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Article de méthode

Synthèse de vésicules unilamellaires géantes composées : un modèle biomimétique de cellules nucléées

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DOI :

10.3791/68274

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3 juillet 2025

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1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode de préparation de vésicules unilamellaires géantes composées (cGUV) avec une structure vésicule dans vésicule, avec une conductivité électrique personnalisée dans les régions intérieures, annulaires et externes. L’électroformation synthétise des GUV simples, qui sont transformés en stomatocytes et en cGUVs par choc osmotique, fournissant un modèle précieux pour l’étude de la biophysique des cellules nucléées.

Résumé

Une vésicule unilamellaire géante simple (sGUV) est une vésicule sphérique de la taille d’un micron, composée d’une bicouche lipidique qui enferme une solution aqueuse à l’intérieur et est suspendue dans un autre milieu aqueux. En tant que modèles biomimétiques de cellules biologiques, les sGUVs sont des systèmes bien établis pour les études biophysiques. Cependant, les sGUV imitent principalement les cellules anucléées, ce qui limite leur utilisation en tant que modèles pour les cellules non nucléées. Nous proposons des vésicules unilamellaires géantes composées (cGUVs) comme modèle biomimétique plus approprié pour les cellules nucléées. Les cGUVs sont des structures vésicule dans vésicule, où l’on peut supposer que les bicouches des vésicules externe et interne représentent respectivement la cellule et la membrane nucléaire d’une cellule.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple de synthèse des cGUVs. En bref, les sGUVs ont été générés en utilisant la composition lipidique du DMPC et du cholestérol dans la plage de 37 à 43 % molaire dans un milieu saccharose via la méthode d’électroformation. Ces sGUVs ont ensuite été soumis à un choc osmotique en introduisant une solution de glucose hypertonique, déclenchant une transition immédiate vers une forme somatocytaire. Ce processus a conduit à la formation d’un état intermédiaire où les vésicules externe et interne sont restées reliées par un col, ce qui a finalement entraîné le développement d’une structure vésicule dans une vésicule, appelée cGUVs.

De plus, on sait que les GUV préparés avec des taux de cholestérol plus élevés dans la bicouche présentent une perméabilité ionique réduite. Cette caractéristique permet d’ajuster la conductivité dans la solution annulaire d’un cGUV en ajustant les conductivités du milieu hydratant, de la solution interne par le glucose hypertonique et de la solution externe par l’ajustement de la dilution ou l’ajout de milieux conducteurs, ce qui permet d’obtenir des cGUV avec des conductivités contrôlées dans les régions externe, annulaire et interne, pertinent pour les études de champ électrique. Nous proposons cette approche efficace et simple pour synthétiser des vésicules composées qui peuvent être utilisées comme modèle biomimétique pour les cellules eucaryotes nucléées, faisant progresser leur application dans la recherche biophysique.

Introduction

Les modèles biomimétiques ont été largement utilisés pour étudier les phénomènes biophysiques complexes des membranes cellulaires. Ces modèles biomimétiques les plus simples fournissent des informations précieuses en minimisant les interférences de la myriade de variables présentes dans les cellules biologiques. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont un système biomimétique fondamental utilisé pour étudier la biophysique membranaire 1,2. Les GUV sont bien établis en tant que modèle représentatif de la membrane cellulaire. Ils comprennent une seule bicouche lipidique sphérique de 10 à 30 m de diamètre et sont encapsulés et suspendus dans une solution aqueuse. Dans cet article, nous les appelons sGUVs. Ces systèmes sont construits à l’aide d’une approche ascendante, où les composants cellulaires essentiels - lipides, protéines et catalyseurs - sont assemblés pour imiter la structure et la fonction des membranes biologiques 3,4.

Bien que des sGUV simples, avec seulement le noyau aqueux à l’intérieur, soient couramment utilisés, des modèles plus avancés ont été développés pour reproduire des caractéristiques spécifiques des cellules biologiques. Par exemple, les GUV avec des structures soutenues par l’actine émulent le cytosquelette 5,6,7, tandis que les environnements à forte teneur en sel sont utilisés pour imiter les conditions physiologiques. Les environnements à forte teneur en sel imitent les conditions physiologiques, mais il est difficile de les obtenir dans les GUV car les méthodes traditionnelles, telles que l’électroformation 8,9, sont souvent inadaptées à la synthèse de GUV de taille micrométrique dans de telles conditions. De nouvelles méthodes, telles que la méthode assistée par gel, qui utilise des gels polymères ou d’amidon pour aider à l’enflure des deux couches pendant l’hydratation, répondent à ces limites10,11. De même, les changements morphologiques des sGUVs ont été étudiés12. L’ajout de filaments fermés et ouverts, tels que l’actine encapsulée, les microtubules et d’autres composants du cytosquelette, de rigidité variable, et la condition de stress osmotique à l’intérieur de ceux-ci influencent la transition morphologique de ces vésicules osmotiquement dégonflées mais initialement quasi-sphériques. L’analyse théorique révèle diverses transformations morphologiques, y compris des structures tubulaires, sphériques, en forme de raquette, de cerise et de gouttelettes, ce qui s’aligne bien avec les observations expérimentales12. Ces résultats ont des implications importantes pour la compréhension de l’organisation des filaments, des microtubules et des nanoanneaux au sein des cellules et des vésicules. D’autres études examinent les méthodes d’encapsulation des protéines et explorent comment l’actine encapsulée, les microtubules et les composants cytosquelettiques régulent la forme des vésicules osmotiques dégonflées12,13.

De plus, inspirés par l’architecture cellulaire eucaryote, des modèles complexes basés sur GUV sont développés vers le développement de modèles artificiels ressemblant à la fission et à la division cellulaire, à la reproduction et aux caractéristiques multicompartimentaires des cellules eucaryotes, aux cellules auto-reproductrices 14,15,16,17 et aux cellules multicompartimentaires. Au-delà de l’application structurelle, les GUV sont également les modèles choisis pour comprendre l’électroporation cellulaire - un processus où un champ électrique appliqué induit la formation de pores dans la membrane lipidique en raison du stress de Maxwell. Les GUV, de dimensions comparables à celles des cellules biologiques, présentent une électrodéformation et une électroporation sous des champs électriques. De telles études sur les GUV donnent un aperçu des propriétés électromécaniques telles que la capacité de la membrane et la rigidité à la flexion18 et des mécanismes d’électroporation 2,19,20. Cependant, en pratique, ces études sont les plus représentatives des cellules anucléées, telles que les globules rouges (GR).

Pour combler cette lacune, nous proposons des vésicules unilamellaires géantes composées (cGUVs) comme nouveau modèle biomimétique pour les cellules eucaryotes nucléées21,22. Ces vésicules possèdent une structure vésicule dans vésicule, où la bicouche interne imite la membrane nucléaire et la bicouche externe représente la membrane plasmique. De plus, nous démontrons comment la conductivité électrique des régions intérieure, annulaire et externe peut être modulée sans nécessiter d’instruments avancés, tels que des micromanipulateurs ou des microseringues. Cette approche simplifiée de la synthèse des cGUVs offre une plate-forme prometteuse pour faire progresser la recherche biophysique sur les cellules nucléées.

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Protocole

1. Préparation des solutions de mélange de lipides

  1. Préparez une solution de 1 mL de DMPC et de cholestérol dans un rapport molaire de 63:37 à une concentration finale de 5 mg/mL. Pour cela, ajoutez 149 μL de DMPC (25 mg/mL de stock tel que reçu dissous dans le chloroforme), 252 μL de cholestérol (5 mg/mL de cholestérol dissous dans le chloroforme) et 599 μL de chloroforme.
  2. Préparez une autre solution de 1 mL de DMPC : Cholestérol dans un rapport molaire de 57:43 à 5 mg/mL, mélangez 139,8 μL de DMPC (25 mg/mL de stock tel que reçu dissous dans du chloroforme), 301 μL de cholestérol (5 mg/mL, préparé à partir de poudre dissoute dans du chloroforme) et 559,2 μL de chloroforme.
  3. Pour colorer la bicouche lipidique, ajoutez 100 μL de rouge du Nil (à partir d’une solution mère de 5 mM) à 1 mL du mélange lipidique contenant du DMPC et du cholestérol dans un rapport molaire de 63:37 (décrit aux étapes 1.1 et 1.2). Vous pouvez également ajouter 30 μL de Liss Rhod-PE (1 mg/mL de stock de Liss Rhod-PE) à 1 mL de mélange lipidique préparé (décrit aux étapes 1.1 et 1.2).
    REMARQUE : Comme le solvant (chloroforme) est très volatil, après des ouvertures répétées du flacon pour l’utilisation de la solution mère (25 mg/mL de DMPC), il peut se concentrer, ce qui peut modifier la composition.

2. Protocole d’électroformation pour la synthèse de vésicules unilamellaires géantes simples (sGUVs)

  1. Nettoyez soigneusement les lames recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) avec une solution de savon à vaisselle et rincez-les à l’eau désionisée (0,055 μS/cm). Nettoyez les lames avec une solution d’éthanol à 100 %, rincez-les à l’eau désionisée et faites-les sécher dans un four à 85 °C.
  2. Identifiez le côté conducteur des lames revêtues d’ITO à l’aide d’une pince ampèremétrique. Fixez la lame revêtue d’ITO nettoyée sur l’étage de spin coater à l’aide d’un aspirateur avec le côté conducteur vers le haut.
  3. Appliquez 25 μL des solutions lipidiques (préparées à l’étape 1.1) en coulant quatre gouttelettes de la solution sur le côté conducteur de la lame d’ITO. Ensuite, prendre une autre lame d’ITO et appliquer 25 μL des solutions lipidiques (préparées à l’étape 1.2) en coulant quatre gouttelettes de la solution sur le côté conducteur de la lame d’ITO.
  4. Séchez sous vide les deux lames recouvertes de lipides dans un dessiccateur conservé à l’obscurité pendant au moins 2 h.
    REMARQUE : La protection contre la lumière protège les lipides d’éventuels changements chimiques.
  5. Disposez une lame ITO recouverte de lipides (recouverte de lipides préparés à l’étape 1.1) en parallèle avec d’autres lames ITO propres, face conductrice face à face, avec une entretoise en caoutchouc de silicone de 3 mm d’épaisseur entre elles. Scellez l’ensemble avec une pince pour créer une chambre d’électroformation sécurisée.
  6. Suivez la même procédure décrite à l’étape 2.5 pour la lame recouverte d’ITO avec une solution lipidique préparée à l’étape 1.2 pour former une chambre d’électroformation.
  7. Placez les deux chambres dans un incubateur maintenu à 38-40 °C et remplissez la chambre avec 100 mM de solution de saccharose à l’aide d’une seringue de 2 mL. Appliquez un champ électrique alternatif de 5 Vpp à une fréquence de 10 Hz à l’aide d’un générateur de fonction à deux canaux pendant 4 h.
    REMARQUE : Assurez-vous que le côté conducteur de la glissière ITO est correctement fixé aux pinces crocodiles qui se connectent au générateur de fonctions.
  8. Débranchez la chambre d’électroformation du générateur de fonctions. Retirez la chambre de l’incubateur et laissez-la refroidir à température ambiante. Récoltez les sGUVs synthétisés dans les deux chambres à l’aide d’une seringue et transférez-les chacun dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et incubez à température ambiante (25-27 °C) pendant 1 h avant de les soumettre à un choc osmotique.

3. Transition de forme en choc osmotique (sGUV-à-stomatocyte-à-cGUV)

  1. Transvaser 200 μL de sGUVs en suspension dans un milieu hydratant contenant 100 mM de solution de saccharose dans une chambre d’observation.
  2. Introduire 125 μL de solution de glucose (300 mM) dans cette suspension sGUV contenant 200 μL de 100 mM de saccharose à l’intérieur de la chambre d’observation pour induire un choc osmotique qui initie la transition de forme des sGUVs.
    REMARQUE : Suivez la même procédure (donnée à l’étape 3) pour la synthèse de sGUV à partir de la composition lipidique donnée aux étapes 1.1 et 1.2 pour la transition de forme induite par un choc osmotique.
  3. Laisser reposer les sGUVs induits par le choc osmotique pendant 1 h dans la chambre d’observation placée sur la platine de microscopie.
  4. Pour conduire et observer la transition de forme des sGUVS, placez la chambre d’observation (chambre d’électrofusion, boîte de Pétri, lame de concavité ou toute autre chambre pouvant être utilisée pour l’observation en microscopie) sur la platine d’un microscope inversé et laissez les vésicules se déposer.
  5. Surveillez les transitions de forme qui se produisent à l’intérieur de la chambre. Utilisez le contraste interférentiel différentiel (DIC) et la microscopie à épifluorescence avec les objectifs Plan fluor, ELWD 20x/0.45 et Plan fluor, ELWD 40x/0.60 pour observer les transitions de forme des sGUVs.
  6. Observez la formation des vésicules stomatocytaires pendant la transition. Surveillez la chambre au fil du temps à mesure que de plus grandes vésicules se déposent au fond, suivies d’un nombre accru de vésicules plus petites.

4. Modification de la conductivité dans les régions intérieures, annulaires et externes des cGUVs

  1. Ajustez la conductivité des solutions dans différentes régions des cGUVs (interne, annulaire et externe) en ajoutant des quantités appropriées (μL) d’une solution saline mère de 7,5 mM avant d’administrer un choc osmotique aux sGUVs.
    1. Par exemple, pour créer une conductivité plus élevée dans les régions externe et interne par rapport à la région annulaire, transférez 200 μL de solution de saccharose dans la chambre d’électrofusion. Ajouter 20 μL de solution saline de 7,5 mM dans la chambre. Induire un choc osmotique en ajoutant 125 μL de solution de glucose 300 mM.
    2. Laissez reposer les sGUVs choqués par osmose pendant 3-4 h. Dans ce cas, les cGUV sont obtenus avec une conductivité plus élevée dans les régions externe et intérieure que dans la région annulaire à l’extrémité.
  2. Effectuer l’électrodéformation des cGUVs en appliquant un potentiel électrique alternatif de 7,5 Vpp à 100 kHz à l’aide d’un générateur de fonctions dans une chambre d’électrofusion contenant des fils-électrodes espacés de 500 μm.
  3. Après avoir appliqué un champ électrique alternatif, capturez une vidéo à 10 images/s et observez la déformation en forme aplatie des vésicules externes et la déformation en forme prolate des vésicules internes, confirmant une conductivité plus élevée dans les régions externe et interne que dans la région annulaire dans les domaines cGUV.

5. Analyse microscopique des cGUVs

  1. Imagerie au microscope inversé : Effectuez une microscopie à contraste interférentiel différentiel (CID) et à épifluorescence à l’aide d’un microscope inversé couplé à une caméra monochromatique. Utilisez la microscopie DIC et la microscopie à épifluorescence avec les objectifs Plan fluor, ELWD 20x/0.45 et Plan fluor, ELWD 40x/0.60 pour observer les transitions de forme des sGUVs. Utilisez un filtre vert (EX 510-560, DM 575, BA 590) pour la bicouche de coloration rouge du Nil pour l’étude de l’épifluorescence.
    REMARQUE : Les images DIC fournissent des informations précieuses sur l’état du cou connecté, confirmant s’il reste intact ou s’il subit une fusion pour former des cGUV.
  2. Utilisez le logiciel ImageJ pour insérer une barre d’échelle et recadrer les images de microscopie. Pour ajouter une barre d’échelle, accédez à Analyser | Réglez l’option Échelle pour calibrer l’image, puis accédez à Analyser | Outils | Barre d’échelle pour insérer la barre d’échelle.
  3. Microscopie confocale pour la morphologie : Pour obtenir une compréhension plus claire de la morphologie du cGUV, un microscope confocal à balayage laser est utilisé pour le balayage de l’axe z avec une taille de pas de 1 μm. Imagerie avec microscope confocal : utilisez un microscope confocal à balayage laser avec un objectif DIC à huile Plan-Apochromat 40x/1.3 pour imager les cGUVs. Imagez des cGUVs colorés en rouge du Nil ou en rhodamine-PE en utilisant un mode monocanal rouge, avec une longueur d’onde d’excitation de 561 nm et une plage d’émission de 561-695 nm.
  4. Pour modifier et extraire le fichier .czi de l’image dans le logiciel lié au microscope, insérez des graphiques comme une barre d’échelle et activez la vue 2D, 3D, puis allez dans Traitement | Méthode | Paramètres et cliquez sur Appliquer pour obtenir une image au format JPG.
  5. Préparation à la microscopie confocale : remplir une solution aqueuse contenant des cGUVs dans une chambre personnalisée modifiée (le verre inférieur remplacé par du verre Coverslip) pour l’imagerie confocale. Laissez l’échantillon intact pendant 10 à 15 minutes pour permettre aux cGUVs de se stabiliser pour l’imagerie confocale ; chargez le mélange de cGUVs dans la glissière de la cavité et scellez-le avec une lamelle pour arrêter les mouvements des cGUVs. Ensuite, analysez les cGUVs par microscopie confocale et z-scanning avec des intervalles de 1 μm.

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Résultats

Les sGUVs ont été synthétisés à l’aide de la méthode d’électroformation (comme le montre la figure 1) et récoltés dans la chambre à l’aide d’une seringue. Les sGUVs récoltés ont d’abord été visualisés au microscope inversé et soumis à un choc osmotique pour induire leur transformation en forme de stomatocytes. Après un remodelage membranaire supplémentaire, ce stomatocyte est transformé en une structure vésicule dans une vésicule appelée vésicule unilamellai...

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Discussion

La composition et les types de lipides déterminent en grande partie les propriétés mécaniques de la bicouche constituant un GUV. Une bicouche composée de DMPC/Chol présente des transitions de forme uniques lorsqu’elle est soumise à un choc osmotique. Sous l’effet d’un fort choc osmotique hypertonique, le fluide aqueux à l’intérieur du sGUV est expulsé, ce qui entraîne la déformation de la bicouche du GUV. Les transitions de forme observées sont principalement influencées par le flux sort...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Rupesh Kumar remercie le ministère du Développement des ressources humaines (MHRD) du gouvernement de l’Inde pour la bourse et la subvention de prévoyance du PMRF. Nous remercions chaleureusement le microscope confocal à balayage laser de l’installation centrale d’IRCC et de l’IIT Bombay.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cholesterol (Sigma grade, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667Pour la synthèse de sGUV
CholoroformMerck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602utilisé comme solvant pour la préparation de la solution mère de lipides
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345CPour la synthèse de sGUV
EthanolHaymanF204325Pour le nettoyage des lames ITO
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994Pour l'encapsulation à l'intérieur des vésicules internes des cGUV
GlucoseSigma-AldrichG-7021Pour la préparation de la solution de glucose, utilisée pour le choc osmotique des sGUV suspendus dans la solution de saccharose
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MGPour colorer les molécules lipidiques
Nile redSigma-Aldrich72485Pour la coloration des membranes des cGUV et des sGUV
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521Pour la préparation de la solution mère de sel, pour modifier la conductivité des compartiments des cGUV
SucroseSigma-AldrichS9378Pour la solution de saccharose en tant que milieu hydratant de la chambre d'électroformation
Équipements
Lames CavitlyBlue starsuspension de cGUV placée pour l'observation au microscope
Caméra cMOS pco.edge 4.2Excelitas61009524Pour les images monochromes fluorescentes et l'imagerie DIC
Lamelle de recouvrement (22 x 60 mm)Blue starPour recouvrir les lames à cavité
Chambre d'électrofusion EppendorfSigma-Aldrichsuspension de sGUV placée dans la chambre pour l'observation osmotique et au microscope, toute autre chambre simple peut également être utilisée
Générateur de fonction (Double canal)TektronixAFG3022CGénérateur de fonction utilisé pour fournir un champ électrique alternatif à la chambre d'électroformation
IncubateurPersonnalisé localementchambre d'électroformation placée à 40°
Lames ITOSigma-Aldrich576352-10PAKLames ITO utilisées dans la méthode d'électroformation
Microscope inversé Nikon EclipseNikonTE2000-UPour la visualisation des sGUV et des cGUV
Feuille de silicone (épaisseur de 3 mm)Sigma-AldrichGF49463141Pour l'espacement dans la chambre d'électroformation
Seringue (2 mL)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844Utilisée pour injecter un milieu hydratant et récolter les sGUV de la chambre d'électroformation
Configuration de microscopie confocale ZeissCentre des installations de l'IIT Bombay

Références

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