C).
   2. Positionnez la microcentrifugeuse capable de centrifuger des tubes de 1,5 mL et vérifiez ses réglages d’équilibre et de vitesse.
   3. Organisez des tubes à centrifuger propres et stériles (200 μL et 1,5 ml) et des bandelettes à huit puits propres et stériles en option (200 μL) sur les supports des tubes à centrifuger.
4. Préparation de l’équipement de manutention d’échantillons
   1. Placez un agitateur à température constante dans un endroit pratique et réglez les paramètres d’agitation appropriés.
   2. Réservez deux récipients pour laver les copeaux et assurez-vous qu’ils sont propres et secs.
   3. Disposez des supports à glissières et une centrifugeuse, et ayez à portée de main un récipient pour la centrifugation et le séchage des copeaux.
5. Préparation de l’amplificateur PCR
   1. Allumez l’amplificateur PCR et programmez-le selon le protocole expérimental, en vous assurant qu’il est prêt à effectuer des réactions d’amplification.

4. Extraction des acides nucléiques

REMARQUE : Effectuez l’opération dans la zone de préparation de l’échantillon et suivez ces étapes :

1. Préparation
   1. Ajouter 80 μL de solution d’extraction d’acide nucléique dans le tube d’extraction d’acide nucléique et ajouter 1 mL de NaCl à 0,9 %.
2. Prélèvement d’échantillons d’isolat
   1. Pour commencer le prélèvement d’échantillons, examinez la source des échantillons, qu’ils proviennent d’un milieu solide ou d’un milieu liquide.
   2. Pour prélever des échantillons de milieu solide, utilisez une boucle d’inoculation stérile pour prélever une colonie visible dans le milieu solide approprié. Si les bactéries se sont développées pour couvrir tout le milieu, choisissez une quantité correspondante de pelouse bactérienne. Placez-le soigneusement dans le tube d’extraction d’acide nucléique contenant la solution d’extraction d’acide nucléique, en prenant soin d’éviter autant que possible de prélever le milieu solide.
   3. Pour les échantillons en milieu liquide, aspirer 10 à 20 μL de la suspension bactérienne dont la turbidité est égale ou supérieure à 1 étalon McFarland. Injectez-le dans le tube d’extraction d’acide nucléique contenant la solution d’extraction d’acide nucléique.
      REMARQUE : Après le prélèvement des échantillons, qu’ils soient solides ou liquides, les échantillons sont prêts pour l’opération d’extraction ultérieure des acides nucléiques.
3. Extraction d’acides nucléiques
   1. Après avoir ajouté les échantillons prétraités ou les échantillons d’isolat de l’étape 1.1 mentionnée ci-dessus, utilisez l’instrument d’extraction rapide des acides nucléiques pour extraire les acides nucléiques. Placez les acides nucléiques extraits à -20 °C pour un stockage temporaire.
      REMARQUE : Comme indicateur de l’efficacité de l’extraction, l’extracteur automatique peut extraire des échantillons avec une charge en acide nucléique viral supérieure à 100 copies/ml. La durée de conservation temporaire ne doit pas excéder 2 mois.

5. Amplification par PCR

1. Préparation du système de réaction PCR
   1. Dans la zone de stockage et de préparation des réactifs, préparez des tubes à centrifuger de 200 μL ou des bandelettes à huit puits en fonction du nombre d’échantillons à tester, et marquez les numéros d’échantillons à l’avance. Sortez les réactifs d’amplification PCR du kit, laissez-les décongeler et fondre naturellement, secouez doucement et mélangez uniformément, puis centrifugez rapidement pour que les réactifs se rassemblent au fond des tubes.
   2. En fonction du nombre d’échantillons, aliquote les réactifs d’amplification de la PCR dans des tubes à centrifuger de 200 μL ou des bandelettes à huit puits à un volume de 18 μL par tube. Fermez hermétiquement les capuchons des tubes, puis transférez-les dans la zone de préparation du mélange de réaction d’amplification et d’amplification.
   3. Ajouter 2 μL d’ADN matrice (l’ADN de l’échantillon à analyser (c.-à-d. le surnageant dans le tube d’extraction d’acide nucléique), les produits de contrôle positif ou les produits de contrôle négatif) dans la zone de préparation de l’échantillon. Assurez-vous que le volume total de chaque système de réaction PCR atteint 20 μL.
      REMARQUE : Utilisez des produits de contrôle positif et des produits de contrôle négatif à chaque fois pendant l’amplification. Le produit de contrôle positif peut être utilisé pour le contrôle de la qualité dans les processus d’amplification et d’hybridation de la PCR, et le produit de contrôle négatif peut être utilisé pour surveiller l’environnement et le processus de fonctionnement.
2. Amplification
   1. Placez les tubes à centrifuger ou les bandelettes à huit puits contenant les réactifs dans l’instrument d’amplification PCR. Assurez-vous que l’instrument est préchauffé à la température requise. Effectuer la réaction d’amplification de la PCR selon le programme de cycle thermique suivant : dénaturation initiale à 94 °C pendant 600 s (1 cycle) ; 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, de recuit à 60 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 40 s ; une extension finale à 72°C pendant 420 s (1 cycle) ; maintenir à 4 °C indéfiniment (1 cycle).

6. Hybridation des puces

REMARQUE : Avant la fin de la réaction d’amplification de la PCR, effectuez les opérations suivantes :

1. Réglez la température du bain-marie à température constante sur 50 °C et préchauffez-le.
2. Préparation des chips
   1. Ajouter 200 μL d’eau distillée (ou d’eau purifiée, comme le montre la figure 2A) au bas de la boîte d’hybridation de la puce de la puce à gènes. Placez le support entre les deux colonnes de positionnement à l’intérieur de la boîte.
   2. Placez soigneusement la puce avec la face avant vers le haut sur le support et recouvrez la puce avec la lamelle de recouvrement avec ses quatre bossages vers le bas (comme illustré à la Figure 2B).
      REMARQUE : Assurez-vous que le sens de placement correct de la lamelle de recouvrement est de sorte que son extrémité s’aligne avec l’étiquette à l’extrémité de la puce.
3. Préparation, dénaturation et refroidissement d’un mélange de réaction d’hybridation
   1. Préparez des tubes à centrifuger de 200 μL ou des bandelettes à huit puits en fonction du nombre d’échantillons et étiquetez-les correctement.
   2. Sortez le tampon d’hybridation du kit et chauffez-le à 50 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Après un mélange minutieux, centrifugez-le rapidement dans une microcentrifugeuse. Aliquote 9 μL du tampon d’hybridation dans chaque tube à centrifuger préparé de 200 μL ou bande à huit puits. Ensuite, ajoutez 6 μL du produit PCR correspondant dans chaque tube, ce qui donne un volume total de 15 μL par mélange de réaction d’hybridation.
   3. Chauffer le mélange de réaction d’hybridation (y compris le tampon d’hybridation et le produit de PCR) à 95 °C (dans un instrument de PCR ou un bain-marie) et le dénaturer pendant 5 min. Sortez le mélange de réaction d’hybridation qui a subi le traitement de dénaturation à l’étape précédente, et plongez-le immédiatement dans un mélange d’eau glacée pendant 3 min.
4. Réaction d’hybridation
   1. Sortez le mélange de réaction d’hybridation du bain de glace, pipetez-le de haut en bas 2 fois avec une micropipette pour le mélanger uniformément. Une fois que le précipité floculant blanc (le cas échéant) a disparu, ajouter 13,5 μL du mélange de réaction d’hybridation par le trou de chargement de la lamelle (comme illustré à la figure 2C), couvrir rapidement la boîte d’hybridation et la sceller (comme illustré à la figure 2D). Notez le numéro de la puce, la position de la puce et le numéro d’échantillon correspondant.
      REMARQUE : Un seul échantillon peut être ajouté à chaque microarray.
   2. Placez immédiatement les boîtes d’hybridation scellées horizontalement dans le bain-marie à température constante qui a été préchauffé à 50 °C. Démarrez le chronomètre pendant 120 minutes après que tous les boitiers d’hybridation aient été installés.
      REMARQUE : Évitez d’introduire des bulles d’air pendant le processus de chargement. Dans toutes les étapes, du début du chargement jusqu’au séchage des copeaux, évitez que le liquide sur les microréseaux de puces ne soit exposé directement à l’air pendant une longue période afin d’éviter que le fond de puce ne devienne trop élevé en raison du séchage et n’interfère avec l’interprétation du résultat.
5. Lavage et séchage des copeaux
   1. Une fois la réaction d’hybridation terminée, sortez les boîtes d’hybridation horizontalement, démontez-les et sortez les copeaux pour le lavage. Placez immédiatement les copeaux sur la grille coulissante dans le récipient (tel qu’un bécher) rempli de solution de lavage de copeaux I qui a été équilibrée à température ambiante (10-30 °C). Lavez-les à une vitesse de 80-100 tr/min sur un agitateur à température constante pendant 3 min à température ambiante.
   2. Lavez les copeaux avec la solution de lavage de copeaux II équilibrés à température ambiante à une vitesse de 80 à 100 tr/min sur un agitateur à température constante pendant 3 min à température ambiante.
   3. Placez les copeaux dans une centrifugeuse et centrifugez à 100 × g à température ambiante pendant 5 minutes. Scannez-les après séchage.
      REMARQUE : Ne laissez pas les copeaux entrer en collision ou se frotter les uns contre les autres.

7. Balayage des puces et interprétation des résultats

REMARQUE : Utilisez le scanner de puces de microarray et le logiciel correspondant pour lire les signaux et interpréter les résultats. Consultez également le Tableau 1 pour connaître les résultats anormaux et le dépannage. Suivez ces étapes pour l’utiliser (reportez-vous aux manuels d’utilisation du scanner et du logiciel).

1. Allumez le scanner et le logiciel correspondant, puis cliquez sur le bouton de contrôle laser pour le laisser préchauffer pendant 10 min.
2. Entrez divers types d’informations relatives aux échantillons, tels que le numéro d’échantillon.
3. Une fois le préchauffage du scanner terminé, cliquez sur le bouton Éjecter et placez la puce fermement sur le petit morceau de support. Poussez doucement et horizontalement la puce dans l’ouverture du compartiment du scanner et cliquez sur le bouton Charger .
4. Entrez le numéro de la puce, sélectionnez la zone de détection (microarray 1-4), puis cliquez sur Sélectionner un échantillon pour choisir les échantillons correspondants pour chaque microarray. Ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer la détection pour effectuer l’analyse des puces. Les résultats de l’analyse s’afficheront à l’écran et seront automatiquement enregistrés.
5. Après avoir analysé une puce, répétez les étapes 7.3 et 7.4 pour analyser la puce suivante. Suivez cette procédure jusqu’à ce que toutes les puces aient été analysées.
6. Utilisez la page Requête de données pour effectuer des opérations de recherche de données et d’impression.
7. Après avoir terminé toutes les opérations, éteignez d’abord le laser, puis quittez le logiciel et enfin éteignez le scanner.

Résultats

Des résultats positifs
Pour les sondes du genre Mycobacterium (contrôle interne, CI) et de Mycobacterium tuberculosis, leurs valeurs de résultat positives sont déterminées par la méthode ROC (Receiver Operating Characteristic). Pour les sondes utilisées pour détecter les 16 autres MNT, leurs valeurs de résultat positives sont déterminées par la méthode du percentile.

Contrôle qualité expérimental
Le résultat de détection du produit témo...

Discussion

La méthode de la puce à ADN présentée dans cet article permet de détecter directement les acides nucléiques dans les échantillons cliniques (y compris les expectorations, le pus, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide céphalo-rachidien et le liquide de ponction) chez les patients suspectés d’avoir la tuberculose et la mycobactériose non tuberculeuse et peut raccourcir considérablement le temps nécessaire pour confirmer le diagnostic. La méthode de la puce à ADN présentée dan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium injectable à 0,9 % (NaCl)	FuZhou HAIWANGFUYAO	H35020289
Appareils d’amplification d’Applied Biosystems	Thermo Fisher Scientific	Thermocycleur Veriti à 96 puits
CapitalBio LuxScan10K/B	CapitalBio	LuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24  ;	CapitalBio	SlideWasher 24  ;
; Centrifugeuse  ;	Eppendorf	5424R	MaX.speed 15000 min-1
Tampon d’hybridation
Puce et couvercle de la puce à gènes HybSet
Kit d’identification des espèces de Mycobacterium	CapitalBio	301030
Contrôles négatifs, contrôles positifs
Extracteur d’acide nucléique	TIANLONG	GeneRotex 96
Réactif d’amplification PCR
Tampon phosphate pH 6,8	ShangHai yuanye Bio-Technology	Référence R20029-10
Pipettes et pointes	Thermo Scientific	0,1 à 10 &mu ; L, 2 - 20 &mu ; L, et 20 - 200 &mu ; L, 100-1000 &mu ; L
qEx-DNA/RNA Kit d’extraction ou de purification d’acides nucléiques	TIANLONG	qEx-ADN/ARN
SDS	CapitalBio	441060
Hydroxyde de sodium (NaOH)	XILONGS  ; Scientifique	Référence : XK13-011-00027
SSC	CapitalBio	441050
bain-marie thermostatique	SURUI	HH-W600