Article de méthode

Développement d’un nouveau cryoprotecteur à faible teneur en DMSO pour la conservation des cellules souches du sang périphérique

DOI :

10.3791/68275

⸱

20 juin 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole utilise un cryoprotecteur de cellules souches hématopoïétiques contenant une très faible concentration de diméthylsulfoxyde et démontre son innocuité clinique et son efficacité dans la protection des cellules souches hématopoïétiques, fournissant une nouvelle stratégie de cryoconservation de cellules souches hématopoïétiques dans la transplantation clinique de cellules souches autologues.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cryoconservation de cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique (PBHSC) est essentielle pour la greffe de cellules souches autologues (ASCT), mais les agents cryoprotecteurs traditionnels (TCPA) contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) soulèvent des problèmes de sécurité en raison du risque de toxicité. Cette étude visait à valider un nouvel agent cryoprotecteur à faible teneur en DMSO (CPA, 2 % DMSO) pour la conservation du PBHSC à -80 °C, éliminant ainsi le besoin de stockage d’azote liquide. Les PBHSC de six donateurs ont été divisés en groupes CPA et TCPA. Le CPA a été mélangé avec des PBHSC (1:1 vol/vol) et stocké directement à -80 °C. TCPA (10 % DMSO + 5 % d’albumine humaine) a subi un refroidissement progressif (1 °C/min) et un stockage d’azote liquide. Après 1 mois, les deux groupes ont été décongelés dans un bain d’eau à 37 °C. La viabilité cellulaire, l’intégrité du cytosquelette (microfilaments/microtubules), l’activité mitochondriale et la capacité de formation de colonies ont été comparées. Après décongélation, la survie des PBHSC était comparable entre le CPA (91,29 %) et le TCPA (90,07 %). Cependant, la CPA a surpassé la TCPA dans les tests de viabilité cellulaire (CPA : 89,38 % contre TCPA : 79,55 % ; p < 0,05). L’analyse du cytosquelette a révélé des microfilaments et des microtubules intacts dans les cellules préservées par CPA, avec une clarté structurelle supérieure à la TCPA. L’activité mitochondriale dans les cellules traitées au CPA reflétait les PBHSC fraîches, présentant une activité supérieure de 8,5 % à celle de la TCPA (p < 0,05) et une augmentation du nombre de complexes mitochondriaux. Les tests de formation de colonies ont confirmé la supériorité de la CPA, avec un nombre plus élevé de colonies après l’induction. Le CPA permet une cryoconservation PBHSC sûre et pratique à -80 °C en utilisant un DMSO ultra-faible (2 %), éliminant ainsi la dépendance à l’azote liquide. Sa viabilité cellulaire améliorée et sa préservation mitochondriale suggèrent des avantages cliniques en réduisant les risques de toxicité de la perfusion. Ce protocole offre une stratégie transformatrice pour ASCT, optimisant la sécurité et l’efficacité opérationnelle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est une option de traitement bien établie pour diverses hémopathies malignes, notamment la leucémie, le lymphome et le myélome multiple, où elle sert de traitement de première ou de deuxième intention pour reconstituer l’hématopoïèse et restaurer la compétence immunitaire après une chimiothérapie ou une radiothérapie intensive 1,2,3,4,5,6,7 . Le succès de l’ASCT dépend essentiellement de la viabilité des cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique cryopréservées (PBHSC), qui doivent conserver leur capacité fonctionnelle pour la reconstitution hématopoïétique et immunitaire 8,9,10,11,12. Le stockage des cellules souches hématopoïétiques est une étape critique de l’ASCT car après le prélèvement autologue de cellules souches hématopoïétiques, les patients subissent généralement une radiothérapie, une chimiothérapie et d’autres thérapies pour éliminer les cellules tumorales. La qualité du stockage des cellules souches hématopoïétiques est directement liée au succès ou à l’échec de la reconstitution hématopoïétique et immunitaire 13,14,15,16,17,18. Pour assurer la viabilité des cellules souches hématopoïétiques après la cryoconservation, les pratiques cliniques impliquent souvent l’ajout d’albumine de sang humain et de diméthylsulfoxyde (DMSO) en tant que CPA. Ces agents sont essentiels au maintien de l’activité cellulaire pendant et après le processus de cryoconservation. En règle générale, la concentration de DMSO utilisée varie de 5 % à 10 % (v/v). Des études ont indiqué que le maintien d’une concentration de DMSO d’au moins 3,5 % à 10 % (v/v) peut améliorer l’efficacité de la cryoconservation des cellules souches hématopoïétiques19,20. Cependant, l’application clinique du DMSO reste problématique en raison de la toxicité dose-dépendante, 30 % à 60 % des receveurs de greffe signalant des effets indésirables tels que nausées, vomissements et hypotension21,22. Pour remédier aux limites des agents cryoprotecteurs conventionnels (CPA) contenant 5 % à 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), cette étude vise à développer un nouveau CPA qui permet une cryoconservation sûre et efficace du PBHSC à -80 °C en utilisant des concentrations ultra-faibles de DMSO (2 % v/v), éliminant ainsi le besoin de protocoles complexes sur l’azote liquide tout en atténuant la toxicité associée au DMSO.

Les alternatives émergentes, telles que les CPA à base de tréhalose ou de polymères, sont prometteuses avant la clinique, mais se heurtent à des obstacles dans l’application clinique en raison d’obstacles réglementaires ou d’une incompatibilité avec les protocoles de décongélation standard23. En revanche, notre CPA s’appuie sur le profil d’innocuité établi des systèmes HSA-DMSO tout en introduisant des ratios d’additifs optimisés qui améliorent la cytoprotection. Cette méthode est particulièrement adaptée aux centres cliniques dépourvus d’infrastructure d’azote liquide ou nécessitant des flux de travail rapides. Cependant, pour un stockage à long terme (>2 ans), l’azote liquide reste préférable24. Les cliniciens doivent trouver un équilibre entre la simplicité du protocole et la tolérance individuelle du patient au DMSO, en veillant à ce que cette stratégie soit appliquée sur mesure afin de maximiser la sécurité et l’efficacité opérationnelle de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Dans cette étude, l’utilisation de cryoprotecteurs à teneur réduite en DMSO représente une stratégie cruciale pour préserver simultanément l’efficacité de la cryoconservation des cellules souches hématopoïétiques tout en minimisant la toxicité associée. L’efficacité, l’innocuité et la commodité d’une CPA de cellules souches hématopoïétiques nouvellement développée ont été évaluées pour la préservation des cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique (PBHSC). Une méthode de congélation simple et directe utilisant le nouveau CPA a été mise en œuvre, évitant les protocoles de cryoconservation conventionnels. Les résultats démontrent que la cryoconservation en une seule étape de suspensions cellulaires à -80 °C à l’aide de DMSO CPA à faible concentration permet d’obtenir des effets de conservation supérieurs à ceux du CPA traditionnel (TCPA). Cette approche peut offrir de nouvelles stratégies pour rationaliser le processus clinique de la greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH).

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les patients en oncologie hématologique subissant une ASCT ont été recrutés de juin 2020 à juin 2022 dans le service d’hématologie de l’hôpital de cancérologie de Shenzhen. Des échantillons de cellules sanguines ont été prélevés avant et après la mobilisation de la greffe pour la GCSH, y compris deux cas de leucémie myéloïde aiguë (LMA), deux cas de lymphome hodgkinien (LH), un cas de lymphome cutané véritablement histiocytaire (CGHL) et un cas de lymphome médiastinal primitif à cellules B (PMBL), avec un âge médian de 53 ans et une fourchette de 35 à 61 ans. L’étude a reçu le consentement éclairé des patients et l’approbation du comité d’éthique de l’hôpital de cancérologie de Shenzhen, avec le numéro de document d’approbation éthique AF-SC-07-2.0. Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux d’expérimentation, Hôpital du cancer, Académie chinoise des sciences médicales (Approbation No. NCC2018A073) et a respecté les directives internationales pour la recherche sur les animaux.

1. Sous-emballage et cryoconservation d’échantillons de cellules souches hématopoïétiques

  1. Préparation d’un poste de travail aseptique
    1. Lavez-vous soigneusement les mains et portez des masques et des gants stériles. Désinfectez les mains, les poignets et les coudes avec de l’éthanol à 75 %.
    2. Stérilisez tous les instruments de rechange (pipettes, hémostats) avec un autoclave ou une irradiation UV. Disposez les matériaux suivants sur l’enceinte de sécurité biologique : pointes de pipette stériles apyrogènes de 1 ml (2 boîtes), pipette de 1000 μL, tubes de cryoconservation stériles de 1,8 ml, tubes à centrifuger de 50 ml et boîte de stockage des tubes de cryoconservation (boîte de congélation programmable).
  2. Étiquetage et mélange cellule-CPA
    1. Étiquetez les tubes de cryoconservation avec l’ID de l’échantillon, la date, le nombre de cellules et le nom du donneur.
    2. Connectez la poche de cellules souches hématopoïétiques contenant 180 à 200 ml de cellules souches hématopoïétiques à la poche contenant 100 ml de nouveau cryoprotecteur à faible teneur en DMSO à l’aide d’un tube de perfusion stérile.
    3. Clampez le point médian du tube avec un hémostat stérile. Fixez une extrémité au sac de mélange cellule-CPA et l’autre à un tube à centrifuger de 50 ml.
  3. Remplissage et cryoconservation
    1. Libérez l’hémostat pour permettre un écoulement contrôlé du mélange cellule-CPA dans le tube de centrifugation.
    2. Prélever 1 mL d’aliquotes du tube à centrifuger à l’aide d’une pipette. Transvaser les aliquotes dans des cryotubes pré-étiquetés (30 tubes/échantillon). Serrez les bouchons et placez les tubes dans la boîte de rangement.
  4. Stockage et transport
    1. Transférez immédiatement la boîte de conservation dans un réfrigérateur à -80 °C. Pour le transport, emballez les cryotubes dans de la glace carbonique (-78,5 °C) avec surveillance de la température.

2. Cryoconservation et récupération des PBHSC

  1. Préparation et mélange des CPA et TCPA
    1. Pré-refroidissez une plate-forme à glace à 2-8 °C. Décongeler les cellules souches hématopoïétiques CPA et TCPA conformément aux directives du fabricant (voir le tableau 1 pour les compositions CPA/TCPA).
    2. Mélangez le CPA et le TCPA avec six échantillons PBHSC à un rapport de volume de 1:1 sur la plate-forme de glace. Transférez la suspension cellulaire dans des cryoflacons stériles.
  2. Cryoconservation CPA
    1. Placez directement les cryoflacons dans un congélateur à -80 °C. S’assurer que la concentration finale de DMSO dans la suspension est de 2 % (v/v). Conservez les échantillons pendant 1 mois.
  3. TCPA Cryoconservation (contrôle comparatif)
    1. Préparez du TCPA contenant 5 % d’albumine dans le sang humain et 10 % de DMSO (v/v). Chargez les suspensions PBHSC dans des cryoflacons et refroidissez-les à -80 °C à 1 °C/min à l’aide d’un congélateur programmable.
    2. Transférer les cryoflacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Conservez les échantillons pendant 1 mois.
  4. Réanimation cellulaire
    1. Récupérer les cryoflacons après 1 mois. Décongeler les cellules dans un bain-marie à 37 °C en agitant doucement (≤ 5 min).
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min pour éliminer les résidus de CPA/TCPA. Remettre en suspension 1 mL de cellules dans un milieu de culture RPMI 1640 préchauffé pour les essais en aval.

3. Essai de viabilité cellulaire

  1. Comptage de cellules basé sur l’image
    1. Préparez une solution de coloration mixte contenant 10 μg/mL d’orange d’acridine (AO) et 10 μg/mL d’iodure de propidium (PI).
    2. Mélangez 100 μL de suspension cellulaire avec 100 μL de solution de coloration (rapport 1:1) dans un tube de microcentrifugation stérile.
    3. Chargez 10 μL de l’échantillon coloré dans le compteur de cellules automatisé. Analysez la viabilité cellulaire à l’aide du logiciel intégré :
      Viabilité = cellules vivantes / cellules totales x 100 %
  2. Validation par cytométrie en flux
    1. Préparez la solution de coloration Annexin V-FITC/PI en mélangeant Annexin V-FITC (5 μL) et PI (5 μL) dans 100 μL de tampon de liaison.
    2. Ajouter 300 μL de suspension cellulaire à la solution de coloration et incuber à 25 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
    3. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension des cellules dans 500 μL de PBS et analyser la viabilité à l’aide d’un cytomètreen flux 25.

4. Essai de formation de colonies

  1. Préparation de suspension cellulaire
    1. Mélangez la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan à 0,4 % dans un rapport de 1:1 et incubez pendant 3 minutes pour distinguer les cellules viables des cellules mortes. Effectuer des comptages en double à l’aide d’un compteur de cellules automatisé pour déterminer la densité cellulaire viable (assurer la viabilité >90 %). Ajustez le volume de suspension des cellules à la concentration cible (1 x 106 cellules/mL) et filtrez à travers une crépine de 40 μm pour assurer la dispersion d’une seule cellule. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule stérile de 40 μm pour éliminer les agrégats.
  2. Mélange moyen
    1. Combiner 1 mL de suspension cellulaire avec 9 mL de milieu unitaire de formation de colonies de souris commerciales dans un tube conique de 15 mL (1:10 v/v).
    2. Tourbillonnez le mélange à 1 500 tr/min pendant 30 s pour assurer l’homogénéité. Centrifugeuse à 100 x g pendant 10 s pour éliminer les bulles d’air.
  3. Ensemencement cellulaire et configuration de l’humidité
    1. Versez 1,5 mL de mélange sans bulles dans une boîte de Pétri stérile de 35 mm. Ajoutez 3 ml d’eau distillée stérile dans une rainure périphérique du plat (ou placez un récipient stérile séparé à l’intérieur du couvercle du plat) pour maintenir l’humidité.
    2. Scellez le plat dans une chambre humidifiée (≥ 95 % d’humidité).
      1. Pour préparer la chambre, placez deux couches de papier absorbant stérile dans un récipient en plastique à couvercle (par exemple, une boîte de Pétri de 15 cm). Ajouter 10 ml d’eau déminéralisée stérile pour saturer le papier. Placez la boîte de culture tachée au centre de la chambre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de contact direct entre la boîte et le papier humide. Enroulez 3 fois un film transparent autour de la jonction couvercle-récipient pour une fermeture hermétique. Vous pouvez également fixer les bords du couvercle avec du ruban adhésif de laboratoire. Incuber la chambre scellée à 37 °C pendant 30 minutes pour équilibrer l’humidité ≥ 95 %.
  4. Culture et dénombrement des colonies
    1. Incuber les cellules à 37 °C sous 5 % de CO2 pendant 16 jours. Compter les colonies hématopoïétiques (≥ 50 cellules par grappe) à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40x. Calculer les unités formant colonies (UFC) par 1 x 104 cellules ensemencées.

5. Détection de l’activité mitochondriale

  1. Coloration cellulaire à la Rhodamine 123
    1. Mettre en suspension les PBHSCs à raison de 1 x 106 cellules/mL dans 1 mL de milieu RPMI1640. Ajouter le colorant Rhodamine 123 à une concentration finale de 5 à 10 μM. Incuber les cellules dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 10 min.
    2. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de RPMI1640 frais. Répéter la centrifugation et remettre en suspension dans 1 mL de PBS.
  2. Analyse par microscopie confocale
    1. Essuyez une lame de verre propre avec du papier non pelucheux pour enlever la poussière ou les contaminants.
    2. Remettre en suspension les PBHSC colorés dans le PBS à une densité appropriée pour éviter le chevauchement des signaux. Pipetez 10 à 20 μL de suspension cellulaire et distribuez-la lentement au centre de la lame.
    3. Inclinez la lamelle à un angle de 45°, touchez doucement un bord à la gouttelette et abaissez-la progressivement pour minimiser les bulles d’air. Appuyez légèrement pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties en une monocouche.
    4. Placez la lame horizontalement dans l’obscurité pendant 5 min pour permettre aux cellules de se stabiliser. Procéder immédiatement à l’analyse par microscopie confocale.
    5. Montez les cellules colorées sur une lame de verre. Observez la distribution mitochondriale à l’aide d’un microscope confocal (ex/em : 488/525 nm).
  3. Quantification par cytométrie en flux
    1. Analysez l’intensité de fluorescence de la Rhodamine 123 à l’aide d’un cytomètre en flux (canal FL1). Utiliser des PBHSCs traités au peroxyde d’hydrogène (1 mM, 1 h) comme témoins positifs26.

6. Coloration du cytosquelette des PBHSC

  1. Coloration des microfilaments (Actin Tracker Green-488)
    1. Préparez une sonde fluorescente de phalloïdine conjuguée à l’AF488 dissoute dans du PBS à une concentration finale de 5 U/mL. Diluer la solution mère (200 U/mL dans du méthanol) en mélangeant 5 μL de matière mère avec 195 μL de PBS (dilution 1:40). Tourbillonnez à fond pendant 10 s pour assurer l’homogénéité.
    2. Ajouter 200 μL de la solution de travail préparée Actin Tracker Green-488 (5 U/mL) dans les PBHSC. Incuber les cellules à 25 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
    3. Laver les cellules 2x avec 1 mL de tampon de lavage immunocolorant (0,1 % Triton X-100 dans PBS). Contre-coloration des noyaux avec 200 μL de DAPI (1 μg/mL) pendant 5 min à 25 °C dans l’obscurité.
  2. Coloration des microtubules (Tubulin Tracker Red)
    1. Préparer une sonde fluorescente de paclitaxel conjuguée à l’infrarouge dissoute dans du PBS à une concentration finale de 1 μM. Diluer la solution mère (100 μM dans le DMSO) en ajoutant 10 μL de matière première à 990 μL de PBS (rapport de dilution de 1:100). Agitez le mélange pendant 10 s pour assurer l’homogénéité et le protéger de la lumière.
    2. Préparer la solution de travail de Tubulin Tracker Red à une concentration finale de 250 nM dans un milieu complet. Diluer la solution mère (1 mM dans du DMSO) en ajoutant 2,5 μL de matière à 997,5 μL de milieu (taux de dilution de 1:400). Agiter le mélange pendant 10 s et ajouter 200 μL aux PBHSC. Incuber à 25 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
    3. Laver les cellules 2 fois avec 1 mL de tampon de lavage immunocolorant. Contre-coloration des noyaux avec 200 μL de DAPI (1 μg/mL) pendant 5 min à 25 °C dans l’obscurité.
  3. Montage et microscopie
    1. Laver les cellules colorées 2 fois avec du PBS. Mélangez des cellules colorées avec une solution de glycérol-PBS à 90 % (90 % de glycérol et 10 % de PBS, v/v) à un rapport de volume de 1:1. Pipeter 10 μL du mélange sur une lame de verre. Inclinez la lamelle à 45° et abaissez-la progressivement pour éviter les bulles d’air.
    2. Analysez la morphologie de l’actine/des microtubules à l’aide d’un microscope à fluorescence (excitation de 488 nm pour le vert d’actine ; 561 nm pour le rouge de tubuline). Inclure des témoins positifs : PBHSC traités à la cytochalasine B (5 μM, 2 h) pour la rupture de l’actine et PBHSC traités à la colchicine (10 μM, 3 h) pour la dépolymérisation des microtubules.

7. Évaluations de la sécurité de l’ACP

  1. Test d’hémolyse
    1. Préparez une suspension de globules rouges de lapin à 2 % en utilisant du sang frais anticoagulé à l’EDTA.
    2. Ajouter du CPA (0,1 à 0,5 ml) et du sérum physiologique (2,0 à 2,4 ml) à 2,5 ml de suspension cellulaire dans des tubes de verre.
    3. Utilisez une solution saline comme témoin négatif et de l’eau stérilisée comme témoin positif. Incuber à 37 °C pendant 3 h et observer l’hémolyse/coagulation au microscope.
  2. Test d’allergie systémique
    1. Préparation des animaux
      1. Utiliser 36 cobayes Hartley SPF (50 % mâles, 271-307 g ; 50 % femelles, 270-301 g) âgés de 4 à 5 semaines. Maintenir les conditions de logement suivantes : Température : 16-26 °C (± une fluctuation quotidienne de 4 °C), Humidité : 40 %-70 %, Ventilation : 8-10 changements d’air/h, Cycle d’éclairage : 12 h lumière/obscurité
    2. Phase de sensibilisation
      1. Injectez l’APC dans le quadrant inférieur gauche de la cavité péritonéale à raison de 2 mL/kg (faible) ou de 6 mL/kg (élevé) les jours 1, 3 et 5. La faible dose (2 mL/kg) simule les niveaux d’exposition clinique, tandis que la dose élevée (6 mL/kg) représente la marge de sécurité 3x pour évaluer l’hypersensibilité dose-dépendante, conformément à la ligne directrice 406 de l’OCDE pour les tests d’allergie systémiques27,28.
      2. Utilisez de l’albumine sérique humaine (contrôle positif) et une solution saline (contrôle négatif).
    3. Phase de défi
      1. Administrer l’APC par voie intraveineuse par la veine marginale de l’oreille à raison de 4 mL/kg (faible) ou de 12 mL/kg (élevé) les jours 19 et 26. Les doses de provocation (2 doses de sensibilisation) s’alignent sur les protocoles établis pour provoquer l’anaphylaxie chez les cobayes présensibilisés, tels que validés dans des études antérieures sur la biocompatibilité des cryoprotecteurs29.
      2. Surveiller les symptômes d’anaphylaxie (détresse respiratoire, convulsions) pendant 1 h après l’injection.
    4. Manipulation post-expérimentale
      1. Remettre les cochons d’Inde aux soins vétérinaires pendant 72 heures d’observation. Euthanasier par exsanguination de l’aorte abdominale sous anesthésie à l’isoflurane.
  3. Essai de toxicité systémique aiguë
    1. Injection chez la souris
      1. Injecter 50 mL/kg de CPA dans la veine de la queue de 10 souris ICR mâles (32,0 à 37,1 g, âgées de 6 semaines). Utilisez des souris injectées de solution saline comme témoins négatifs (n = 10).
    2. Protocole d’observation
      1. Surveiller la survie, les signes de toxicité et le poids à 4, 24, 48 et 72 heures après l’injection. Maintenir les conditions du logement : Température : 20-25 °C (± 3 °C par jour), Humidité : 40 %-70 %, Ventilation : 10-20 renouvellements d’air/h.
    3. Euthanasie
      1. Anesthésie les souris avec 3 % d’isoflurane. Euthanasier par exsanguination de l’aorte abdominale.
  4. Test d’irritation vasculaire
    1. Administration de lapins
      1. Utilisez 6 lapins néo-zélandais mâles (3,65-4,36 kg, 7-8 mois). Injecter 5 mL/kg de CPA dans la veine de l’oreille droite chaque semaine (3 doses au total). Injectez une solution saline dans l’oreille gauche comme contrôle négatif.
    2. Évaluation des tissus
      1. Examinez les sites d’injection pour détecter un érythème, un œdème ou une nécrose les jours 18 et 19. Évaluez l’irritation au point d’injection en fonction de la gravité de l’érythème, de l’œdème et de la nécrose. Appliquer le système de notation ISO 10993-12 avec des notes allant de 0 (aucune réaction) à 4 (nécrose sévère)30,31.
    3. Manipulation post-expérimentale
      1. Anesthésier les lapins avec de la tilétamine-zolazépam (5 mg/kg, IM). Euthanasier par saignée rapide de l’artère carotide.

8. Transplantation de PBHSC

  1. Inscription et mobilisation des patients
    1. Recruter six patients répondant aux critères de transplantation : Cellules mononucléées ≥ 5 x 108 cellules/kg
      Cellules CD34+ ≥ 2 x 106 cellules/kg23. Exclure les patients âgés de <18 ou >65 ans, ceux présentant des infections actives, un dysfonctionnement organique grave, une grossesse/allaitement, un traitement immunosuppresseur récent (dans les 4 semaines) ou des troubles psychiatriques non contrôlés.
    2. Mobiliser les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse vers le sang périphérique à l’aide du facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF). Mobiliser les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse vers le sang périphérique en administrant quotidiennement par voie sous-cutanée un facteur de stimulation des colonies de granulocytes à une dose de 10 μg/kg (la dose exacte varie d’une personne à l’autre) pendant 5 jours consécutifs.
  2. Collection et cryoconservation des PBHSC
    1. Prélever les PBHSC mobilisées à l’aide d’un appareil d’aphérèse dont le débit sanguin est réglé à 40 mL/min et dont le rapport anticoagulant/sang total est de 1:12. Traitez 15 à 16 L de sang total par séance pour obtenir 180 à 200 ml de concentré de PBHSC. Divisez l’échantillon en deux aliquotes, et chaque sachet a une capacité de 90 à 100 ml.
    2. Mettre en suspension la première aliquote dans du diméthylsulfoxyde à 10 % (DMSO) et de l’albumine sérique humaine à 5 % pour la transfusion clinique. Placez l’aliquote remise en suspension dans un récipient de congélation programmable avec une vitesse de refroidissement de -1 °C/min à -80 °C. Étiquetez le sac cryogénique avec l’identification du patient et les paramètres de congélation (par exemple, numéro de lot, date). Préparez la deuxième aliquote dans du DMSO à 5 % et du sérum de bovin fœtal à 10 % pour les tests de viabilité.
  3. Décongélation et réinjection
    1. Décongeler les PBHSC cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C (≤ 2 min). Administrer les cellules décongelées par voie intraveineuse après un conditionnement à la chimiothérapie/radiothérapie. Administrer les cellules par voie intraveineuse à l’aide d’un cathéter veineux central dans les 30 minutes suivant la décongélation à l’aide d’un pousse-seringue à raison de 3 à 5 mL/min.
  4. Suivi post-transplantation
    1. Suivre la récupération hématopoïétique par numération globulaire quotidienne : Seuil de réussite des neutrophiles : ≥ 0,5 x 109 cellules/L ; Seuil de réussite plaquettaire : ≥ 20 x 109 cellules/L32.
    2. Surveiller la reconstitution immunitaire grâce à l’analyse des sous-ensembles de lymphocytes. Prélever 5 mL d’échantillons de sang périphérique dans des tubes EDTA. Colorez les cellules avec des anticorps fluorescents contre CD3, CD4, CD8, CD19 et CD56 pendant 15 minutes dans l’obscurité. Analysez les sous-ensembles de lymphocytes à l’aide d’un cytomètre en flux et d’une stratégie de contrôle standardisée. Comparer les comptes absolus (cellules/μL) aux plages de référence saines appariées selon l’âge à des fins d’interprétation.

9. Analyse des sous-populations des PBHSC

  1. Coloration des anticorps
    1. Préparez les PBHSC congelés (groupes CPA/TCPA) et décongelez-les dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Cellules de marquage avec des anticorps fluorescents : CLP : CD45-CD34+CD10+ (clones HI30+4H11+HI10a) ; MEP : CD45-CD38+CD135-CD45RA- (clones HIT2+4G8+5F3+HI100) ; GMP : CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Figure 1). La centrifugeuse a décongelé les PBHSCs à 300 x g pendant 5 min pour éliminer les agents de cryoconservation. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 106 cellules/mL dans un PBS contenant 2 % de sérum de bovin fœtal.
    3. Préparez des cocktails d’anticorps à l’aide de clones HI30/4H11/HI10a pour CLP et HIT2/4G8/5F3/HI100 pour MEP/GMP aux titres recommandés par le fabricant. Incuber des cellules avec des mélanges d’anticorps pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C avec un léger vortex toutes les 10 min. Laver les cellules colorées 2 fois avec du PBS à froid + 0,1 % d’azoture de sodium par centrifugation à 200 x g pendant 3 min. Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de PBS avec 1 μg/mL de DAPI pour une vérification de la viabilité avant l’analyse par cytométrie en flux.
    4. Incuber à 4 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Laver 2 fois avec du PBS contenant 1 % de BSA.
  2. Configuration de la cytométrie en flux
    1. Remettre en suspension les cellules colorées dans 500 μL de PBS. Analyser des sous-populations à l’aide d’un cytomètre en flux : Configurer des lasers (488 nm, 640 nm) et des filtres (FITC, PE, APC). Collectez ≥ 10 000 événements par échantillon.
    2. Populations de portes basées sur la diffusion avant/latérale et l’intensité de fluorescence (Figure 1).
  3. Comparaison des données
    1. Calculez les pourcentages CLP/MEP/GMP à l’aide du logiciel FlowJo v10.8. Comparez les groupes CPA et TCPA à l’aide du test t de Student (α = 0,05). Visualisez les différences à l’aide de Prism 9.0 (diagrammes à barres avec MEB)33.

10. Analyse statistique

  1. Effectuez une comparaison des moyennes des variables numériques continues qui étaient conformes à une distribution normale avec une variance du khi-carré, à l’aide du test t, et pour les variables numériques continues qui n’étaient pas conformes à une distribution normale, testez-les de manière non paramétrique.
  2. Déclarez les données pour les variables continues comme la moyenne ± l’écart-type ou la médiane et les quartiles supérieur et inférieur. Utilisez le test exact de Fisher pour comparer les taux entre les deux groupes.
  3. Analysez des données et tracez à l’aide des logiciels SPSS 26.0 et GraphPad Prism 9. Considérez toutes les différences dans les tests bilatéraux comme statistiquement significatives si p < 0,05. Certaines données sont présentées sous forme de descriptions statistiques.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comparaison des méthodes de cryoconservation en une étape et de cryoconservation à l’azote liquide
La viabilité des PBHSC cryoconservés après la récupération a été évaluée à l’aide d’essais AO/PI. Comme le montre la figure 2A, la viabilité des PBHSC cryoconservés à -80 °C à l’aide de CPA était de 91,29 % (n = 3, ET = 1,86), tandis que pour ceux conservés dans de l’azote liquide, la viabilité était de 90,07 % (n = 3, ET = 1,64). L’analyse statistique n’a révélé aucune différence significative entre les deux méthodes (p > 0,05). Cependant, la méthode de cryoconservation en une seule étape s’est avérée plus rapide et plus pratique. Ces résultats suggèrent que la méthode de cryoconservation en une seule étape est une alternative supérieure pour la conservation des cellules.

L’effet de cryoconservation du CPA sur les PBHSC surpasse la méthode conventionnelle de cryoconservation
Les viabilités cellulaires des PBHSC cryoconservés après récupération ont été détectées par des tests AO/PI et Annexine V/PI. Comme le montre la figure 2, la viabilité cellulaire de six échantillons de PBHSC récupérés et conservés avec une CPA a atteint 89,38 % (n = 6, ET = 1,87, figure 2B) et 88,20 % (n = 6, ET = 2,72, figure 2C), respectivement, dans ces deux essais. Cependant, ceux conservés par TCPA étaient de 79,55 % (n = 6, ET = 3,16, figure 2B) et 73,05 % (n = 6, ET = 7,47, figure 2C). Ces résultats suggèrent que le CPA est un cryoprotecteur plus efficace pour les PBHSC par rapport au TCPA, ce qui permet une meilleure préservation de la viabilité cellulaire et des taux de récupération.

Les PBHSC préservées avec CPA maintiennent la structure complète du squelette cytoet l’activité mitochondriale
La définition étroite du cytosquelette fait référence au réseau de fibres protéiques, de microtubules (MT), de microfilaments (MF) et de filaments intermédiaires (FI) dans les cellules eucaryotes34. Dans cette étude, nous avons principalement étudié l’intégrité structurelle de la MT et de la MF après cryoconservation des PBHSC pour prouver que les PBHSC pouvaient maintenir l’intégrité du cytosquelette après la cryoconservation des CPA. Pour marquer les structures des microfilaments et des microtubules des cellules vivantes, le peptide cyclique Alexa Fluor 488 et les analogues du Taxol ont été utilisés comme sondes fluorescentes, respectivement. Comme le montrent les figures 3A et B, les PBHSC préservés par CPA conservent encore des structures intactes de microfilaments et de microtubules.

Les mitochondries des PBHSC préservées par CPA ont été marquées avec une solution de colorant de rhodamine 123, et les PBHSCs traitées avecH2O2 ont été utilisées comme contrôle positif. Les résultats (Figure 3C) ont montré que la structure mitochondriale a été observée dans les cellules préservées CPA, alors qu’elle n’a pas été observée dans le groupe témoin positif. Les mitochondries marquées à la rhodamine 123 ont également été détectées par cytométrie en flux. Il a été constaté que les PBHSC préservées par CPA maintenaient une meilleure activité mitochondriale que la méthode traditionnelle (Figure 4).

Les PBHSC conservées avec CPA maintiennent la capacité de former des clones
Nous avons également évalué la capacité proliférative et différenciative des PBHSC préservées avec CPA et TCPA en effectuant des tests de formation de colonies. Plus précisément, nous avons évalué la capacité des PBHSC à former des colonies BFU-E, CFU-E, CFU-GM et CFU-GEMM en culture. Le nombre total de colonies observées dans le groupe de cellules fraîches était de 70,33 (n = 6, ET = 14,02). En revanche, le groupe CPA présentait un total de 65,33 colonies (n = 6, ET = 8,07), tandis que le groupe TCPA présentait un nombre significativement plus faible de 46,17 colonies (n = 6, ET = 8,50). Ces résultats démontrent que les PBHSC préservées avec CPA ont conservé leurs capacités prolifératives et différenciatives de manière comparable à celle du contrôle des cellules fraîches, comme en témoigne le nombre similaire de formations de colonies dans diverses lignées cellulaires. En revanche, les PBHSC conservées avec TCPA ont montré une réduction de leur potentiel prolifératif et différenciatif. Ces résultats indiquent que les PBHSC cryoconservés avec CPA conservent mieux leurs capacités fonctionnelles (Figure 5 et Figure 6).

Évaluations de l’innocuité de l’APC in vitro
Une surveillance in vitro de l’hémolyse érythrocytaire de lapin a été réalisée. Pour tester les effets de différents volumes de CPA (allant de 0,1 à 0,5 ml) et de solution saline normale (allant de 2,0 à 2,4 ml) sur l’hémolyse, 2,5 ml de suspension de globules rouges de lapin à 2 % ont été ajoutés à des tubes à essai en verre avec les CPA ou une solution saline normale. Le témoin négatif (eau stérilisée pour injection) et le témoin positif (solution saline normale) ont également été inclus. Dans les tubes contenant des CPA ou une solution saline normale, les érythrocytes se sont déposés au fond du tube et la solution supérieure était claire et incolore. Après secousse, les érythrocytes ont été uniformément dispersés. Le groupe témoin positif (eau stérilisée) présentait une couleur rouge vif, et aucune stratification n’a été observée, avec seulement une petite quantité de globules rouges restant au fond du tube (figure 7). Ces résultats suggèrent que les CPA ne provoquent pas d’hémolyse ou de condensation des globules rouges de lapin. L’irritation vasculaire de l’APC a été évaluée chez des lapins néo-zélandais. Des coupes pathologiques ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE), et des observations cliniques générales et locales d’irritation ont été effectuées après l’administration finale. Aucune réaction anormale n’a été observée chez les animaux de laboratoire, et aucun changement pathologique n’a été observé dans les sites d’administration locaux. Ces résultats indiquent que le CPA ne provoque pas d’irritation vasculaire chez les lapins néo-zélandais.

Dans l’expérience d’hypersensibilité systémique active chez les cobayes, la CPA a été utilisée pour sensibiliser les animaux avec des injections intrapéritonéales de 1,25 mL/kg et 2,5 mL/kg 3x et des injections intraveineuses de 2,5 mL/kg et 5 mL/kg pour l’excitation. Aucune hypersensibilité rapide n’a été observée chez les cobayes jusqu’à 21 jours après la dernière sensibilisation, ce qui indique que l’APC ne provoque pas d’anaphylaxie rapide chez les cobayes (tableau 2).

La toxicité systémique aiguë a été évaluée chez des souris ICR. Cinq souris expérimentales et cinq souris témoins ont reçu une injection de CPA et de solution saline normale à une dose de 50 mL/kg de poids corporel. Les réactions du groupe expérimental n’étaient pas plus importantes que celles du groupe témoin. Aucune convulsion n’a été observée dans les deux groupes, et aucun autre symptôme anormal n’a été observé. De plus, il n’y a pas eu de perte de poids significative dans les deux groupes. Ces résultats suggèrent que les CPA ne présentent pas de toxicité systémique aiguë pour les souris ICR (tableau 3 et tableau 4).

Évaluation de l’auto-transplantation de PBHSC préservés avec CPA
Pour évaluer l’efficacité de la transplantation de PBHSC préservés avec CPA pour le traitement des maladies du sang, six patients ont été recrutés, et des PBHSC préservés avec CPA ont été transplantés chez cinq patients. La transplantation a été couronnée de succès chez tous les patients sauf un, qui ont reçu une autre allogreffe en raison de la récurrence de la maladie. Le nombre de neutrophiles ≥ 0,5 x 109 cellules/L et le nombre de plaquettes ≥ 20 x 109 cellules/L ont été utilisés comme marqueurs de la réussite de la transplantation.

Les échantillons b, c et e ont été transplantés chez les patients atteints de lymphome correspondants, et le cycle de reconstruction fonctionnelle a duré respectivement 9 jours, 9 jours et 10 jours. Les échantillons a et f ont été transplantés chez des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë, et le cycle de reconstruction fonctionnelle était de 36 jours et 16 jours, respectivement. Le patient a reçu un autre traitement en raison de la récurrence de la maladie. Si l’on exclut les données relatives à la reconstitution hématopoïétique et immunitaire perturbée par l’infection au cycle de 36 jours, le délai moyen avant la transplantation réussie dans cinq cas était de 11 jours, le nombre de neutrophiles et de plaquettes répondant aux normes requises. Cette durée est plus courte que le cycle de reconstitution hématopoïétique de 12,5 jours rapporté dans la littérature précédente19. Dans notre étude, sous des périodes de reconstitution similaires, la concentration finale de DMSO dans la formulation du CPA n’était que de 2 %, nettement inférieure à la concentration de 3,5 % généralement citée à20. Plus important encore, aucun effet indésirable n’a été observé chez les patients, ce qui confirme l’innocuité et l’efficacité de notre méthode de préservation des cellules souches hématopoïétiques dans les applications cliniques (tableau 5).

L’analyse des sous-populations de PBHSC a révélé que la sous-population cellulaire de progéniteurs lymphoïdes communs (CLP) et de progéniteurs mégacaryocytaires/érythrocytaires (MEP) dans les PBHSC préservés avec CPA était plus élevée que celle du régime traditionnel. Cependant, la sous-population cellulaire de progéniteurs de granulocytes/macrophages (GMP) n’était pas significativement différente. Ces résultats peuvent expliquer la reconstitution hématopoïétique et immunitaire plus rapide observée chez les patients traités (Figure 8A-C).

figure-results-1
Figure 1 : Modèles de hiérarchie hématopoïétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Viabilité cellulaire des PBHSC (A) La viabilité des PBHSC préservées par la méthode en une étape avec CPA était de 91,29 % (ET = 1,86), et celles préservées par la méthode de l’azote liquide étaient de 90,07 % (ET = 1,64), p > 0,05 par rapport à la méthode de cryoconservation en une étape et à la méthode de cryoconservation à l’azote liquide. (B) Le taux de récupération des PBHSC stockés avec CPA était de 89,38 % (n = 6, ET = 1,87), ce qui était significativement plus élevé que le taux de récupération de 79,55 % des PBHSC stockés avec TCPA (n = 6, ET = 3,16), tel que mesuré par la détection AO/PI. (C) La viabilité de récupération des PBHSC préservées avec CPA était de 88,20 % (n = 6, ET = 2,72), ce qui était significativement plus élevé que la viabilité de récupération de 73,05 % des PBHSC préservés avec TCPA (n = 6, ET = 7,47), telle que mesurée par la détection de l’Annexine V/PI après récupération. P<0.01 (test T) en ce qui concerne CPA et TCPA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Analyse structurelle des PBHSC préservées par CPA et TCPA. (A) Structure microfilamentaire des PBHSC, y compris le groupe de cellules fraîches, le groupe CPA, le groupe TCPA et le groupe témoin positif, telle que visualisée par le peptide cyclique Alexa Fluor 488 fluorescent marqué au colorant fantôme. (B) Structure microtubule des PBHSC, y compris le groupe de cellules fraîches, le groupe CPA, le groupe TCPA et le groupe témoin positif, telle que visualisée par des analogues de Taxol marqués par des groupes fluorescents infrarouges lointains. (C) L’activité mitochondriale des PBHSC marquées à la rhodamine 123 (y compris le groupe de cellules fraîches, le groupe CPA, le groupe TCPA et le groupe témoin positif) a été détectée par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Analyse fonctionnelle des PBHSC préservées par CPA et TCPA. Activité mitochondriale des PBHSC, y compris le groupe de cellules fraîches, le groupe CPA, le groupe TCPA et le groupe témoin positif, détectée par cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Test de potentiel de formation de colonies. Potentiel de formation de colonies des PBHSC préservés avec CPA, TCPA, y compris CFU-E, BFU-E, CFU-GM et CFU-GEMM, par rapport aux PBHSC fraîches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Nombre total de colonies. Le nombre total de colonies dans le groupe des cellules fraîches était de 70,33 (n = 6, ET = 14,02), le nombre total de colonies dans le groupe CPA était de 65,33 (n = 6, ET = 8,07) et le nombre total de colonies dans le groupe TCPA était de 46,17 (n = 6, ET = 8,50). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 7 : Évaluation de l’innocuité de la CPA par des tests sur des animaux. Des images représentatives prises à une résolution de 10x sont présentées en A1-B2. (A, B) Évaluation de l’irritation vasculaire de l’APC chez le lapin néo-zélandais. A1 et B1 étaient les diagrammes de coupe de tissus pathologiques du groupe témoin négatif préparés respectivement 72 h et 14 jours après la dernière administration. A2 et B2 étaient les schémas de coupe des tissus pathologiques du groupe CPA préparés respectivement 72 h et 14 jours après la dernière administration. (C) Surveillance in vitro de l’hémolyse érythrocytaire du lapin. Les tubes étiquetés a-e représentaient le groupe CPA, les tubes étiquetés f étaient le groupe témoin négatif et les tubes étiquetés g étaient le groupe témoin positif. Aucune hémolyse n’est survenue dans le groupe CPA et le groupe témoin négatif, tandis que l’hémolyse s’est produite dans le groupe témoin positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-8
Figure 8 : Analyse des sous-populations de PBHSC. (A) CLP, (B) MEP, et (C) de 6 patients préservés avec CPA et TCPA. (A) Les ratios CLP moyens pour CPA et TCPA étaient de 16,38 % (n = 6, ET = 13,53) et 8,97 % (n = 6, ET = 7,88), la sous-population de CLP dans les PBHSC figées dans la CPA était plus élevée que celle dans les TCPA. p > 0,05 (test T) en ce qui concerne CPA et TCPA. (B) Les ratios moyens des PEM pour la CPA et la TCPA étaient de 61,07 % (n = 6, ET = 12,85) et de 55,4 % (n = 6, ET = 11,37), la sous-population de PEM dans les PBHSC figées dans la CPA était plus élevée que celle dans la TCPA. p > 0,05 (test T) en ce qui concerne CPA et TCPA. (C) Les ratios moyens de BPF pour la CPA et la TCPA étaient de 62,68 % (n = 6, ET = 8,20) et de 64,70 % (n = 6, ET = 11,66), la sous-population de BPF dans les PBHSC congelées dans la CPA était plus élevée que celle dans la TCPA. p > 0,05 (test T) en ce qui concerne CPA et TCPA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composantes de CPARapport de concentrationComposants de TCPARapport de concentration
Diméthylsulfoxyde4 % (v/v)Diméthylsulfoxyde10 % (v/v)
Albumine humaine5 % (h/v)Albumine humaine5 % (h/v)
Glucose2 % (m/v)--
Dextran 402 % (m/v)--
Glycérophosphate de sodium0,5 % (m/v)--

Tableau 1 : Composants et rapport de concentration du CPA et du TCPA.

GroupeNuméro d’animalNombre d’animaux présentant différents degrés d’hypersensibilité
NégatifFaiblement positifPositifFort positifExtrêmement fort positif
Contrôle négatif880000
Contrôle positif800053
CPA faible dosage880000
CPA dosage élevé880000

Tableau 2 : Réactions d’hypersensibilité chez les cobayes après un traitement par APC. Le groupe témoin négatif, le groupe à faible dose de CPA et le groupe à forte dose de CPA ont tous montré des réactions d’hypersensibilité négatives. En revanche, tous les cobayes du groupe témoin positif ont présenté de fortes réactions d’hypersensibilité positives, avec trois cobayes présentant une anaphylaxie.

GroupeNumérotationPosologie d’administration (mL)Poids (g)
0 h24 h48 h72 h
Contrôle négatif11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Groupe expérimental21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tableau 3 : Résumé du poids de la souris dans l’expérience de toxicité aiguë. Le groupe témoin négatif et le groupe expérimental n’ont pas montré de perte de poids significative après l’administration du médicament. Le poids de tous les animaux de laboratoire a augmenté graduellement dans une fourchette raisonnable après l’alimentation conventionnelle pendant 24 h, 48 h et 72 h après l’administration.

GroupeNumérotationPosologie d’administration (mL)Temps d’observation
4 h24 h48 h72 h
Contrôle négatif11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Groupe expérimental21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tableau 4 : Observation de la toxicité systémique aiguë chez la souris. Dans le tableau, - signifie qu’il n’y a pas de réactions de toxicité systémique aiguë. Le groupe témoin négatif et le groupe expérimental n’ont pas montré de réactions de toxicité systémique aiguë après l’administration pendant 4 h, 24 h, 48 h et 72 h après l’administration.

Caractéristiques du patientNotre rechercheRapporté dans la littérature
N652
Âge53 (35-61)55 (21-66)
MM024
HL223
LMA20
CGHL/LNH10
PMBL/LNH10
Autre type de maladie05
Basé sur la radiothérapie234
À base de chimiothérapie318
Non. cellules CD34+ transplantées (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
CNA >0,5×109 /L de récupération (jour médian, plage, les données anormales ont été exclues)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L de récupération (jour médian, plage, les données anormales ont été exclues)11 (9-16)12.5 (0-19)
Nausée015
Vomissement04
Vertiges01
Toute complication020

Tableau 5 : Statistiques sur les données HSCT. Caractéristiques du patient et récupération hématopoïétique après ASCT.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons évalué un nouveau CPA pour la cryoconservation des PBHSC. Les résultats démontrent que la CPA améliore la viabilité préservée des PBHSC par rapport à la TCPA. Plus précisément, la viabilité de récupération des PBHSC préservées avec CPA a dépassé celle de la TCPA de plus de 10 %. Dans les cellules souches, l’intégrité du cytosquelette est la condition de base pour le maintien de l’activité et de la fonction de différenciation des cellules souches35,36. Au niveau cellulaire, nous avons observé que les structures des microfilaments et des microtubules dans les PBHSC préservées avec CPA étaient plus intactes que dans le groupe TCPA, avec des structures de microtubules nettement plus claires. Les mitochondries sont l’usine d’énergie des cellules. Les mitochondries sont directement impliquées dans la respiration cellulaire, le métabolisme et d’autres activités de la vie, qui sont des organites essentiels au maintien de l’activité cellulaire37. L’activité mitochondriale est un indicateur crucial de la fonction des cellules souches hématopoïétiques après cryoconservation et récupération. En termes d’activité mitochondriale, le groupe CPA présentait des similitudes avec les PBHSC fraîches. L’observation directe des complexes mitochondriaux a révélé que leur nombre dans le groupe CPA surpassait celui du groupe TCPA. De plus, la cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer quantitativement l’activité mitochondriale préservée dans chaque groupe. Les résultats n’ont montré aucune différence significative entre les groupes CPA et cellules fraîches, mais l’activité était 8,5 % plus élevée dans le groupe CPA par rapport au groupe TCPA. Cette comparaison des données d’activité mitochondriale corrobore les résultats de viabilité de la récupération cellulaire. De plus, les essais de formation de colonies ont indiqué que les PBHSC préservées avec CPA conservaient leur potentiel de différenciation. Le groupe CPA a montré un nombre plus élevé de colonies après l’induction, ce qui confirme l’efficacité supérieure de la conservation de la CPA.

Le but de cette étude était d’appliquer la CPA à la GCSH clinique afin d’améliorer l’activité des PBHSC après conservation et d’assurer le taux de réussite de la transplantation. Avant d’appliquer l’APC aux essais cliniques, des évaluations de l’innocuité ont été effectuées sur des animaux de laboratoire, fournissant des données à l’appui de l’innocuité de l’APC dans l’application clinique. Des études antérieures ont montré que certains nouveaux CPA ont été identifiés comme la meilleure technologie de cryoconservation pour les cellules endothéliales (MHECT-5) et les embryons38,39. Dans l’application clinique d’un CPA pour la préservation des PBHSC, nous avons cryoconservé avec succès des PBHSC de six patients pour une GCSH. Notamment, la méthode de cryoconservation en une étape utilisant le CPA a considérablement rationalisé le processus de conservation des échantillons. Cette méthode, comparée aux techniques de cryoconservation en une étape précédemment rapportées pour les cellules souches hématopoïétiques, utilisait une concentration plus faible de DMSO, ce qui constitue une avancée significative pour les applications cliniques. Sur les six patients, cinq ont subi une transplantation avec succès. Le reste du patient a reçu un traitement alternatif en raison de la récurrence de la maladie. Nous avons réalisé une évaluation statistique du cycle de reconstruction fonctionnelle des cinq patients ayant terminé la transplantation. À l’exception d’un cas où le cycle de reconstruction a été prolongé en raison d’une infection, le temps moyen de reconstitution des fonctions hématopoïétiques et immunitaires était de 11 jours, ce qui est plus rapide que les 12,5 jours cités dans la littérature précédente. Surtout, aucune toxicité n’a été observée pendant le processus de transplantation. Ce résultat est particulièrement remarquable si l’on considère que la concentration finale de DMSO dans la méthode CPA n’était que de 2 %, par rapport à la concentration de 10 % (v/v) utilisée dans la méthode TCPA. Cette utilisation réussie d’une concentration plus faible de DMSO dans le CPA pour minimiser les effets secondaires valide notre stratégie et est vitale pour l’efficacité clinique.

À la lumière de la reconstitution fonctionnelle accélérée observée dans notre étude, nous avons étudié plus en détail les différences potentielles dans le nombre de cellules CD34+ transfusées. L’analyse statistique a révélé que le nombre de cellules CD34+ transfusées était, en moyenne, de 2,4 x 106 cellules/kg, ce qui est inférieur aux chiffres rapportés dans la littérature précédente40. Cela nous a amenés à émettre l’hypothèse que l’APC pourrait offrir une protection supérieure à des sous-populations spécifiques au sein des PBHSC qui sont cruciales pour la reconstitution hématopoïétique et immunitaire. Pour explorer cette hypothèse, nous avons effectué une analyse détaillée des sous-populations de CLP, GMP et MEP dans les PBHSC préservés avec CPA et TCPA. Le résultat a montré que les sous-populations de CLP et de MEP dans les PBHSC préservées avec CPA augmentaient par rapport à celles préservées avec TCPA, alors qu’il n’y avait pas de différence significative dans la sous-population de GMP. La CLP peut se différencier en cellules T, cellules B et cellules NK dans le corps humain ; une dose accrue de CLP peut accélérer la reconstitution immunitaire33. La MEP peut se différencier en érythrocytes et en plaquettes41. Le glycérophosphate de sodium dans l’APC améliore la synthèse mitochondriale de l’ATP par le biais de la navette de glycérophosphate, ce qui permet de remédier aux déficits énergétiques causés par la cryoconservation. Ceci est essentiel pour les cellules CLP, qui dépendent de la glycolyse pour la différenciation lymphoïde42. De plus, l’écart-type élevé de la viabilité de la TCPA était supérieur à celui de la CPA (7,47 contre 2,72, figure 3), ce qui indique la variabilité des résultats de la TCPA, qui pourrait être due à des conditions de congélation instables. Par conséquent, nous proposons que la préservation améliorée de la CLP et de la MEP puisse être un facteur critique dans la réduction du temps de récupération de la fonction hématopoïétique et immunitaire. Les effets protecteurs supérieurs du CPA sur les sous-groupes CLP et MEP semblent faciliter une reconstruction fonctionnelle plus rapide pendant les thérapies transfusionnelles cliniques. Cela améliore non seulement les résultats thérapeutiques, mais réduit également la durée et le coût du traitement pour les patients subissant une transplantation. Essentiellement, notre méthode offre une approche plus économique pour la GCSH, optimisant à la fois les aspects cliniques et économiques des soins aux patients.

Malgré les efforts de recherche en cours pour identifier des substances qui pourraient remplacer le DMSO, la recherche d’alternatives reste difficile. Bien qu’il y ait eu des rapports sur l’émergence de nouvelles technologies et substances dans ce domaine43,44, il n’existe toujours pas de démonstrations rigoureuses de l’innocuité in vitro de ces nouveaux composés. De même, il n’y a pas suffisamment de preuves pour confirmer leur innocuité et leur efficacité pour une utilisation clinique, en particulier en ce qui concerne l’étude des impuretés. Par conséquent, ces substances émergentes nécessitent une validation approfondie avant de pouvoir être appliquées en milieu clinique. Dans ce contexte, nous pensons que l’optimisation de l’utilisation du DMSO, tout en assurant une préservation efficace des cellules, continue d’être la stratégie la plus viable pour les applications cliniques. Des études antérieures ont mis en évidence le rôle de la navette de glycérophosphate dans la production d’ATP et la régulation de l’activité mitochondriale au sein des cellules45,46. Sur la base de cette compréhension, nous proposons que l’incorporation de glycérophosphate de sodium dans le CPA pourrait constituer une stratégie efficace pour remplacer une partie importante du DMSO traditionnellement utilisé dans le TCPA en tant qu’agent de protection osmotique. Il n’y a aucune mention de recherches récentes sur des solutions de remplacement à faible teneur en diméthylsulfoxyde, ce qui suggère une certaine nouveauté dans cette méthode.

Dans l’ensemble, les étapes pivots de notre protocole de cryoconservation comprennent : (i) un contrôle précis de la concentration de DMSO à 2 % (v/v), (ii) une vitesse de refroidissement contrôlée de -1 °C/min, et (iii) une décongélation rapide dans un bain-marie à 37 °C. Ces étapes garantissent un stress osmotique minimal et la formation de cristaux de glace. Notamment, la réduction de la concentration de DMSO répond directement aux problèmes de cytotoxicité associés aux solutions traditionnelles de DMSO à 10 %47. Le refroidissement contrôlé empêche les dommages à la glace intracellulaire, comme l’a validé la cryoconservation de cellules souches mésenchymateuses48, tandis que la décongélation rapide préserve la fonction mitochondriale, un facteur critique pour la viabilité post-dégel49. Nous avons optimisé trois aspects : (i) Méthode de mélange : Les premiers essais ont révélé une agrégation cellulaire lors de l’ajout de CPA ; Le passage au mélange goutte à goutte avec vortex à 500 tr/min a éliminé l’agglutination. (ii) Protocole de coloration : Les cellules de prélavage avec du PBS contenant 0,05 % de Tween-20 ont amélioré l’efficacité de pénétration des anticorps de 18 %. (iii) Consistance de la décongélation : La mise en œuvre d’une fenêtre de décongélation normalisée de 120 s a permis d’éviter la variabilité des taux de récupération (± 2 % contre ± 7 % dans les études pilotes). Pour des problèmes courants tels que le faible nombre de colonies, l’augmentation du volume moyen de MethoCult à 2 ml/boîte et le contrôle de l’humidité (>95 %) ont résolu ce problème, en s’alignant sur les normes de culture de progéniteurs hématopoïétiques50. Deux limites méritent qu’on s’y attarde : (i) Biais de sous-population : Bien que l’APC préserve efficacement les sous-ensembles CLP et MEP, de rares populations comme les CSH à long terme CD34+CD38-CD90+ présentent un taux de récupération inférieur de 12 % par rapport aux témoins frais (p = 0,03). (ii) Pour l’évaluation de l’intégrité du cytosquelette, qui est basée sur des images qualitatives, certaines mesures quantitatives (par exemple, l’intensité de la fluorescence, les scores structurels) devraient être incorporées dans des analyses plus fiables. Notre méthode CPA fait progresser les pratiques actuelles grâce à : (i) Amélioration de la sécurité : les taux d’hémolyse sont passés de 8,2 % (TCPA) à 1,5 % (CPA) 24 h après la décongélation (p < 0,001). (ii) Supériorité fonctionnelle : les cellules préservées par CPA ont montré une formation de colonies CFU-GEMM 23 % plus élevée que la TCPA, essentielle pour la greffe multilignée51. (iii) Efficacité clinique : Le succès de la greffe avec 2,4 x 106 cellules CD34+/kg (par rapport à la norme ≥ 4 x 106) suggère une puissance accrue. Cette technologie est prometteuse pour : (i) Stockage des CSH génétiquement modifiées : la protection mitochondriale du CPA peut stabiliser les cellules modifiées par CRISPR pendant la cryoconservation52. (ii) Banque d’organoïdes : Les données préliminaires montrent une viabilité de 89 % pour les organoïdes intestinaux conservés par CPA contre 54 % pour le TCPA (n = 3). iii) Réseaux de distribution mondiaux : une teneur plus faible en DMSO permet des essais de transport à température ambiante avec des matériaux à changement de phase53.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par le projet de soutien financier à la construction d’une discipline médicale clé du district de Nanshan, le projet majeur de science et de technologie du système de santé du district de Shenzhen Nanshan (No. NSZD2023018) et le Laboratoire clé de transformation médicale de la technologie nucléaire du NHC (Hôpital central de Mianyang ; Subvention n°2023HYX033).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de culture cellulaire de 35 mmLABSELECT12111
Orange Acridine/Iodure PROPIDIUMCountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488  ;BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Cytomètre d’image automatique de paillasseCountstarRigel-S2
Solution de préservation des cellules XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Microscope confocal à balayage laserZeissLSM880
Cytochalasine BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
Kit de coloration DAPIBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Cytomètreen flux BDFACSLSRFortessa
Glycerol  ;  ; AMRESCO854
Albumine humaineSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Peroxyde d’hydrogèneSigma-AldrichH1009
Tampon de lavage immunocolorantBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Microscope inverséNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Saline physiologiqueBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Iodure de propidiumBDBDB556463
Rhodamine 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle Incubateur CO2Thermo Fisher Scientific371
Vortex MixerNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cellules souches du sang p riph riquecryoconservation des cellules souchestransplantation autologue de cellules souchesessai de viabilit cellulaireactivit mitochondrialeessai de formation de coloniesint grit cytosquelettiquecong lation l azote liquidetoxicit du dim thylsulfoxyde
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes