Article de méthode

Mutagénèse semi-aléatoire induite par la lumière bleue sur de l’ADN exogène spécifique dans la souche BL21 d’Escherichia coli

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DOI :

10.3791/68283

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20 juin 2025

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit décrit des méthodes simplifiées pour reconnaître tout ADN exogène tout en générant des mutations uniquement sur ces ADN exogènes chez Escherichia coli.

Résumé

Les technologies de mutagénèse ont été largement utilisées dans la sélection de variations, l’évolution dirigée et l’ingénierie des protéines. Cependant, la plupart des méthodes ne peuvent induire que des mutations aléatoires de l’ADN génomique qui sont incontrôlables, entraînant des déformations ou même des effets mortels. Ici, en tirant parti de la fusion de trois systèmes : l’éditeur de base de cytosine (CBE), les éléments p-Mag/n-Mag inductibles par la lumière bleue et l’ARN polymérase T7 divisée, cette méthode décrite intègre un système de mutagenèse semi-aléatoire contrôlable par la lumière bleue, spécifique à la région de l’ADN.

Ce système peut muter la cytosine en thymine sur les ADN à partir du promoteur T7 et se terminant par le terminateur T7. Tout gène exogène en aval du promoteur T7 peut être potentiellement muté. Ces outils ont également été conçus en deux parties pour rendre le système contrôlable par la lumière bleue. La première partie a été créée en fusionnant l’EBC avec n-Mag et le gène de l’ARN polymérase N-terminal-T7. La deuxième partie a consisté à fusionner p-Mag avec l’ARN polymérase C-terminal-T7. Sous lumière bleue, ces deux parties ont été assemblées pour fonctionner comme un générateur de mutations sur les ADN entre le promoteur T7 et le terminateur T7. Sans lumière bleue, p-Mag est détaché de n-Mag, libérant le CBE de l’édition de l’ADN.

L’objectif de ce protocole est de générer des mutations aléatoires spécifiques à une région chez Escherichia coli avec un contrôle par la lumière bleue et de valider davantage les plasmides mutés. Le système peut être adapté à un système d’évolution in vivo où la fonction du gène d’intérêt peut être sélectionnée et les mutations souhaitées peuvent être collectées pour une étude plus approfondie.

Introduction

La mutation aléatoire et la sélection naturelle sont les principales forces de l’évolution, qui a généré une grande variation génétique entre les espèces. Le processus évolutif a été utilisé comme un outil puissant pour concevoir des protéines aux fonctions optimisées ou nouvelles1. Les taux de mutation naturelle de la réplication de l’ADN ont été estimés à environ une base sur 109 par division cellulaire chez plusieurs procaryotes et eucaryotes2. Les faibles taux de mutation naturelle rendent impossible la génération d’une grande diversité génétique dans les laboratoires. Les études se sont concentrées sur le développement de méthodes qui augmentent les taux de mutation pour couvrir autant de sites que possible dans un gène donné dans un délai raisonnable.

De multiples systèmes ont été développés pour obtenir des taux de mutation plus élevés dans les études d’évolution en laboratoire 3,4,5,6,7,8,9,10. Les systèmes d’évolution in vitro exploitent la PCR sujette aux erreurs, la mutagenèse par saturation dirigée ou la conception de banques computationnelles pour introduire des mutations dans les gènes d’intérêt1. Les banques d’ADN sont transformées en cellules hôtes où les produits protéiques sont criblés ou sélectionnés. Les étapes de mutagenèse et de sélection dans l’évolution in vitro ne sont pas couplées, ce qui limite l’efficacité et l’échelle des populations qui peuvent être générées11. Les systèmes d’évolution in vivo ont surmonté les limites en introduisant des systèmes de mutation dans les cellules et en couplant les étapes de mutagenèse et de sélection pour permettre une évolution continue. Auparavant, les méthodes de mutagénèse in vivo utilisaient des mutagènes chimiques 3,4 et des souches mutagènes 5,6. Cependant, ces méthodes souffrent de faibles taux de mutation, d’un manque de contrôle et d’un spectre mutationnel étroit ou inégal12. Des études récentes ont mis au point de nouveaux systèmes d’évolution in vivo améliorés, représentés par OrthoRep, un système de réplication de l’ADN sujet aux erreurs orthogonales 7,8 ; MutaT7, une fusion de la cytidine désaminase à l’ARN polyméraseT7 9 ; et EvolvR, une fusion de la nickase Cas9 et de l’ADN polymérase10 sujette aux erreurs. Ces méthodes ont des cellules hôtes, un contexte cible et une facilité de mise en œuvre différents.

L’ARN polymérase T7 (T7 RNAP), un composant clé du système MutaT7, a été largement étudiée et modifiée dans le domaine de la biologie synthétique. Des fragments de RNAP T7 ont été co-exprimés à différents niveaux et à différents moments pour construire un allocateur de ressources13. Un RNAP T7 divisé avec des fragments C-terminaux de spécificité de promoteur différente a été construit pour créer la porte logique AND14. La capacité des fragments de RNAP T7 à s’assembler pour reconstituer une polymérase fonctionnelle a conduit au développement de biocapteurs activés par la lumière et les petites molécules, où la dimérisation des partenaires d’interaction fusionnés à chacun des terminaux N et C de l’ARNP T7 génère une sortie transcriptionnelle15. Le RNAP T7 divisé a également été fusionné avec les domaines n-Mag et p-Mag pour construire un contrôle de l’expression génique inductible par la lumière chez Escherichia coli16. Lors de l’activation de la lumière bleue, les domaines magnétiques se dimérisent, rapprochant spatialement deux domaines de l’ARNP T7 divisé pour effectuer la fonction de polymérase. Ce système permet un contrôle spatio-temporel précis de l’expression des gènes avec une faible expression basale et une large plage dynamique.

Cet article présente un protocole pour construire un système de mutagenèse semi-aléatoire contrôlable par la lumière bleue, in vivo (Figure 1). Il est construit sur la désaminase rAPOBEC1 fusionnée à n-Mag-N-T7 RNAP. La co-expression de p-Mag-C-T7 RNAP à partir du même plasmide permet le contrôle par la lumière bleue de la polymérase et les activités d’édition de base. Le système combine la capacité d’édition de base de rAPOBEC1 avec le RNAP divisé T7 contrôlé par la lumière. Il a été validé chez E. coli en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) comme gène cible où son intensité est sélectionnée par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Par rapport au système MutaT7 original, notre système contrôlé par la lumière bleue introduit des mutations semi-aléatoires dans le gène cible en modulant l’intervalle de lumière. Au lieu de convertir toutes les cytosines en bases d’uracile dans le gène cible, il génère un profil de mutation plus large en modifiant un sous-ensemble de nucléotides par contrôle de la lumière. Le système peut être facilement adapté à un système d’évolution in vivo où la GFP peut être remplacée par d’autres gènes d’intérêt et la fonction peut être sélectionnée par la valeur adaptative ou la survie des cellules.

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Protocole

Le protocole suivant décrit comment effectuer la conception de mutagénèse de l’ADN exogène à l’aide du système de mutagenèse par polymérase CBE-Mag-T7 (étape 1). Une fois le plasmide d’ADN exogène construit, les étapes de transformation des deux plasmides sont décrites pour exprimer la mutagenèse par polymérase CBE-Mag-T7 dans la souche BL21 d’E . coli en ajoutant de l’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et suivie d’une irradiation à la lumière bleue pour initier la mutagenèse (étapes 2-9.2). Les étapes de contrôle de la qualité permettant d’évaluer le nombre de mutations générées sur la GFP ou l’ADN exogène ont été réalisées à l’aide du séquençage de Sanger (étapes 9.3-11.2).

1. Concevoir de l’ADN exogène et construire le système de mutagenèse par polymérase CBE-Mag-T7

  1. Trouvez l’ADN exogène ou le séquençage de l’ADNc à l’aide d’outils en ligne (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ou https://www.uniprot.org/).
    REMARQUE : Ici, nous avons utilisé la séquence GFP comme ADN exogène pour la mutagenèse de la cytosine.
  2. Remplacez l’ADN gfp par l’ADN d’intérêt à l’aide d’un kit de clonage approprié.
    REMARQUE : Nous utilisons NheI pour supprimer l’ADN gfp dans le plasmide d’origine dans le kit d’assemblage de colonie d’ADN. Une alternative est de travailler avec des entreprises pour la synthèse de l’ADN. Voir le fichier supplémentaire 1 pour la séquence plasmidique.
  3. Synthétisez tous les gènes avec le système de mutagenèse par polymérase CBE-Mag-T7 et incorporez-les dans le squelette pET-11a résistant à l’ampicilline.
    REMARQUE : Nous avons travaillé avec une société de synthèse d’ADN pour construire ce plasmide, et nous avons obtenu des bactéries souches de glycérol contenant notre plasmide cible.

2. Activation de la souche bactérienne

  1. Pipeter 10 μL de bactéries mères de glycérol sur le bord d’une plaque de gélose LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Étalez les bactéries de cet endroit sur la plaque à l’aide d’une boucle stérile.
  2. Incuber la plaque à l’envers à 37 °C pendant la nuit dans un incubateur bactérien.

3. Amplification plasmidique

  1. Prélever une seule colonie dans la plaque et l’inoculer dans un tube conique de 50 mL avec 15 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline.
  2. Placez la culture dans un incubateur à agitation à 37 °C, 180 tr/min pendant 14-16 h.

4. Extraction plasmidique

  1. Prenez 5 à 15 ml de la culture bactérienne de nuit et transférez-la dans un tube à centrifuger. Centrifugeuse à 18 894 × g pendant 1 min.
  2. Prélevez la pastille bactérienne et retirez soigneusement tout le surnageant. Remettre en suspension la pastille bactérienne dans 500 μL de tampon de remise en suspension par vortex ou pipetage.
  3. Ajoutez 500 μL de tampon de lyse dans le tube, mélangez doucement en inversant le tube 8-10x et laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 min pour lyser les cellules.
    REMARQUE : Confirmez la lyse complète en vous assurant qu’il ne reste aucun matériau floculant blanc visible.
  4. Ajouter 200 μL de tampon d’équilibrage à la colonne d’essorage placée dans un tube collecteur. Centrifuger à 18 894 × g pendant 2 min et jeter le flux. Remettez la colonne dans le tube de collecte.
  5. Ajoutez 500 μL de tampon de neutralisation au lysat bactérien, mélangez doucement en inversant le tube 8 à 10 fois jusqu’à ce qu’un précipité blanc apparaisse, et laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 min.
  6. Centrifuger à 18 894 × g pendant 5 min et transférer le surnageant dans une colonne de filtre. Centrifuger à 18 894 × g pendant 1 min pour filtrer la solution.
  7. Ajouter 0,3 fois le volume d’isopropanol à la solution filtrée, mélanger en inversant. Transférez le mélange dans la colonne d’essorage équilibrée.
  8. Centrifugez à 18 894 × g pendant 1 min, jetez le flux continu et remettez la colonne dans le tube de collecte.
  9. Lavez la colonne avec 750 μL de tampon de lavage, centrifugez à 18 894 × g pendant 1 min et jetez le flux.
  10. Centrifugez à nouveau la colonne à 18 894 × g pendant 1 min pour éliminer le tampon de lavage résiduel.
  11. Placez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de centrifugation. Ajouter 100 à 200 μL de tampon d’élution au centre de la membrane de la colonne. Laisser reposer à température ambiante pendant 2 à 5 minutes et centrifuger à 18 894 × g pendant 2 min. Stockez l’ADN plasmidique à -20 °C.

5. Transformation plasmidique (cellules chimiquement compétentes d’E. coli BL21)

  1. Prenez 50 μL de cellules BL21 chimiquement compétentes décongelées sur de la glace. Ajoutez 2 μL d’ADN plasmidique de l’étape 4.11 et mélangez délicatement. Incuber sur glace pendant 30 min.
  2. Choc thermique à 42 °C pendant 45 s, puis transfert immédiat du tube dans la glace pendant 2 min.
  3. Ajouter 500 μL de milieu LB stérile dans chaque tube. Incuber à 37 °C, 180 tr/min pendant 1 h pour permettre la récupération.
  4. Centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min, jeter l’excès de surnageant, en laissant environ 100 μL. Remettre les cellules en suspension et la plaque sur une gélose LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber à l’envers à 37 °C pendant la nuit.

6. Expression du générateur de mutation de la polymérase CBE-Mag-T7 (forme inactive)

  1. Suivez les étapes 5.1 à 5.4. Avant d’étaler les cellules, appliquez uniformément 1 mM d’IPTG à la surface de la gélose LB avec de l’ampicilline. Utilisez de l’eau désionisée comme témoin pour comparer avec les groupes traités IPTG.
  2. Une fois que toutes les colonies sont cultivées, prélevez 10 à 20 colonies à cultiver dans 5 mL de milieu LB contenant 1 mM d’IPTG dans des tubes de verre à fond rond de 100 mL avec bouchon à vis phénolique et revêtement en caoutchouc à 16 °C, 180 tr/min pendant 8 h.
    REMARQUE : Toutes les colonies peuvent être entreposées à 4 °C pour un entreposage à court terme avant de passer à l’étape 7.

7. Activer le générateur de mutations de la polymérase CBE-Mag-T7

  1. Prélever les bactéries dans des tubes en verre à fond rond de 100 mL munis d’un bouchon à vis phénolique et d’un revêtement en caoutchouc, puis centrifuger à 18 894 × g pendant 2 min.
  2. Changez le support en support LB sans aucun IPTG.
    REMARQUE : Cette étape est importante pour s’assurer que le générateur de mutation de la polymérase CBE-Mag-T7 ne peut pas s’éditer lui-même. Nous avons conçu le système lacI/O pour protéger les groupes de gènes de la polymérase CBE-Mag-T7.
  3. Irradier la plaque avec un irradiateur à lumière bleue (470 nm, 4 mW/cm2) pendant la culture à 37 °C pendant la durée prédéterminée. Effectuez un séquençage de Sanger pour vérifier les mutations et vérifier si une exposition plus longue augmente la fréquence des mutations.
    REMARQUE : Ici, nous réglons l’exposition à la lumière bleue pour 0, 8, 16 et 24 h.

8. Sélection de mutations pour l’augmentation de la fonction protéique et la poursuite de la mutagenèse

REMARQUE : Ici, nous utilisons le gène gfp comme ADN exogène pour la mutagenèse et recherchons des mutations qui peuvent augmenter l’intensité fluorescente de la protéine GFP.

  1. Prélever les colonies, étiqueter la position sur une assiette et inoculer les colonies collectées dans 100 μL de ddH2O.
  2. Transférez les 100 μL de suspension bactérienne dans une plaque à 96 puits et lisez l’intensité GFP à Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Répétez les étapes 6.3 à 9.2 jusqu’à ce que des colonies évidentes puissent être identifiées.

9. Arrêtez la mutagénèse et vérifiez les mutations

  1. Après avoir effectué plusieurs heures d’irradiation à la lumière bleue, ramenez toutes les bactéries dans un endroit sombre à 4 °C pendant 15 minutes supplémentaires.
  2. Suivez les mêmes étapes d’extraction de plasmide que celles décrites à l’étape 4.
  3. Concevez les amorces avant et arrière pour le séquençage de Sanger.
    REMARQUE : Ici, nous utilisons ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT comme amorce avant et TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG comme amorce inverse pour le séquençage de Sanger.

10. Analyse des données et calcul de la fréquence des mutations

  1. Visualisez la mutation en ouvrant le fichier .ab1 et vérifiez les pics manuellement.
  2. Analysez la fréquence des mutations à l’aide d’outils en ligne (par exemple, l’outil Mutation Surveyor).
  3. Téléchargez le fichier de données de Sanger sur l’outil en ligne et lancez l’analyse du taux de mutation.

11. Préparation du stock de glycérol bactérien

  1. Inoculer une seule colonie dans un tube contenant 5 mL de milieu LB avec 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber à 37 °C, 180 tr/min pendant 12-16 h.
  2. Mélangez la culture bactérienne avec 50 % de glycérol dans un rapport de 1:1. Aliquote dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. Conserver à -80 °C.

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Résultats

Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la création de mutations sur l’ADN exogène à l’aide d’un générateur de mutations d’ARN polymérase CBE-Mag-T7 divisé. Les gènes permettant de construire le système de mutation de l’ARN polymérase CBE-Mag-T7 et le gène cible de la mutagenèse sont tous incorporés dans le squelette plasmidique pET-11a. La transformation réussie et l’irradiation à la lumière bleue ont été effectuées sans aucun dommage à l’ADN génomique bactérien, comme le montrent des nombres de colonies norma...

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Discussion

L’outil d’édition de base guidé par polymérase a été créé pour la première fois par Cravens et al. en 2021, à l’aide d’une stratégie de fusion de protéines17. Les mutations sur quatre nucléotides d’ADN ont été incorporées avec succès à des taux supérieurs à 10-4 mutations par pb. Cependant, étant donné que des mutations ont été introduites de manière continue entre le promoteur T7 et le terminateur sans contrôle supplémentaire par les chercheurs

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à centrifuger coniques de 50 mlFauconCLS352070
AmpicillineProduits chimiques Thermo ScientificJ60977.14
Irradiateur à lumière bleueThorlabsLIU470A
Kit de clonage d’assemblage d’ADN  ;ONÉE5520S
Synthèse de l’ADN/PrmersBGI Génomique
EndoFree Plasmid Midi Kit  ;CWBIOCW2106STampon P1 : tampon de remise en suspension, Tampon P2 : tampon de lyse, Tampon E3 : tampon d’équilibration, Tampon PS : tampon de neutralisation, Tampon PW : tampon de lavage, Endo-Free Buffer EB : tampon de purification de l’ADN, RNase A Endo-Remover FM : tampon d’élimination des endotoxines, Colonnes de centrifugation DM avec tubes collecteurs
GlycérolFisher ChemicalG33-4
Agitateur incubéThermo ScientificSK2001CPKG
IPTG (isopropylthio-&beta ;-galactoside)Invitrogen15529019
Lecteur de microplaquesThermo ScientificVarioskan LUX
Microscope  ;LeicaDMI 4000B
Multiskan FCProduits chimiques Thermo Scientific
One Shot BL21(DE3) E. coli chimiquement compétentInvitrogenC600003
Kit de purification de plasmide Midi rapide à faible teneur en endotoxines PureLinkInvitrogenN° A36227
Pyrex  ; Tubes à centrifuger à fond rond robustes, avec bouchon à vis phénolique et revêtement en caoutchoucCorning  ; 8422CLS8422100

Références

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