Tomographie série à haut débit utilisant un robot automatisé de changement d’échantillons

Summary

Les détails de la mise en œuvre et la procédure de collecte des données pour la tomographie à rayons X basée sur synchrotron utilisant le robot automatisé de changement d’échantillon à la ligne de faisceau Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging sont présentés et discutés ici. Cela améliore considérablement le débit et l’efficacité de collecte des données de la ligne de faisceau.

Abstract

Ce manuscrit décrit un flux de travail pour la collecte automatisée de données utilisant un bras robotique pour l’échange d’échantillons, améliorant significativement l’efficacité de la collecte des données. Cette configuration, mise en œuvre pour l’imagerie synchrotron à rayons X au niveau de la source lumineuse diamantée (DLS) I13-2, ligne de faisceau d’imagerie, utilise un robot pour réaliser une tomographie série à haut débit (3D) ou une imagerie (2D). Actuellement, pour de nombreuses expériences, le temps requis pour l’échange manuel et l’alignement des échantillons est comparable, voire supérieur, à la durée même de la tomographie elle-même. Pour maximiser l’utilisation efficace du temps de faisceau disponible et augmenter le débit expérimental, l’automatisation de l’échange et de l’alignement des échantillons est essentielle. L’utilisation du robot comme changeur d’échantillons peut augmenter le débit d’au moins 4 à 10 fois par rapport aux procédures manuelles, selon la taille de pixel choisie. Avec la machine Diamond II et les mises à jour I13L beamlines Operando Coherent TOmography et Ptychographic Imaging (OCTOPI), l’augmentation du flux de rayons X réduira encore les temps de balayage expérimental, rendant le système encore plus efficace. De plus, l’automatisation permet la collecte de données à distance, y compris un service optionnel de messagerie pour les utilisateurs. Le centrage automatisé des échantillons permet un balayage totalement sans surveillance, qui peut être effectué à distance. Cela représente une caractéristique unique et innovante du système. Ce manuscrit décrit la procédure complète, incluant la préparation de l’échantillon, le montage sur des supports spécialisés, le transport vers la ligne de faisceau et le placement sur les plateaux dédiés pour l’échange robotisé d’échantillons. La procédure de centrage automatisé des échantillons et la chaîne de reconstruction par tomographie qui suit sont présentées.

Introduction

L’automatisation est largement utilisée dans les industries manufacturières lourdes depuis^{des décennies 1, 2, 3}. Cependant, le développement de matériel et de logiciels robotiques a suffisamment mûri pour pouvoir gérer des tâches très délicates telles que le séquençage du génome, la réalisation de chirurgies médicales dans les hôpitaux ou l’assistance à la réalisation d’expériences de ^chimie 4,5,6,7. L’automatisation élimine non seulement les erreurs humaines, mais améliore aussi le débit et l’efficacité⁴.

Une source de rayons X synchrotron génère un rayonnement électromagnétique extrêmement brillant et très cohérent dans une large gamme spectrale, allant de l’infrarouge aux rayons X durs. Ces sources permettent des expériences d’imagerie à haut débit et haute résolution avec des temps de balayage très courts et des statistiques élevées. La cohérence partielle peut être utilisée pour obtenir un meilleur contraste pour des matériaux mous faiblement absorbants tels que les polymères ou les échantillons de tissu ^8,9,10 par rapport aux sources de rayons X en laboratoire. Un ensemble complet de données de tomographie aux rayons X – qui permet de visualiser un objet en 3D réelle – nécessite l’acquisition de projections de l’échantillon sous différents angles. Les avancées en luminosité source, en matériel expérimental et en contrôles permettent des temps de collecte de données allant de dizaines de secondes à⁸ minutes. En conséquence, la charge et l’alignement des échantillons sont devenus plus chronophages que la tomographie^{elle-même 11,12}. Il est important de noter que changer manuellement les échantillons dans une expérience de tomographie synchrotron peut prendre un temps significatif (comparé au temps de balayage), car une procédure de sécurité radiologique doit être suivie lors de l’entrée et de la fermeture de la cabine expérimentale. Cette procédure prend généralement plusieurs minutes. De plus, l’alignement de l’échantillon peut également prendre quelques minutes.

Si ce processus de changement et d’alignement des échantillons est automatisé, un temps significatif sera gagné. Par conséquent, un robot détacheur d’échantillons a été mis en œuvre sur la ligne de faisceau I13-2 Imaging de l’installation du synchrotron DLS. Ce manuscrit décrit le protocole complet consistant à réaliser une expérience de microtomographie synchrotron à rayons X avec plusieurs échantillons à l’aide d’un robot détacheur d’échantillons à la ligne de faisceau d’imagerie I13-2^11,12. Cette mise en œuvre améliore non seulement l’efficacité du temps expérimental, mais permet aussi de mener des expériences à distance. L’alternative est l’utilisation manuelle ou semi-automatisée, les deux options étant nettement plus lentes. Ici, semi-automatisé signifie utiliser le robot uniquement pour l’échange d’échantillons sans alignement d’échantillon.

L’importance de l’automatisation est soulignée par des projets d’automatisation sur d’autres lignes de faisceau d’imagerie synchrotron, avec les projets les plus similaires sur la ligne de faisceau 2BM de l’APS¹³, la ligne de faisceau SLS^{TOMCAT 14}, la ligne de faisceau EMBL P14 sur PETRA III¹⁵, et la ligne de faisceau IMAGE à la source^{lumineuse 16} de l’Institut de technologie de Karlsruhe (KIT). Dans le 2-BM APS, les échantillons nécessitant un scan robotisé sont montés sur un support cinématique standard, placé dans un bac de changeur d’échantillons d’une capacité maximale de 60 échantillons à la fois. Un bras de présélection prend ensuite l’échantillon et le fixe sur l’étage de rotation. Cependant, l’alignement de l’échantillon est effectué hors ligne à l’aide d’un stéréoscope. Un système similaire a été installé dans la ligne de faisceau TOMCAT en SLS, sauf qu’ici le processus est entièrement automatisé, permettant d’effectuer le déchargement de charge de l’échantillon, l’alignement, le balayage d’une région d’intérêt correcte et la reconstruction. Le nombre total d’échantillons pouvant être scannés à la fois est de 60. Récemment, la ligne de faisceau P14 sur PETRA III¹⁵ a installé un système de changement d’échantillons capable de traiter des échantillons biologiques mous d’environ 1 mm de taille. Le positionnement et le centrage sont réalisés par la procédure de centrage à trois clics. À la ligne de faisceau IMAGE du KIT, une station terminale d’imagerie/tomographie à haut débit permet de mesurer jusqu’à 1 500 échantillons en deux^{jours 16}. Contrairement aux systèmes robotisés mentionnés ci-dessus, le système de ligne de faisceau I13-2 Imaging peut actuellement traiter des échantillons jusqu’à 8 mm de diamètre et mesurer jusqu’à 112 échantillons en un shift de huit heures, sans intervention humaine, y compris le centrage automatique des échantillons.

Le système actuel de tomographie à I13-2, Diamond-Manchester Imaging Beamline, a été rapporté dans la publication^{mentionnée 17}. Pour plus de complétude, les aspects clés des expériences de tomographie sont résumés ici ; veuillez également consulter la Figure 1. La pile de l’étape tomographique se compose d’un hexapode (PI miCos) pour la manipulation de l’échantillon ainsi que pour l’alignement de l’axe de rotation et de l’inclinaison. Un étage de rotation aéroporteur est monté sur le dessus de l’hexapode. L’étage de rotation présente d’excellents mouvements de balancement (<2,4 μrad) et d’erreur axiale (<100 nm). Le système de détecteur de tomographie est équipé de quatre grossissements différents (ou champ de vision). Pour l’étude actuelle, 1,25 × (taille effective de pixel de 2,6 μm avec champ de vision de 6,7 mm x 5,6 mm) et 4× (taille de pixel effective de 0,81 μm avec champ de vision de 2,1 mm x 1,8 mm) ont été utilisés. L’objectif 1,25× avait un scintillateur LuAg :Ce de 500 μm, tandis que l’objectif 4x avait un scintillateur LuAg :Ce de 100 μm (Crytur). Un détecteur sCMOS (pco.edge 5.5) enregistre l’image de l’écran à scintillation agrandie via un oculaire photo 2x supplémentaire (toutes les optiques de microscope proviennent d’Olympus). Les pixels effectifs varient de 2,6 μm à 0,33 μm, avec une résolution d’environ 1 μm au maximum de grossissement utilisé. La puce détectrice est composée de 2560 x 2160 avec une taille de pixel de 6,5 μm, et la vitesse maximale de lecture de la matrice de pixels est de 100 Hz.

Protocol

REMARQUE : Cette étude utilise des spécimens d’insectes provenant du Musée d’Histoire Naturelle (NHM) de Londres pour une analyse phénotypique comparative. Les spécimens avaient été acquis par le Musée d’Histoire Naturelle, suivant les procédures standard d’acquisition afin de garantir que les spécimens avaient été légalement collectés et donnés.

1. Planification de l’expérience

1. Vérifiez la faisabilité de réaliser des examens de tomographie ou d’imagerie avec l’échantillon d’intérêt à la ligne de faisceau I13-2 en contactant le personnel de la ligne de faisceau via le lien suivant : https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Soumettez une proposition pour obtenir un créneau horaire pour réaliser l’expérience prévue en utilisant le lien suivant : https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Discutez de la préparation de l’échantillon et du processus de mesure de l’échantillon avec le personnel de la ligne de faisceau une fois la proposition acceptée et l’expérience programmée. Les expériences menées avec le robot ont certaines exigences, qui sont précisées dans la section suivante (section 2).
4. Discutez des dimensions et de la composition de l’échantillon avec le personnel de la ligne de faisceau pour vérifier que l’expérience peut être réalisée avec succès à la ligne de faisceau.
5. Commencez à vous préparer à la visite expérimentale bien à l’avance en suivant les instructions sur le site web (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Terminez la formation à la sécurité avant la séance expérimentale.

2. Préparation de l’échantillon (pour des expériences robotiques)

1. Préparez les bases d’échantillonnage^{compatibles SPINE-Compatible 18} pour le montage de l’échantillon. Montez chaque échantillon sur une base standard de type SPINE, équipée d’un code-barres Data Matrix pour permettre le suivi automatisé des échantillons.
2. Fixez l’échantillon à la base en utilisant l’une des deux configurations. Montage de broches : fixez l’échantillon sur une goupille de type SPINE (voir Figure 1C, en insert). Conteneur ou montage direct : Placez l’échantillon dans un contenant compatible, tel qu’un tube de microcentrifuge/tube polyimide, ou directement sur la base de l’échantillon.
3. Vérifiez la compatibilité dimensionnelle avec la pince robotisée en vérifiant que l’échantillon monté correspond aux enveloppes de taille autorisées afin d’assurer une manipulation robotique sécurisée (voir Figure 2) :
   Option A : S’adapte à un cylindre de 8 mm de diamètre x 20 mm de hauteur.
   Option B : S’insère dans un cylindre de 3,5 mm de diamètre x 33 mm de hauteur.
4. Assurez-vous que les deux configurations sont centrées sur la base de l’échantillon. Assurez-vous que la hauteur totale (échantillon + support + base) ne dépasse pas 27 mm ou 40 mm, selon la configuration choisie.
5. Lors du montage des échantillons sur des broches SPINE, assurez-vous que l’échantillon est positionné au-dessus de la broche, sans qu’aucune partie ne soit cachée par l’arbre de la goupille. L’échantillon doit être monté verticalement et au centre sur la base de la goupille pour éviter tout contact avec la pince robot. Cela est particulièrement important pour le montage de l’option B décrit dans la section 2.3 du protocole, ainsi que pour les échantillons allongés montés sur les broches d’échantillon.
6. Lors du montage à l’intérieur de conteneurs ou de tubes, fixez l’échantillon fermement à l’intérieur du récipient afin qu’il ne bouge pas lors du transport ou de la manipulation robotisée. Assurez-vous que le récipient lui-même reste aligné verticalement sur la base de l’échantillon.
7. Fixez l’élément de montage choisi (goupille ou conteneur) solidement et verticalement sur la base de l’échantillon afin d’assurer la stabilité positionnelle tout au long de l’expérience.
8. Utilisez une méthode d’adhésif ou de fixation fiable pour éviter le décollement lors du transport et la manipulation automatisée, car les deux procédés peuvent introduire des contraintes mécaniques.
   REMARQUE : Les adhésifs courants incluent le cyanoacrylate (super glue), la cire de paraffine et la colle thermofusible. Consultez le personnel de la ligne de faisceau si vous êtes incertain de la compatibilité des matériaux.
9. Vérifiez que tous les échantillons sont positionnés à une hauteur constante depuis le bord supérieur du récipient ou sur la goupille d’échantillon. Pour les échantillons montés à l’intérieur des contenants, assurez-vous que la distance latérale par rapport à la paroi du conteneur reste la même pour tous les échantillons.
   REMARQUE : Un positionnement cohérent est essentiel pour un alignement automatique fiable. Des échantillons plus petits par rapport au champ de vision permettent une plus grande tolérance.
10. Documentez le code de la matrice de données associé à chaque échantillon afin d’assurer une identification correcte lors de l’analyse des données.
11. Générez un fichier samples.csv pour relier chaque nom d’échantillon à son code matriciel de données de base d’échantillon et pour transmettre les paramètres pertinents pour effectuer des scans de tomographie.

3. Emballage et livraison des échantillons

1. Au plus tard 15 jours ouvrables avant la session expérimentale, soumettez l’évaluation des risques expérimentaux (ERA) et déclarez tous les échantillons présents. Cette ERA doit être approuvée par le groupe santé et sécurité (HSE) du DLS avant que les échantillons ne soient autorisés à être expédiés ou amenés sur site.
2. Utilisez la base d’échantillon universelle avec le conteneur combiné de stockage et/ou d’expédition monté sur la goupille d’échantillon, également appelé Uni-puck. C’est assez important si vous envoyez par la poste.
3. Si les échantillons ne rentrent pas dans les emplacements du conteneur de stockage mentionnés à l’étape 3.2, veuillez organiser des configurations de montage alternatives, comme l’utilisation de capuchons magnétiques de protection qui s’adaptent à la base de l’échantillon et qui apportent directement les échantillons pour les mesures.

4. Installation expérimentale

1. Ajustez les paramètres de la source de rayons X pour maximiser le contraste dans l’échantillon. Pour cela, déplacez tout le spectre et/ou filtrez le spectre des rayons X.
2. Optimisez la caméra pour la distance d’échantillonnage en fonction du spectre des rayons X et du degré de contraste de phase souhaité pour un échantillon donné.
3. Sélectionnez le grossissement du microscope en fonction de la taille de l’échantillon et du champ de vision requis, puis sélectionnez l’objectif correspondant du microscope.
4. Alignez la position horizontale de la caméra (axe x dans le laboratoire) par rapport au faisceau de rayons X.

5. Chargement et alignement des échantillons

1. Vérifiez soigneusement les échantillons et le montage au début de chaque session expérimentale pour détecter tout échantillon semblant endommagé ou mal monté. Informez les utilisateurs de tout type d’échantillons.
   REMARQUE : Actuellement, la ligne de faisceau est équipée de supports pouvant atteindre jusqu’à 7 palets, chaque palet pouvant contenir jusqu’à 16 échantillons. Un total de 112 échantillons peuvent être mesurés lors d’une seule course robotique. Veuillez consulter la Figure Supplémentaire 2, qui illustre comment identifier les positions des emplacements (quilles) de la rondelle.
2. Montez les échantillons sur les emplacements correspondants de puck et de pucks (broches) identifiés dans le fichier samples.csv. Effectuez un essai complet de la procédure d’échange d’échantillons robotisés sur quelques échantillons afin de tester le fonctionnement du robot, ainsi que pour s’assurer que les échantillons respectent les spécifications requises.
3. Utilisez une base d’échantillon avec une goupille d’échantillon (sans échantillon) pour aligner l’axe de rotation de l’étage de rotation au centre du détecteur dans la direction horizontale.
4. Déplacez le haut de la goupille vers le centre de la caméra à rayons X (Figure 3A). Alignez la caméra du télescope (TC), qui est placée à 90° par rapport au faisceau, comme montré sur l’image (Figure 3), pour qu’elle soit au centre du champ de vision (FOV). Déterminez les coordonnées de cette position en coordonnées de pixels TC.
5. Mettez à jour la position cible de l’exemple dans le script qui gère l’alignement de l’échantillon.
6. Montez un échantillon représentatif. Exécutez le script automatique d’alignement des échantillons pour placer l’échantillon au centre de rotation sur le TC. Le lien vers le script est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1.
7. Vérifiez si la région d’intérêt de l’échantillon (ROI) est centrée dans le champ de vision (FOV) de la caméra à rayons X.
8. Si le ROI n’est pas centré dans le champ de vision, répétez les étapes 5.5 à 5.7 et affine l’alignement de l’échantillon en modifiant les coordonnées de la position cible.
   REMARQUE : Les sections 4 et 5 sont réalisées par le contact local sauf la section 4.2.

6. Installation de l’acquisition de données

1. Vérifiez que la structure de fichiers/dossiers requise sur le système de fichiers DLS a été créée pour stocker les données brutes, les fichiers de métadonnées et les résultats d’analyse.
2. Copiez le fichier samples.csv dans le dossier mentionné à l’étape 6.1.
3. Mettez à jour le temps d’exposition de la caméra et le nombre de projections à acquérir dans le samples.csv, en fonction de la structure de l’échantillon et du contraste souhaité.
4. Définissez deux groupes de positions motrices, appelés position de charge (LP) et position de balayage (SP). La LP est l’ensemble où les étapes sont optimisées pour la charge de l’échantillon, et la SP pour la tomographie de l’échantillon.
   REMARQUE : La section 6 est réalisée par le contact local ou automatiquement créée par les systèmes DLS.

7. Réalisation de la collecte de données

1. Montez tous les échantillons aux bonnes positions du palet et des quilles, comme indiqué dans le fichier samples.csv.
2. Pour la collecte de données, utilisez l’établi Generic Data Acquisition (GDA), un logiciel open source développé par DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). C’est un système basé sur Java utilisé dans DLS pour contrôler les expériences et collecter des données. Une capture d’écran est fournie dans la Figure Supplémentaire 1.
3. Utilisez un objet appelé tomomatic en GDA pour le changement automatique d’échantillons, l’alignement des échantillons et la mesure par tomographie.
4. Émettez la commande tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) dans le terminal GDA pour charger le fichier. Ensuite, donnez le tomomatic. scanne () pour exécuter la commande.
5. Le robot récupère d’abord l’échantillon dans le plateau de chargement et l’emmène au lecteur de codes-barres laser. Une fois le code-barres lu, l’échantillon est déplacé vers l’étape de la tomographie et le monte. Assurez-vous que tout le processus se déroule sans encombre.
   REMARQUE : Ici, un robot Yaskawa équipé d’une pince à flexion développée en interne est utilisé.
6. Une fois le chargement de l’échantillon effectué, les étages passent à la position SP. Ensuite, la fonction autoCentrePin dans le script tomomatic est exécutée, ce qui place l’échantillon dans le centre de rotation (COR). La mesure par tomographie à rayons X avec un robot changeur d’échantillons est désormais prête à être réalisée.
   REMARQUE : Veuillez consulter le Fichier Supplémentaire 1 pour le pseudo-code de l’écriture tomomatic.
7. Effectuer la fonction TomoFlyscan pour la mesure de la tomographie. La fonction collecte d’abord 40 images de projection sans faisceau de rayons X, appelée image sombre (DI), et 40 images avec faisceau de rayons X mais sans échantillon dans le faisceau, appelée image à champ plat (FI). Ces images seront utilisées pour la normalisation lors de la reconstruction des données.
8. Collectez des images de projection (PI) avec l’échantillon dans le faisceau à des intervalles d’angle de rotation de l’échantillon, comme indiqué dans le fichier samples.csv. Pour le cas présent, il y a 3001 images PI.
   REMARQUE : Toutes les étapes, de 7.5 à 7.8, se succèdent les unes après les autres sans intervention humaine.

8. Accès aux données et analyse

1. Accédez aux données sauvegardées en naviguant dans le système de fichiers et le dossier appropriés. Les données numérisées mentionnées dans la section précédente sont sauvegardées dans deux fichiers différents, l’un avec *.nxs et *.hdf avec * un chiffre numérique, par exemple : 123456.nxs et 123456.hdf. Le NXS contient les métadonnées du scan, tandis que le HDF contient toutes les données d’image de projection (données liées depuis le NXS).
2. Utilisez le pipeline de reconstruction^{Savu 19} pour générer des tranches 2D à partir d’images de projection.
3. Accédez et visualisez les images reconstruites à l’aide d’un logiciel de rendu 3D, tel qu’AVIZO/ImageJ.
   REMARQUE : L’accomplissement des sections 7 et 8 nécessite des actions coordonnées à la fois des utilisateurs et des contacts locaux, chaque sous-étape étant réalisée individuellement.

Results

La figure 1 montre le robot changeur d’échantillons Yaskawa GP7 installé sur la ligne de faisceau Diamond I13-2 Imager. La figure 1A montre le robot (1) et le gripper de flexion conçu en interne (2). Cette pince peut contenir un échantillon d’un diamètre de ≤ 8 mm. La figure 1B montre le robot (1) et le système optique/caméra à rayons X (4) et (6) utilisés pour l’acquisition des données de tomographie. Le robot pince l’échantillon dans le plateau d’échantillons (3), qui peut contenir 7 uni-pucks avec 16 échantillons sur chacun, comme montré à la Figure 1C. Les échantillons sont montés sur la tige en aluminium (5), et l’acquisition des données de la tomographie est effectuée avec le système de détection (6). Les détails de (5) et (6) sont fournis dans le dernier paragraphe de la section introduction. La ligne rouge brisée dans la Figure 1B indique la direction du faisceau des rayons X.

Les détails du schéma de montage de l’échantillon et de la conception de la pince à flexion sont illustrés à la Figure 2. La figure 2A montre un échantillon cylindrique de plastique, fabriqué par impression 3D, collé sur la base de l’échantillon. La frontière de l’échantillon représente l’enveloppe de la hauteur maximale de l’échantillon et du diamètre. Les flèches rouges indiquent la position où la pince à flexure maintient la base de l’échantillon pour la déplacer du plateau à la phase de tomographie, et inversement. Un design 3D de la pince de flexion est présenté à la Figure 2B. Les doigts de la pince sont actionnés par un tube d’entraînement pneumatique (Figure 1B, point 2). L’espace central dans la pince a un diamètre de 8,9 mm, comme montré à la Figure 2C, permettant une taille d’échantillon maximale de 8 mm avec une marge de ~1 mm. La Figure 2D montre l’image du sommet de l’étage de tomographie. Une cheville en aluminium est montée au-dessus des deux étages orthogonaux et d’un disque magnétique, qui a un diamètre exact de sorte que la cavité au bas de la base de l’échantillon s’adapte. Comme ce disque est magnétique, il maintient fermement la base montée de l’échantillon en place lors des mesures de tomographie.

Pour cette expérience représentative, 64 échantillons d’insectes fournis par le Musée d’Histoire Naturelle (NHM) de Londres ont été sélectionnés. Les spécimens ont été sélectionnés pour représenter une gamme de phénotypes d’arthropodes tout en respectant les contraintes de taille de la pince. Comme les arthropodes, en particulier les insectes, représentent la grande majorité de la diversité d’espèces connues, avec plus d’un million d’espèces nommées, il est particulièrement difficile de les échantillonner pour des études comparatives de phénotype. Le présent échantillon démontre donc le potentiel de cette approche en échantillonnant trois clades d’arthropodes au niveau de classe : Arachnida, Entognatha et Insecta, ainsi qu’en échantillonnant plus finement chez les insectes pour capter la variation en sept ordres, dont quatre des ordres les plus riches en espèces encore en vie aujourd’hui. Les spécimens étaient fixés sur un carton avec de l’adhésif. Les cartes étaient ensuite montées sur les broches d’échantillon. Il est évité de monter des échantillons (insectes) directement sur les broches d’échantillonnage car une structure très absorbante dans la poutre avec des échantillons à faible absorption crée des artefacts de stries lors des reconstructions, en plus de la difficulté de les fixer solidement sur les goupilles d’échantillon. Le tableau 1 montre le modèle samples.csv fichier que l’utilisateur remplira avec les paramètres requis pour la tomographie (colonnes A, B, C, E, F, G, H, K). La description de chacune des colonnes est fournie dans le tableau. Les colonnes D, I, J et L dans le input_file sont remplies après alignement et optimisation des paramètres de tomographie à la ligne de faisceau. Les 64 échantillons ont d’abord été mesurés avec un objectif 1,25x (FOV de 6,7 mm x 5,6 mm) à une distance de propagation optimisée des rayons X (de l’échantillon au détecteur), puis les mêmes échantillons ont été mesurés avec un objectif 4x en utilisant ses propres paramètres optimisés. Une fois les échantillons chargés sur le plateau et la cabine expérimentale sécurisée, le balayage est lancé avec GDA.

L’alignement automatique de l’échantillon était effectué par un script écrit en Python (Emplacement du fichier sur GitHub : https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). Au début, l’alignement de l’échantillon est configuré à l’aide d’une base d’échantillon et d’une combinaison de goupille d’échantillon sans l’échantillon. La Figure 3 montre la broche de l’échantillon, telle que vue par la caméra latérale du télescope (caméra positionnée à 90° par rapport au faisceau de rayons X - Figure 1B, point 4), utilisée comme échantillon d’alignement standard. L’image de la caméra du télescope est binarisée afin que l’échantillon puisse être détecté depuis l’arrière-plan. Les bords de l’échantillon sont déterminés et marqués comme une frontière blanche, comme montré à la Figure 3. La position de coordonnée de référence de l’échantillon est le sommet de la goupille marquée par un cercle blanc dans l’encart de la Figure 3A. En regardant l’image aux rayons X, le ROI de l’échantillon est positionné sur le COR, et la position requise des coordonnées cibles, indiquée par une flèche bleue à double tête croisée avec un point rouge (Figure 3B), est déterminée sur la caméra latérale. Ce réglage de position cible permet de placer l’échantillon non seulement sur le COR, mais aussi quelques mm plus haut/plus bas ou légèrement décalé, si nécessaire. Après que l’échantillon a été chargé sur l’étage de tomographie, la fonction de centrage automatique est exécutée. Le script déplace d’abord l’échantillon à la position cible (Figure 3B) et passe à 0°. Ensuite, il déplace l’échantillon à 90° (Figure 3C) et détermine la quantité d’échantillon nécessaire pour placer l’échantillon dans le centre de rotation (COR). Cela prend généralement environ 15 à 20 secondes. L’échantillon est maintenant sur le COR (Figure 2D), et le COR a déjà été aligné avec le centre de la caméra. Le système est désormais prêt pour l’acquisition de la tomographie.

Dans cette étude sur les insectes du NHM, 128 tomographies ont été réalisées sans intervention humaine. La mesure a pris un total de 17 heures. Chaque scan durait environ 8 minutes. Une telle expérience sans l’utilisation du robot aurait pris environ 20 à 25 minutes par tomographie. Cela implique que les tomographies avec robots sont 3 à 4 fois plus rapides que les scans manuels dans le cas présent. Le tableau 2 présente un fichier journal typique généré à la fin d’un scan robotisé par lots, incluant les paramètres nécessaires pour lier chaque numéro de balayage à son échantillon correspondant. Des détails supplémentaires sont fournis dans la légende du Tableau 2 .

La Figure 4 montre des images de projection normalisées de l’un des échantillons, un insecte (Classe – Insecta, ordre – Coléoptères), imagé lors de l’expérience de tomographie mentionnée ci-dessus avec un grossissement de 1,25x et 4x. La rangée supérieure, Figure 4A-C, montre un échantillon imagé avec 1,25x, puis le même échantillon a été imagé avec 4x, c’est-à-dire Figure 4D-F. La figure 4 A–F présente les images de projection acquises à 0°, 90° et 180°. Le rectangle jaune affiche le FOV des images de projection zoomées acquises avec un objectif 4x. Il est important de noter qu’une fois les échantillons chargés sur le plateau montré à la Figure 1C, tous les processus se sont déroulés sans intervention humaine. Veuillez noter que ces deux scans ont été réalisés à ~8,5 heures d’intervalle. Cela indique la stabilité et la reproductibilité de l’installation.

La Figure 5 montre des tranches horizontales ou transversales issues de l’ensemble des tranches de reconstruction tomographique de l’échantillon mentionnées à la Figure 4. Les tranches 1,25x (Figure 5A) et 4x (Figure 5B) sont toutes deux tracées sans recadrer les images et ont des pixels de 2510 x 2510. Les tranches sont bien centrées dans le champ de vision, ce qui montre qu’il est possible de zoomer dans une région à grossissement plus élevé sans intervention physique.

Les résultats présentés ici démontrent que la mise en œuvre d’un système robotique pour l’échange d’échantillons dans les expériences de microtomographie synchrotron présente plusieurs avantages significatifs. Cela inclut un débit accru, une efficacité opérationnelle améliorée et la capacité à effectuer des scans à plusieurs grossissements (zoom) sans intervention humaine. Compte tenu du nombre d’échantillons à scanner, comme dans l’étude NHM présentée ici, il serait impossible d’obtenir des conclusions statistiquement robustes et cohérentes par un balayage manuel.

Figure 1 : Photo du robot et de l’installation expérimentale de tomographie installée sur la ligne de faisceau I13-2. (A) Le robot (1) avec une pince à flexion conçue en interne (2). (B) Le plateau de chargement des échantillons (3) et l’étape de tomographie (5). La caméra optique (caméra télescopique), indiquée (4), est utilisée pour aligner les échantillons sur le COR. Le système de détection (6) utilisé pour la mesure contient plusieurs objectifs motorisés pour modifier automatiquement le champ de vision, ainsi qu’un détecteur pco.edge 5.5. La flèche rouge pointillée représente la direction du faisceau des rayons X. (C) Image du plateau de chargement des échantillons avec 7 palets, et chaque palet peut contenir jusqu’à 16 échantillons montés sur une combinaison de base d’échantillon et de goupilles d’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Détails du schéma de montage de l’échantillon et de la conception du gripper à flexion. (A) Photo d’un échantillon factice en plastique imprimé en 3D monté sur une base d’échantillon, représentant l’enveloppe maximale d’échantillon pouvant être gérée par la pince à flexion. Les flèches rouges indiquent la position où la pince tient la base de l’échantillon. (B) Conception 3D du gripper de flexion. Les doigts de la pince sont actionnés pour maintenir ou libérer la base de l’échantillon. (C) Dessin en section verticale de la pince avec les dimensions. L’ouverture maximale au centre est de 8,9 mm ; par conséquent, la taille maximale autorisée de l’échantillon est ≤ 8 mm. (D) Image du sommet de l’étape de la tomographie. Une cheville en aluminium (indiquée par la flèche bleue) est montée au sommet des deux étages orthogonaux. Un disque magnétique est fixé au sommet de la tige sur lequel la base de l’échantillon (avec l’échantillon) est positionnée par la pince. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Instantanés du graphique vidéo de la procédure d’alignement COR utilisant la caméra télescope latérale. (A) Photo de la goupille d’alignement juste avant le début de la routine d’alignement. La position cible est la croix bleue à double tête avec un point rouge central, qui coïncide avec la COR de la phase de rotation de la tomographie. L’encadrement montre l’image agrandie du haut de la goupille montrant le centre d’échantillon détecté, à la fois en hauteur et en largeur. (B) Goupille alignée sur la position cible à 0°. (C) Goupille tournée à 90°, et elle est hors cible. (D) Goupille alignée sur la position cible à 90°. Maintenant, la broche est alignée dans les deux directions orthogonales ; par conséquent, l’échantillon tournera au centre de la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Images de projection normalisées d’un insecte collecté avec un objectif de 1,25x et un objectif de 4x. L’insecte appartenait à la classe des Insecta, ordre des Coléoptères. Cela représente deux des 128 tomographies effectuées. L’insecte a été collé sur un papier et fixé à l’épingle d’échantillon. Les images de projection avec un objectif de 1,25x sont à (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, et 4x à (D) 0°, (E) 90° et (F) 180°. Les séries de tomographies 1,25x et 4x ont été prélevées en une seule séance sans intervention humaine. Un ensemble d’images en 1,25x offre une vue complète de l’échantillon, et un ensemble 4x d’images montre la capacité de zoom. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5. Comparaison d’une tranche tomographique identique acquise à l’aide de deux champs de vision différents. Une tranche reconstruite à partir de la tomographie des images de projection affichées à la Figure 4 pour les grossissements (A) 1,25x et (B) 4x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Fichier samples.csv typique fourni par l’utilisateur contenant les paramètres de tomographie. Ce fichier est lu par le script tomomatic Python utilisé pour l’acquisition de données. Les colonnes A (description de l’échantillon), B (ID du puck ID), C (emplacement dans le puck), E (étape de rotation de la tomographie), F (nombre de FI), G (nombre de DI), H (grossissement à utiliser) et K (priorité de fente) sont remplies par l’utilisateur. Les colonnes D (temps d’exposition), I (distance de propagation aux rayons X entre l’échantillon et la caméra), J (mouvement de la caméra à travers le faisceau pour placer le COR au centre de la caméra) et L (code-barres de la base de l’échantillon) sont remplies après l’alignement et l’optimisation préliminaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Fichier journal de sortie typique enregistré comme Output_file.txt après que tous les échantillons ont été scannés. Le fichier rapporte tous les paramètres d’entrée et, en plus, il fournit le code-barres de l’échantillon balayé (colonne M), le chemin vers les métadonnées numérisées et les fichiers image (colonne N), ainsi que la position du moteur utilisé pour collecter FI (colonne O). En gros, ce fichier de sortie fournit les informations nécessaires pour la reconstruction et l’analyse des données. Comme aucune entrée n’a été fournie dans la colonne A du fichier d’entrée, cette colonne est remplie avec le nombre actuel du scan, ainsi que les numéros de puce et de broche. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Pseudocode décrivant le script utilisé pour faire fonctionner le robot en tant que changeur d’échantillons. Le fichier décrit la routine pour le montage automatique des échantillons, la lecture du code Data Matrix, l’alignement automatique des échantillons et l’exécution d’un scanner tomographique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : capture d’écran de l’interface graphique générique d’acquisition de données. Cette interface permet d’ajuster les paramètres de base de la caméra, de visualiser en temps réel l’échantillon et d’initier des acquisitions de tomographie. Les scans peuvent être lancés via le bouton à l’écran (balayage manuel uniquement) ou via l’interface en ligne de commande, indiquée par le rectangle jaune en bas au centre de la capture d’écran. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Photographie du standard SPINE Puck (à gauche) et du Puck Cap (à droite). Les positions des goupilles, indiquées en rouge, sur lesquelles sont montées les bases d’échantillons sont numérotées en partant de la position opposée à l’encoche sur le poteau central de retenue. Le numéro 7267 (marqué en blanc) est le numéro d’identification du palet. Le capuchon du palet peut être monté sur le palet pour protéger les échantillons lors du transport ou du stockage. Veuillez vous assurer que les tailles d’échantillons sont compatibles avant d’essayer de monter le bouchon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La préparation et l’alignement de l’échantillon sont deux étapes cruciales pour que le robot automatique de découpage d’échantillons fonctionne correctement et^{efficacement 11}. La taille de l’échantillon et les exigences de montage sont indiquées dans la Section 2 (Protocole). En gros, le diamètre de l’échantillon doit être de 8 mm ou moins et bien centré sur la base^{de l’échantillon 12}. Cette contrainte est fixée par les dimensions de la prise. De plus, tous les échantillons dans une seule mesure doivent être à la même hauteur afin que la position des échantillons au centre de rotation soit cohérente sur tous les échantillons. Si le robot a été aligné pour une expérience, alors une autre expérience avec le robot détacheur d’échantillons est entièrement automatisée, sauf pour définir la région d’intérêt de l’échantillon. Cela est expliqué dans la section des résultats représentatifs, Figure 3. Il est également important de noter que cela fait partie du processus d’alignement effectué par le personnel de la ligne de faisceau (contact local). Une fois cela établi, toutes les mesures d’échantillon sont effectuées sans intervention humaine. Du point de vue de l’utilisateur, les mesures sont entièrement automatisées. À ce jour, seules les bases d’échantillons et les broches d’échantillonnage de Molecular Dimensions Ltd sont utilisées ; cependant, d’autres fournisseurs, tels que MiTeGen et Hampton Research, produisent les bases d’échantillons et les broches de type SPINE.

Des pinces d’échantillon plus grandes, conçues pour contenir des échantillons allant jusqu’à 12 mm de diamètre, sont actuellement en développement et tests. Cela permettra au robot de manipuler des échantillons plus volumineux, comme ceux placés dans des tubes de microcentrifuge et montés sur une base d’échantillon. Une conception améliorée des pinces pourrait impliquer un mécanisme approchant l’échantillon de côté, supprimant ainsi les restrictions actuelles sur la taille de l’échantillon. De plus, la mise à niveau de la ligne de faisceau augmentera le débit d’un ordre de grandeur, permettant de scanner plus de 3 000 échantillons par jour. Cela permettra à son tour de collecter des ensembles de données statistiquement significatifs comprenant environ 30 000 échantillons dans les 10 jours suivant le temps de faisceau. Dans un avenir proche, nous mettrons en place un nouveau pipeline de reconstruction par tomographie, appelé HTTomo.

Il convient de noter que des paramètres tels que la distance de propagation du faisceau (distance échantillon-détecteur), le temps d’exposition, le nombre de projections, etc., doivent être optimisés à l’avance, comme dans toute autre expérience de tomographie synchrotron à rayons X. Une autre contrainte est que les étapes impliquées dans l’expérience, telles que la manipulation de l’échantillon sur 6 axes, les étapes de tomographie et les étapes de manipulation de la caméra, devaient se trouver à une certaine position définie pour le chargement et le déchargement de l’échantillon. Cela implique que les étapes doivent être déplacées d’avant en arrière lors du chargement et du déchargement de l’échantillon.

En conclusion, la tomographie à haut débit peut être réalisée avec l’aide du robot de changement d’échantillon, rendant le processus au moins 4 à 10 fois plus rapide et réduisant ou éliminant le temps mort par rapport à l’utilisation manuelle. L’automatisation expérimentale avec des robots nous permet également de déployer le personnel plus efficacement, car moins de personnes sont nécessaires pour effectuer les mesures. La mesure des ensembles de données statistiquement significatifs est importante dans de nombreux domaines scientifiques où un volume de données fiable et suffisant est nécessaire pour traiter le cas scientifique. Utiliser un robot peut grandement aider dans ce type de tâches.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Étage de rotation par roulements à air
AVIZO	ThermoFisher scientific		Logiciel commercial de visualisation et d'analyse des données
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Fournisseur alternatif CryoCap
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Fournisseur alternatif CryoCap
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Utilisé pour le montage des échantillons
Detector Optics	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objectif et Photo-oculaire
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Logiciel générique d'acquisition de données
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	Étage 6 axes pour l'alignement en tomographie et la manipulation des échantillons
ImageJ	Développé aux National Institutes of Health, University of Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Logiciel de traitement et de visualisation d'images open source
pco.edge 5.5 sCMOS camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Caméra à rayons X utilisée pour l'imagerie en tomographie
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Pipeline de reconstruction en tomographie
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Optique de scintillateur
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	Les échantillons sont montés sur Uni-puck pour que le robot puisse les prendre