Article de méthode

Outil réutilisable d’imagerie hépatique : un outil réutilisable imprimé en 3D pour la microscopie intravitale hépatique

DOI :

10.3791/68337

⸱

17 mars 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole introduit un outil d’imagerie hépatique réutilisable (RHIT) de pointe pour la microscopie intravitale (IVM) de souris vivantes, qui améliore la stabilité tissulaire pour des expériences rapides et aiguës. La conception imprimée en 3D du RHIT offre une production économique, une scalabilité et une polyvalence, permettant une observation prolongée des processus métaboliques chez des souris de différentes tailles.

Résumé

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La fonction et la dysfonction hépatique peuvent être évaluées en visualisant directement les processus dynamiques du foie à l’aide de la microscopie intravitale confocale (IVM). En particulier, une excellente précision spatiale et temporelle peut être atteinte dans l’extraction d’informations qualitatives et quantitatives. Sur le plan du microscope, maintenir les conditions physiologiques des tissus tout en atteignant stabilité et répétabilité reste un défi. L’augmentation du poids et la teneur en lipides hépatiques ont un effet néfaste sur ce processus chez les modèles animaux de diabète de type II (DT2) et de stéatose hépatique non alcoolique (MAFLD). Pour surmonter ces contraintes, nous avons créé le RHIT, un modèle révolutionnaire d’instrument d’imagerie qui améliore l’accès et la stabilité des tissus. Le RHIT est un dispositif d’imagerie hépatique réutilisable et évolutif, fabriqué par impression 3D dans une méthode efficace en une seule étape. Ses dimensions peuvent être modifiées pour s’adapter à des souris de différentes tailles. En résumé, le RHIT est un appareil imprimé en 3D destiné à positionner et stabiliser les animaux de laboratoire lors de la microscopie hépatique intravitale, utilisé après une brève préparation chirurgicale pour minimiser la manipulation, le stress et la variabilité. Sa conception réutilisable et standardisée est facilement produite et personnalisée, prenant en charge une gamme de tailles et de conceptions expérimentales potentielles. Les premiers résultats montrent une amélioration notable de la stabilité et de la fiabilité de l’imagerie intravitale hépatique, permettant une visualisation détaillée des structures sous-cellulaires, telles que les gouttelettes lipidiques. Cette précision améliorée facilite les études métaboliques et physiologiques avec une clarté, une reproductibilité accrues et un potentiel de plans longitudinaux. Le protocole propose une approche standardisée et accessible qui répond aux défis techniques de longue date de la MIV hépatique.

Introduction

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La microscopie intravitale est un outil puissant pour visualiser dynamiquement les processus biologiques in vivo 1,2,3, contrairement à l’histologie traditionnelle de l’immunofluorescence avec imagerie tissulaire fixe ou cellulaire vivante et analyse par cytométrie en flux des cellules isolées. Pour l’inspection hépatique, la FIV a été utilisée pour examiner la sécrétion et le fluxbiliaire 4,5, la mobilisation du glucose 6,7, les cellules non parenchymateuses 8,9,10 et les maladies hépatiques11,12. De plus, en ce qui concerne l’étude de l’accumulation lipidique, la MIV permet des informations en temps réel sur la dynamique de la formation, de la croissance et de la dégradation des gouttelettes lipidiques dans les tissus vivants, telles que la visualisation et la quantification des gouttelettes lipidiques à haute résolution spatiale, ainsi que la corrélation directe de l’accumulation de gouttelettes lipidiques avec d’autres processus cellulaires etphysiologiques 13. Malgré ces avantages, la FIV reste techniquement complexe : elle nécessite un équipement spécialisé et une expertise, peut causer des dommages tissulaires, modifier le comportement cellulaire et nécessiter des interventions invasives. Les études traditionnelles in vivoreposant sur l’observation comportementale, la surveillance physiologique et l’analyse génétique fournissent des informations précieuses mais manquent de la résolution spatiale et temporelle offerte par la microscopie intravitale.

Le premier grand défi de la MIV est de contrôler l’instabilité des artefacts causés par le battement de cœur et la respiration de l’animal inspecté, ce qui peut compromettre la qualité de l’image, entraînant des images obscurcies ou déformées des processus biologiquesobservés 15. Les tentatives de correction par traitement d’image aboutissent souvent à la perte d’informations spatiales et temporelles importantes ou à la nécessité d’équipements chirurgicaux avancés et d’un entretien16,17. Deuxièmement, les modèles murins pour les études sur les maladies du foie, tels que la MAFLD et la DT2, sont souvent obèses et donc plus difficiles à stabiliser en raison de leur taille accrue et de leur teneur en lipidestissulaires 16,18. Dans les modèles de souris obèses NAFLD et T2D, l’augmentation de la masse corporelle pose des défis mécaniques pour l’imagerie intravitale en dépassant la capacité de charge des étages de microscope standards et en compliquant la stabilisation animale19. Ce poids supplémentaire augmente le risque d’artefacts de mouvement et de compression tissulaire, qui nuisent tous deux à la précisiond’imagerie 20.

Simultanément, une teneur élevée en lipides hépatiques augmente l’opacité tissulaire et la diffusion de la lumière, ce qui dégrade la résolution et le contraste de l’image. Ces effets sont souvent aggravés par des comorbidités métaboliques telles que des perfusions et inflammations altérées, réduisant encore la distribution des colorants et la clartédu signal 21. Enfin, il peut être difficile et nuire à la répétabilité de maintenir une température corporelle stable tout au long de l’imagerie pour soutenir la physiologie tissulaire et les activités biologiques. De plus, une position stable du foie sur l’étage du microscope pendant la MIV est cruciale pour prévenir le stress mécanique ou les lésionstissulaires 7. L’exposition du tissu hépatique est une procédure délicate qui nécessite une précision technique pour éviter des saignements sévères et des dommages au parenchymahépatique 7. Pour réduire les artefacts de mouvement, la cage thoracique de la souris était auparavant soulevée de l’étage du microscope à l’aide de carton, permettant à la gravité de tirer le foie loin du reste ducorps 22. Bien que cette approche ait prouvé son efficacité pour produire des données quantifiables, le matériau en carton est insoutenable car il perd sa forme et est difficile à nettoyer. De plus, il est difficile de modifier les dimensions de l’insert en carton pour s’adapter aux modèles de souris obèses.

Ces dernières années, plusieurs techniques avancées de microscopie hépatique intravitale ont émergé, notamment la microscopie à champ lumineux à balayage et les systèmes optiques améliorés par ordinateur, qui ont démontré des améliorations de la résolutionspatio-temporelle 23, de la phototoxicitéréduite 24, d’une plus grande profondeur d’imagerie25,26 et de la suppression des artefactsde mouvement 27. Ces avancées, comme le démontrent des étudesrécentes 28, 29, 30, représentent un progrès technologique important dans ce domaine. Cet article présente l’Outil d’Imagerie Hépatique Réutilisable (RHIT), un outil innovant pour la MIV du foie murin. Le RHIT contribue à cet environnement en évolution en offrant un outil évolutif et réutilisable qui améliore la stabilité mécanique et l’accessibilité des tissus auprès de divers modèles animaux, y compris ceux atteints de maladies métaboliques. Sa conception répond aux défis persistants du mouvement, de la variabilité et de la complexité de l’installation en intégrant l’ajustement anatomique, la reproductibilité des étapes et la facilité d’utilisation. La compatibilité du RHIT avec les modalités d’imagerie conventionnelles et avancées élargit l’utilité de ces techniques émergentes, favorisant une imagerie hépatique intravitale fiable et physiologiquement stable.

Bien que diverses approches pour stabiliser le tissu pendant la FIV aient été proposées, telles qu’une fenêtre chirurgicale 9,31,32,33,34,35,36 et un stade 6,37 en acrylique assemblé sur mesure, ces méthodes introduisent également de nombreuses limitations et complexités en termes de scalabilité, de reproductibilité et de compétences chirurgicales. En comparaison, le RHIT est fonctionnellement distinct par son objectif et sa conception. Il ne repose pas sur la compression directe ni sur l’embedding à base degel 38. Au lieu de cela, le RHIT sert d’outil évolutif, réutilisable et anatomiquement contourné, qui soutient l’isolement du foie via le positionnement gravitationnel, maintenant une orientation physiologique sans restreindre ni déformer le tissu. De manière cruciale, le RHIT améliore la reproductibilité des données, la fidélité de l’imagerie et la cohérence procédurale sur une large gamme de tailles de souris. Cela élimine le besoin de gels, d’adhésifs ou d’interfaces chirurgicales complexes, tout en simplifiant l’alignement des tissus et le contrôle de la température. De plus, le RHIT est un outil spécialisé qui fait le lien entre l’animal et le microscope, conçu pour aider à la fois le soutien physiologique et la précision de l’imagerie.

Le RHIT répond directement aux défis mécaniques et optiques des modèles métaboliquement compromis grâce à sa géométrie évolutive, qui permet d’accueillir des animaux de taille plus grande tout en répartissant uniformément le poids pour minimiser l’instabilité des plateformes. L’ouverture hépatique en retrait stabilise le tissu grâce à la gravité sans force de compression, permettant un accès constant et réduisant le mouvement lors de l’imagerie. Sa conception réutilisable et chimiquement inerte assure la compatibilité avec les tissus biologiques tout en favorisant la réutilisation hygiénique. En permettant un positionnement cohérent, en minimisant les artefacts de mouvement et en maintenant l’intégrité des tissus, le RHIT offre une avancée fondamentale dans les flux de travail intravitales de microscopie. Son adaptabilité et sa disponibilité open source favorisent également une large utilité dans les laboratoires et les modèles animaux, établissant une nouvelle norme pour les outils d’imagerie qui prennent en charge à la fois l’échantillon et le système d’imagerie.

De plus, les étages de microscope chauffés disponibles dans le commerce peuvent nécessiter des installations et manipulationsavancées de 39 microscopes. Elles ne sont pas adaptées à l’échelle de l’échantillon et sont généralement plus coûteuses, ce qui les rend moins accessibles pour de nombreux chercheurs. Ainsi, un insert réutilisable et évolutif est important pour standardiser la MIV pour différents modèles animaux. La technologie imprimée en 3D, également appelée fabrication additive, est devenue de plus en plus populaire dans les laboratoiresscientifiques 40, transformant les protocoles de biochimie, physique et biologie. Pour la IVM, la technologie 3D a été utilisée pour fabriquer des fenêtres optiques d’imagerielégères 41,42, améliorer l’accessibilité destissus 43, et faciliter la réparation et la reconstructiontissulaire 44. Ainsi, un outil personnalisé pour la stabilisation tissulaire, qui, à notre connaissance, n’a pas été décrit, représente une excellente opportunité d’utiliser l’impression 3D pour surmonter certains des défis de la FIV hépatique.

Le RHIT est créé à l’aide d’une méthode d’impression 3D en une seule étape et améliore considérablement la stabilisation des tissus sur une période prolongée. Le RHIT est très accessible et adapté aux expériences de MIV aiguë nécessitant un minimum d’expertise chirurgicale. De plus, le RHIT est facilement évolutif à la taille animale et a un faible coût de production. Enfin, nous démontrons que le RHIT permet une imagerie fluorescente en accéléré stable et améliore la stabilité des tissus par rapport à l’insert en carton utilisé auparavant. La RHIT simplifie la FIV de l’homéostasie lipidique hépatique sans contact direct ni impact mesurable sur les conditions physiologiques. Par conséquent, le RHIT présente un avantage concurrentiel en tant que contribution accélérée, réutilisable et adaptable à IVM34, 36, 45.

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Figure 1 : Conception RHIT. (A) Conception et dimensions d’une RHIT de 3,0 mm adaptée à une souris obèse. La vue enface (à gauche) montre les dimensions, le positionnement et la taille de l’ouverture tissulaire, ainsi que l’orientation de la souris lors de l’imagerie. La vue latérale (à droite) inclut les dimensions et indique la position de la plaque chauffante et de l’insert de la sonde thermique. Les paramètres de mise à l’échelle pour différentes tailles de souris sont fournis dans le Tableau 1. (B) Vue en face 3D de RHIT générée à partir du fichier STL open source, montrant où le fil de sonde rectal est inséré via le port personnalisé (dimensions de l’insert de sonde rectale indiquées en haut à droite). (C) Assemblage technique du RHIT montrant l’intégration du dispositif de chauffage et des inserts structurels personnalisés pour différentes tailles RHIT, le fil est inséré dans l’insert rectal de la sonde pour accéder à la sonde de température. Abréviation : RHIT = Outil d’imagerie hépatique réutilisable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Le RHIT a été initialement conçu comme un assemblage monocomposant utilisant l’ABS (acrylonitrile butadiène styrène), un polymère thermoplastique largement utilisé dans la modélisation 3D4D par dépôt fusionné. L’ABS offre plusieurs avantages pour cette application : il est léger, résistant à la chaleur (point de fusion ~200 °C) et bénéficie d’une bonne résistance auximpacts 46,47,48. La conception de RHIT exploite la densité réglable de l’ABS, lui permettant d’absorber les mouvements physiologiques tels que le battement du cœur et la respiration. Une densité accrue de remplissage améliore l’amortissement du mouvement, ce qui améliore la stabilité de l’imagerie et améliore la qualité de l’image.

Le RHIT est conçu pour absorber le mouvement grâce à des ajustements de la densité d’un matériau chimiquement inerte tel que l’ABS. Dans ce contexte, la densité fait spécifiquement référence au pourcentage d’infill interne utilisé lors de l’impression 3D, qui affecte la rigidité et la capacité de la plateforme à amortir lesvibrations 49,50,51. L’augmentation de la densité de l’ABS a été observée pour réduire la transmission des mouvements causés par le battement du cœur et la respiration, ce qui permet d’obtenir une plateforme stable pour l’imagerie et d’améliorer la qualité de l’image. Nous avons testé des constructions RHIT avec des densités de remplissage internes variables (20-100 %) et observé qualitativement que des configurations à densité plus élevée conduisaient à une réduction visible des artefacts de mouvement lors de l’imagerie intravitale hépatique chez la souris. La quantification formelle n’a pas été réalisée, car la configuration à haute densité s’est révélée suffisamment robuste et efficace sur toutes les tailles RHIT testées, et a constamment fourni des performances fiables dans des conditions d’imagerie routinières. Pour la plupart des utilisateurs, cette densité par défaut sera adaptée sans ajustement supplémentaire. Cependant, pour les expériences nécessitant des caractéristiques mécaniques spécifiques, la densité de remplissage et les paramètres de conception peuvent être modifiés, et des instructions complètes d’impression 3D ont été fournies pour supporter cette personnalisation.

Des matériaux alternatifs peuvent être utilisés pour l’impression ; cependant, l’ABS est le matériau préféré pour la fabrication RHIT car il offre plusieurs avantages clés. Il est chimiquement inerte, minimisant le risque d’interaction avec les tissus ou les fluides corporels, et insoluble dans l’eau, permettant un nettoyage, un stockage et une réutilisation efficaces. Ces propriétés font de l’ABS un choix fiable et durable pour un usage expérimental. Lorsque l’accès à une imprimante de modélisation à dépôt fusionné est limité, d’autres techniques et matériaux d’impression 3D peuvent être utilisés. La stéréolithographie, le frittage sélectif au laser et la fusion multi-jets sont des options adaptées avec des matériaux tels que le nylon, les résines photopolymères ou les poudres composites. Le nylon offre durabilité et flexibilité, tandis que les résines stéréolithographiques offrent une haute résolution pour les applications nécessitant des détails structurels fins. Le design RHIT peut être facilement adapté aux tolérances et contraintes de différents matériaux, ce qui le rend compatible avec une gamme de plateformes d’impression. Les utilisateurs doivent choisir les matériaux en fonction de leur stabilité mécanique, de leur biocompatibilité, de leur compatibilité avec les flux de travail d’imagerie et des ressources d’impression disponibles.

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Protocole

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Toutes les études animales ont été menées dans les installations animales des National Institutes of Health conformément aux directives et protocoles autorisés par le Comité d’éthique pour les expériences animales (protocole n° LCMB-037). Tout le personnel doit être correctement formé avant de procéder aux protocoles suivants. La manipulation des animaux a été réalisée conformément aux directives institutionnelles.

Le protocole RHIT décrit la préparation d’outils d’imagerie hépatique réutilisables (RHIT) pour une utilisation dans les expériences de microscopie intravitale (IVM). Les procédures expérimentales sont réalisées dans une salle de microscope stérilisée, ou cagoule, et impliquent une série d’étapes : d’abord, l’impression du RHIT, l’anesthésie et le marquage fluorescent de la souris, puis la mise en place du microscope, ensuite la procédure chirurgicale, et enfin l’application d’une IVM assistée par RHIT. Les figures 1 et 2 illustrent les composants nécessaires pour l’imagerie des échantillons vivants à l’aide d’un microscope confocal, qui incluent un insert métallique 5,6,7 (adaptateur de microscope pour imager des échantillons vivants) pour le placement des RHIT, ainsi que des RHIT pour une utilisation en stéatose avancée ou contrôlée. Pour tester le système, des mâles C57BL/6J musculus âgés de 6 à 10 semaines ont été prélevés et nourris avec un régime standard ou occidental pendant 8 à 10 semaines avant l’expérience.

1. Conception de RHIT avec modifications

  1. Pour recréer RHIT, utilisez un logiciel de conception de produits 3D (voir le tableau des matériaux). Ouvre le logiciel de conception et crée une nouvelle pièce standard. Sauvegardez le fichier avec une description appropriée.
  2. Créez le croquis de RHIT sur le plan avant en utilisant la fonction Créer un croquis 2D .
    1. Cliquez sur l’icône rectangle et placez son coin inférieur gauche à l’origine du plan de croquis.
    2. Dessinez un second rectangle à l’intérieur du premier pour représenter la fenêtre d’imagerie de RHIT.
    3. Ajoutez des dimensions aux deux rectangles en utilisant la fonction Dimension , en veillant à ce que toutes les longueurs et largeurs soient référencées à l’origine et relatives les unes aux autres.
    4. Ajustez les dimensions RHIT en fonction de la taille de la souris.
    5. Ajoutez de l’épaisseur à RHIT en sélectionnant uniquement le rectangle extérieur et en cliquant sur extrud. Lorsqu’une fenêtre pop-up apparaît, sélectionnez le croquis à l’aide de l’outil Extrusion pour laisser une ouverture au centre.
    6. Sélectionnez la face inférieure du RHIT extrudé et commencez un nouveau croquis 2D en utilisant la fonction Start 2D Sketch .
  3. Dessinez un rectangle pour définir la poche du coussin chauffant. Appliquez les dimensions acquises en utilisant la fonction Dimension .
    1. Sortez du croquis 2D et effectuez un retrait de matériau à l’aide de l’outil Cut Extrude pour créer une cavité profonde pour le coussin chauffant.
  4. Commencez un nouveau croquis pour la sonde de température sur la même face que la cavité. Cliquez sur lancer un croquis 2D et sélectionnez l’icône cercle . Placez le cercle sur la surface plane et dimensionnez-le en conséquence. Sors du mode esquisse .
    1. Cliquez sur extruder et sélectionnez le croquis du cercle. En modeextrusion , cliquez sur extrudation coupée, et attendez qu’une fenêtre pop-up apparaisse avec une option traversante pour retirer le matériau. Cliquez sur OK. Sortie du mode extrusion .
    2. Ajoutez des filets sur les bords de la fenêtre en cliquant sur l’icône de filet et en sélectionnant les huit bords tranchants. Ajoutez la taille du filet et sortez du mode filet .
      REMARQUE : Si une absorption de mouvement supplémentaire est souhaitée, les utilisateurs peuvent augmenter la densité interne de remplissage lors de la préparation à l’impression 3D.
  5. Préparez le modèle pour l’impression 3D en allant dans l’onglet environnement et en sélectionnant l’onglet Impression 3D.
    1. Utilisez la fonction Alignement de l’ensemble pour vous assurer que le modèle est à plat sur le plateau d’impression et non orienté verticalement.
    2. Cliquez sur Options d’impression pour configurer les réglages de l’unité et ajuster l’échelle si nécessaire.
    3. Sauvegardez le modèle finalisé. Formatage STL en utilisant la fonction d’exportation STL .
    4. Quittez l’onglet environnement et cliquez sur enregistrer pour sauvegarder RHIT comme une partie solide.
  6. Fermez le programme de conception.
    REMARQUE : Assurez-vous que l’imprimante est compatible avec le fichier . Format de fichier STL ou convertir au format approprié selon l’exigence du logiciel d’imprimante 3D.

2. Téléversement et impression de RHIT à partir de fichiers STL

  1. Importez le fichier .stl de la Figure 1A ou du Fichier Supplémentaire 1 dans un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) 3D en cliquant sur Importer et en sélectionnant le fichier .stl. Cliquez sur le bouton Préparer pour découper le modèle en fines couches pour l’impression 3D.
  2. Sélectionnez l’imprimante commerciale 3D appropriée et cliquez sur Imprimer. Ensuite, surveillez l’avancement de l’impression, et une fois l’impression terminée, retirez et nettoyez l’objet imprimé en 3D selon les besoins.
Taille de la sourisPoids corporel de la souris (g)Épaisseur RHIT (mm)Imagerie de la fenêtre : Taille L x N (mm)
Petit (S)17-201.517 x 17
Moyen (M)22-252.521 x 21
Large (L)35-40326 x 26

Tableau 1 : Mise à l’échelle de la taille de la souris à RHIT. Le poids de la souris est ajusté à l’épaisseur du RHIT, où un poids supérieur à 30 g (pointe de flèche) correspond au plus grand RHIT (3,0 mm). La souris la plus légère correspond à la RHIT la plus fine, et les souris obèses sont représentées par la RHIT la plus épaisse. Ces dimensions peuvent être ajustées dans un logiciel de CAO. La longueur et l’ouverture d’imagerie RHIT peuvent varier selon l’emplacement de l’organe de l’échantillon utilisé ; longueur constante et ouverture d’imagerie pour les trois RHIT étaient adaptées à cette étude. Abréviations : RHIT = Outil d’imagerie hépatique réutilisable ; CAD = conception assistée par ordinateur.

3. Préparation du microscope et utilisation du RHIT

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Figure 2 : IVM du foie utilisant la technique RHIT. (A) Schéma du microscope confocal inversé avec une souris anesthésiée. (B) Un adaptateur de microscope métallique (insert) était utilisé pour positionner la souris sur la scène du microscope lors de l’imagerie en direct. (C) Le RHIT imprimé en 3D était utilisé avec une bande de gaze pour manipuler facilement le parenchyme hépatique. (D) Image du foie pré-extériorisé avant le positionnement RHIT. Le cône nasal était utilisé pour l’anesthésie avant et pendant l’opération. (E) Image du foie extériorisé avant le positionnement RHIT lors d’une procédure aiguë. Le rasage n’était pas obligatoire. (F) Image de la souris inversée en position finale face cachée sur le RHIT pour l’imagerie. (G) RHIT solidement fixé à l’étage du microscope. (H) Une souris positionnée sur un RHIT et un adaptateur métallique. (I) Les souris maigres (flèche bleue) et les souris obèses (flèche verte) montrées avec des inserts RHIT écaillés respectifs en J-L représentent des images anatomiques grossières du foie obèse et maigre (respectivement). La IVM haute résolution prend des images M,N du foie de souris obèses et maigres marquées avec BODIPY (vert, représenté par une flèche rose) pour marquer les gouttelettes lipidiques et Hoechst 33342 (blanc, représenté par une flèche cyan) pour étiqueter les noyaux, respectivement. Abréviations : RHIT = Outil d’imagerie hépatique réutilisable ; IVM = microscopie intravitale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Préparez un microscope confocal inversé conventionnel pour la FIV hépatique comme montré à la Figure 2.
    1. Insérez un adaptateur de scène pour accueillir l’échantillon. Pour suivre ce protocole, utilisez un insert métallique sur mesure avec une ouverture circulaire de 35 mm et un verre de couvercle de 40 mm.
    2. Nettoyez soigneusement les deux côtés du verre de couverture avant et après chaque imagerie en utilisant de l’éthanol à 70 % si nécessaire.
  2. Fixez le RHIT approprié selon la taille de la souris (Tableau 1) avec du ruban adhésif (optionnel) en alignant l’ouverture RHIT avec la lentille objective et en parallèle sur le couverdissage d’image (Figure 2G) sur l’insert métallique, avec du ruban adhésif sur le verre de couverture.
  3. Choisissez un objectif d’imagerie en fonction de la taille de la zone, de la résolution spatiale et du temps d’imagerie, par exemple un objectif d’eau de 25x/0,95.
    REMARQUE : Bien qu’un grossissement plus élevé améliore la résolution, cela augmente également la probabilité d’artefacts de mouvement.
    1. Nivelez l’objectif près de la vitre de couverture.
  4. Fixez une bande de gaze (environ 1 x 8 cm, figure 2C,D) à travers la fenêtre RHIT avec du ruban adhésif pour aider à positionner le tissu et le séparer des autres organes abdominaux (figure 2C).
  5. Préchauffez la RHIT à l’aide d’une bouillotte insérée dans la fente et fixez la sonde thermique adjacente à la RHIT (Figure 2G,H) pour maintenir la température corporelle de la souris lors de l’imagerie.

4. Marquage fluorescent et anesthésie de souris

  1. Réduisez le stress de la souris en désinfectant la chambre d’induction anesthésique pour éliminer toute trace de puanteur animale.
  2. Allumez le condenseur d’oxygène, un système de protection de l’environnement (EPS) et le vaporisateur d’isoflurane.
  3. Placez la souris dans la chambre d’induction et anesthésiez avec de l’isoflurane à 2-3 % pendant environ 3 à 5 minutes, ou jusqu’à ce que l’animal présente une respiration stable et une perte de réflexes de redressement et de pédales.
    1. Une fois anesthésiée, transférez la souris sur la bouillotte et maintenez l’anesthésie en utilisant 1-2 % d’isoflurane délivré par le cône nasal (Figure 2D), en ajustant selon les besoins pour assurer un plan d’anesthésie chirurgical stable tout au long de la procédure.
    2. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un test de pincée des orteils pour observer tout mouvement volontaire.
  4. Pour marquer les structures riches en lipides, injectez 200 nmol de BODIPY 665/676 dilué dans du PBS (volume total 200 μL) via la veine de la queue à l’aide d’une seringue d’insuline à 31 G.
    1. Pour un signal optimal, administrez BODIPY une fois par jour pendant 2 jours consécutifs avant l’imagerie. Laissez au moins 3 à 4 heures après la deuxième injection pour garantir une élimination systémique du fond et la stabilisation du signal tissulaire.
  5. Pour fournir un contraste nucléaire, injectez du Hoechst 33342 (2 μg/g de poids corporel) dilué dans une solution d’héparine (préparée en mélangeant 120 μL d’héparine avec 180 μL de solution saline pour obtenir 400 U/mL) via le sinus rétro-orbitaire à l’aide d’une seringue d’insuline à 31 G.
    REMARQUE : Le Hoechst est administré séparément pour éviter les précipitations lorsqu’il est mélangé à d’autres colorants.
  6. Pour visualiser la vascularisation, injectez 18 μg/g de poids corporel de dextran fluorescent (70 kDa) dilué dans la même solution d’héparine 1x décrite à l’étape 4.5, via le sinus rétro-orbitaire controlatéral à l’aide d’une seringue d’insuline à 31 g (Tableau 2).
    REMARQUE : L’héparine est incluse pour réduire la formation de caillots et favoriser un flux sanguin régulier lors de l’imagerie.
  7. Attendez 10 à 15 minutes après les injections de Hoechst et de dextran avant de commencer l’opération et l’imagerie.
Journaliste fluorescentObjectifDose par poids (ou concentration)
Hoechst 33342Noyaux de coloration2 μg/g : compléter le volume injectable à 50 μl avec une solution d’héparine
Carrosserie 665/676Gouttelettes lipidiques de teinture0,8 μg/g : volume d’injection de supplément à 200 μl en solution saline
2M tétraméthyle rhodamine-dextran (Dextran)Vascularisation des taches18 μg/g : compléter le volume injectable à 50 μl avec une solution d’héparine

Tableau 2 : Options de reporters fluorescents. Ce tableau fournit une description détaillée des méthodes utilisées pour l’imagerie in vivo(in vivo) des tissus de la souris. La solution d’héparine est d’abord préparée puis utilisée pour fabriquer les solutions DAPI-héparine etdextran-héparine 7. Hoechst 33342 est injecté rétro-orbitalement dans un œil, tandis que BODIPY est injecté directement dans la veine caudale 2-3 jours avant, avec une concentration plus élevée chez les souris obèses. Le Dextran est injecté rétro-orbitalement dans l’autre œil. Il est important de réaliser séparément des injections rétro-orbitaires dans chaque œil. Abréviation : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole.

5. Intervention chirurgicale de souris

  1. Rase la veste abdominale à l’aide d’une tondeuse et/ou d’une crème dépilatoire. Enlevez les résidus de poils et utilisez 70 % d’éthanol pour nettoyer la peau exposée.
    REMARQUE : Selon les exigences institutionnelles de l’IACUC, un frottement alterné de bétadine et d’éthanol peut être utilisé pour garantir une préparation appropriée du site chirurgical.
  2. Réévaluez la profondeur de l’anesthésie avant l’opération.
  3. Exposez le foie en réalisant une incision horizontale en croissant de 2-3 cm sous la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux depuis le xiphoïde, se terminant sur le côté latéral gauche du haut de l’abdomen.
  4. Après l’incision initiale, réalisez soigneusement une incision secondaire plus petite dans la couche musculaire pour exposer le lobe gauche du foie, cautérisez (optionnel) si nécessaire pour éviter les saignements (Figure 2E).
    1. Évitez les dommages causés par la chaleur au foie lors de l’utilisation du cautérisateur en plaçant une gaze imbibée de solution saline entre le foie et la couche musculaire pour absorber la chaleur émanante de la couche musculaire.
    2. Évitez tout saignement excessif, un traumatisme chirurgical ou mécanique, ou une compression externe.
  5. Une fois le foie exposé, transférer la souris sur l’étage du microscope.

6. Placement de la souris sur l’étage du microscope

  1. Placez l’abdomen de la souris anesthésiée face vers le bas sur la plateforme RHIT du microscope.
    1. Ajustez le cône du nez pour que la souris reste sous anesthésie.
    2. Utilisez un applicateur à extrémité de coton humidifié au sérum physiologique pour manier délicatement le lobe latéral gauche du foie contre la housse tout en appliquant une pression externe douce sur la cavité thoracique.
      REMARQUE : Profitez de la gravité pour manœuvrer prudemment le foie vers l’extérieur et le poser sur la vitre de couverture.
    3. Utilisez une bande de gaze pour séparer doucement le foie du corps de la souris (Figure 2E-H).
  2. Vérifiez à nouveau le cône du nez pour vous assurer que la souris reste sous anesthésie lors de l’imagerie.
  3. Prévenez la déshydratation des tissus en appliquant un gel à base d’eau autour des bords de la cavité exposée et en évitant le contact direct avec la bouillotte.
    REMARQUE : Le maintien de la température et de l’humidité peut également être facilité par un microscope avec une chambre d’humiditéfermée 5,6,7.
  4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse cornéenne.
  5. Installer une IVM en accéléré pour commencerl’imagerie 7,52.
    1. Ouvrez les obturateurs laser, évaluez le marquage fluorescent et identifiez une région stable d’intérêt avec un flux sanguin notable. Sélectionnez les paramètres d’acquisition d’image appropriés, y compris le format de l’image, la vitesse d’acquisition, les intervalles d’imagerie, la durée totale d’acquisition et la moyenne ligne/image (512 × 512 pixels ; 1 à 5 images s⁻¹ par région ; intervalles d’imagerie de 5 à 30 s ; temps total d’acquisition de 5 à 20 min ; moyenne ligne/image de 2 à 8, selon les exigences expérimentales). Optimisez l’exposition au flash de fluorescence pour s’adapter aux fluorophores utilisés.
    2. Définissez les limites supérieures et inférieures des piles Z en sélectionnant la pile Z dans le panneau d’acquisition , en ajustant les plans focaux supérieur et inférieur à l’aide des contrôles de position Z, et en confirmant la plage avec Régler d’abord/Régler en dernier ; puis lancez l’enregistrement en accéléré en cliquant sur Démarrer l’expérience (ou Démarrer l’acquisition). À la fin de l’imagerie, euthanasiez l’animal conformément aux soins institutionnels et utilisez les protocoles approuvés par le comité.

figure-protocol-2
Figure 3 : Mesurer l’amélioration de la stabilité hépatique de la FIV de la RHIT avec SSIM. Une MIV hépatique du lobe hépatique inférieur gauche du foie sous trois conditions de stabilisation : (A) absence d’insertion (AUCUNE), (B) insertion en carton, et (C) RHIT. Les tissus sont marqués avec BODIPY (magenta, lipides), Hoechst 33342 (vert, noyaux) et Dextran (cyan, vascularisation) ; les cases A et B montrent des distorsions visibles et des artefacts de mouvement, tandis que C montre une clarté accrue avec la RHIT. (D) L’indice de similarité structurelle (SSIM) a été calculé pour quantifier la stabilité de l’image. Les barres affichent la moyenne ± SEM, et chaque point coloré représente une réplique biologique individuelle : RHIT (n = 14), Carton (n = 10), Sans insertion (n = 8). Ces groupes sont des sous-ensembles issus de la cohorte expérimentale globale d’environ 50 à 70 souris. Seules les sessions répondant à des critères d’imagerie spécifiques (par exemple, alignement cohérent des images et qualité d’image) ont été analysées via SSIM. RHIT produisait constamment des valeurs SSIM plus élevées (moyenne de 0,511 ± SEM), indiquant une meilleure stabilité et résolution dans toutes les conditions d’imagerie. Barres d’échelle = 15 μm. Des images représentatives sont montrées ; Le SSIM reflète les séances de FIV en série sans dommage ou perturbation tissulaire observable. Abréviations : RHIT = Outil d’imagerie hépatique réutilisable ; IVM = microscopie intravitale ; SSIM = indice de similarité structurelle ; CARTE = insert en carton. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Résultats

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RHIT a été conçu à l’aide d’une application CAO (Figure 1). Les dimensions du RHIT sont adaptées pour accueillir des souris petites, moyennes et lourdes (Tableau 1). Le design RHIT consiste en un matériau plat en ABS de 107,50 mm de long avec une ouverture positionnée pour permettre l’imagerie hépatique. La MIV a été réalisée dans des conditions optimales (RHIT) et sous-optimales (sans insert ni carton) (voir Figure 3A-C...

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Discussion

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La microscopie intravitale du foie a été largement étudiée, cependant, les méthodes précédentes nécessitent souvent des interventions chirurgicales très invasives et non standardisées pour stabiliser l’imagerieterminale 5,6,7,9,31,32. Le mouvement est sans doute la barrière la plus difficile ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intramuros des National Institutes of Health des États-Unis, du National Cancer Institute et de la bibliothèque des NIH. H. Sanchez Cornejo remercie l’Agence péruvienne CONCYTEC pour son soutien financier via la subvention n°PE501087367-2024-PROCIENCIA. Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Porat-Shliom et les collaborateurs du groupe de physique quantique de l’Université de Cambridge pour leur lecture critique, le personnel de la bibliothèque des NIH, ainsi que Geneti Gaga pour leur assistance technique. L’image rendue en 3D de la Figure 2A a été créée à l’aide de Biorender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ruban de masquage de ½ poucesRuban de masquage polyvalent 3M :b40069428
Enchevêtrements de 40 mmBioptech40-1313-03191
70 % (v/v) d’éthanolThermo Fisher ScientificBP2818-470 % d’éthanol en volume et 30 % d’eau en volume
Appareil d’anesthésie : AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Gel de transmission à ultrasons Aquasonic 100Laboratoires Parker  ; 01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Voir le tableau 2
Logiciels de CAO (Autodesk Inventor ou équivalent) & nbsp ;Autodesk (logiciel CAO représentatif)N/DLogiciels
Système de cautéritéGémeauxGEM 5917
Désinfectant ClidoxLaboratoires de Recherche Pharmaceutique Inc.VWR, MSPP-96118F
Microscope confocal (Leica SP8 ou équivalent)LeicaSP8
Applicateurs à pointe de cotonProduits médicaux puritains25-806 1WC
Insert de scène en aluminium sur mesure (3 mm d’épaisseur, dépression de 35 mm)N/AN/A
FORANE (isoflurane, USP) liquide pour inhalation, 250 mLBaxter10019-360-60
Tondeuse à cheveux (optionnelle)Instruments finement OnyxASWRHC
Coussin chauffant avec sonde rectaleInstruments scientifiques de l’ALACOUSSIN CHAUFFANT-1/2
Héparine sodique, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Voir le tableau 2
Tapis chauffant de sourisInstruments scientifiques de l’ALACOUSSIN CHAUFFANT-1/2
Mus musculusLe laboratoire JacksonC57BL/6Souris de laboratoire
Solution saline normale (0,9 % de chlorure de sodium)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Outil d’imagerie hépatique réutilisable) taille applicableFourniN/AVoir le tableau 1
Pinces chirurgicales, extrémité courbéeOutils scientifiques finement11251-23
Gaze chirurgicaleMckesson6939
Ciseaux chirurgicauxOutils scientifiques finement14001-14
Dextran de tétraméthylrhodamineThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Voir le tableau 2
Seringues d’insuline Ultra Fine U-100, 31 gBetty MillsBD326730

Références

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