Le protocole décrit une méthode de création d’un modèle d’organoïde de cancer colorectal (CRC) dérivé d’un patient co-cultivé avec des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) afin d’étudier leurs interactions et leur potentiel thérapeutique. Ce modèle fournit une plate-forme préclinique pour explorer les réponses immunitaires dans le microenvironnement tumoral et pour prédire l’efficacité de la thérapie basée sur le TIL pour le traitement personnalisé du CCR.
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Article de méthode
Mise en place d’un système de co-culture d’organoïdes de tumeurs colorectales dérivées de patients et de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent dans le monde. Les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) ont été identifiés comme un marqueur pronostique important dans le CCR. L’application thérapeutique des TIL a déjà montré des résultats prometteurs dans le mélanome et le cancer du col de l’utérus. Cependant, leur utilisation dans le traitement du CCR reste dans une phase exploratoire. Il n’existe actuellement aucun modèle in vitro approprié pour évaluer l’efficacité de TIL, ce qui entrave les progrès ultérieurs dans ce domaine. Les modèles d’organoïdes dérivés du patient (PDO), qui conservent étroitement les caractéristiques du tissu tumoral d’origine et reflètent l’hétérogénéité entre les patients, constituent une excellente plate-forme pour étudier l’interaction entre le CCR et les TIL. Dans cette étude, une méthode est décrite pour établir un modèle d’organoïde du CCR dérivé d’un patient à partir de tissu tumoral fraîchement réséqué, suivi de l’isolement et de l’expansion des TIL. Ce système permet la co-culture d’organoïdes du CCR et de TIL, ce qui permet d’évaluer la cytotoxicité et les réponses immunitaires médiées par le TIL. En analysant l’efficacité de destruction des TIL sur les organoïdes, les résultats potentiels de l’immunothérapie basée sur TIL pour le traitement personnalisé du CCR peuvent être prédits. De plus, une ingénierie plus poussée des TIL pourrait améliorer leur efficacité antitumorale, offrant une stratégie prometteuse pour développer des thérapies cellulaires plus efficaces. Ce modèle de co-culture PDO-TIL fournit un outil puissant pour l’évaluation préclinique des thérapies TIL et les stratégies de traitement personnalisées dans le CCR.
Introduction
Le cancer colorectal (CCR) est l’un des cancers les plus répandus et les plus mortels dans le monde, ce qui représente un défi majeur de santé publique1. Malgré les progrès réalisés dans les modalités de traitement, notamment la chirurgie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, le pronostic des patients atteints de CCR, en particulier ceux atteints d’une maladie métastatique, reste sombre. Le microenvironnement tumoral (TME) joue un rôle essentiel dans la progression du cancer et les réponses au traitement, les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) émergeant comme un élément clé influençant la réponse immunitaire contre le cancer2. Les TIL, une population diversifiée de cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, ont été identifiées comme des marqueurs pronostiques significatifs dans le CCR, avec des niveaux élevés d’infiltration de TIL souvent associés à de meilleurs résultats cliniques3. Des études récentes ont également mis en évidence le potentiel thérapeutique des TIL dans d’autres cancers, tels que le mélanome4 et le cancer du col de l’utérus5, où l’immunothérapie à base de TIL a montré une efficacité prometteuse.
Cependant, malgré le succès des TIL dans certains types de cancer, leur application dans le CCR reste un domaine de recherche en cours. La complexité et l’hétérogénéité du CCR, associées au microenvironnement tumoral immunosuppresseur, présentent des défis pour une immunothérapie efficace basée sur le TIL6. Les tumeurs du CCR présentent souvent un TME7 hautement immunosuppresseur, caractérisé par la présence de lymphocytes T régulateurs (Tregs), de cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et de macrophages associés à la tumeur (TAMs), qui inhibent tous activement la fonction TIL. De plus, les cellules CRC expriment fréquemment des molécules de point de contrôle immunitaire, telles que-L1, qui peuvent entraver davantage la destruction médiée par TIL8. De plus, l’hétérogénéité génétique des tumeurs du CCR, associée à un stroma immunosuppresseur, complique la capacité des TIL à cibler et à éliminer efficacement les cellules tumorales, ce qui rend plus difficile l’obtention du même niveau de succès que celui observé dans le mélanome et le cancer du col de l’utérus9. Une lacune critique dans la recherche actuelle est le manque de modèles in vitro appropriés capables de simuler avec précision les interactions entre les CRC et les TIL. De tels modèles sont essentiels pour évaluer le potentiel des TIL dans le traitement du CCR et optimiser leur application pour des stratégies de traitement personnalisées.
Les organoïdes dérivés de patients (PLO) sont devenus un outil puissant pour modéliser les cancers humains10. Ces cultures 3D, dérivées des tissus tumoraux des patients, imitent étroitement les caractéristiques histologiques et génétiques des tumeurs d’origine, offrant une représentation plus précise de la biologie tumorale par rapport aux lignées cellulaires 2D traditionnelles. Les modèles PDO conservent également l’hétérogénéité entre les patients, ce qui les rend idéaux pour les approches de médecine personnalisée11. Dans le CCR, les PDO ont été utilisées pour le dépistage de médicaments et l’étude de la biologie tumorale12, mais leur utilisation dans l’évaluation des réponses immunitaires, en particulier dans le contexte des TIL, reste limitée. La conception d’un modèle de co-culture de cellules immunisées aux PDO doit équilibrer la complexité du microenvironnement avec la contrôlabilité expérimentale. Bien que des composants tels que les macrophages et les cellules dendritiques puissent améliorer le biomimétisme, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont devenues le choix courant en raison de leur accessibilité. Cependant, les PBMC ont une faible proportion de lymphocytes T spécifiques à la tumeur, et les sous-populations de monocytes peuvent interférer avec la stabilité microenvironnementale13. En revanche, les TIL enrichissent naturellement les clones réactifs à la tumeur et portent un phénotype d’épuisement in situ, ce qui en fait un modèle supérieur pour analyser avec précision les mécanismes d’évasion immunitaire dans le cancer colorectal.
L’objectif de cette étude est de développer une nouvelle plateforme in vitro pour évaluer les réponses antitumorales médiées par TIL dans le CCR en établissant un système de co-culture de PDOs et de TIL du CCR. Ce modèle permet d’évaluer directement la cytotoxicité de TIL contre les ODO du CCR et d’analyser les réponses immunitaires dans un contexte spécifique au patient. L’utilisation de ce système pourrait fournir des informations plus approfondies sur le potentiel des immunothérapies basées sur TIL pour le CCR et soutenir l’exploration de stratégies visant à améliorer l’efficacité de TIL par le biais d’approches d’ingénierie. Les méthodes précédentes étaient limitées par le petit nombre de TIL14. Dans la plupart des cas, les PBMC ont d’abord été co-cultivés avec des AOP pendant deux semaines, après quoi des TIL spécifiques à la tumeur ont pu être étendus à partir des PBMC, puis co-cultivés avec des AOP pour observer les effets cytotoxiques15. Cependant, cette approche souffre également d’un temps de modélisation prolongé et d’un faible rendement global. En revanche, la méthode décrite permet d’isoler et d’établir des PDO et des TIL à partir d’échantillons de tissus tumoraux plus petits, qui peuvent ensuite être directement co-cultivés. Cette approche peut offrir une plus grande commodité en termes de méthodologie et d’efficacité. En fin de compte, ce système vise à fournir un outil puissant pour l’évaluation préclinique des thérapies TIL, ouvrant la voie à des stratégies de traitement personnalisées susceptibles d’améliorer les résultats pour les patients atteints de CCR.
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Protocole
Toutes les expériences impliquant du matériel d’origine humaine ont été menées conformément à la Déclaration d’Helsinki et ont été approuvées à l’avance par le comité d’éthique de l’hôpital Zhongshan affilié à l’Université de Dalian (numéros d’approbation : KY2023-206-1). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients qui ont fourni des échantillons cliniques pour cette étude. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
Les critères d’inclusion comprenaient le tissu cancéreux colorectal primitif pathologiquement confirmé, une taille d’échantillon suffisante (≥1 cm3), l’absence d’antécédents de traitement néoadjuvant (chimioradiothérapie ou traitement ciblé) et un consentement éclairé signé. Les critères d’exclusion comprenaient une mauvaise qualité de l’échantillon avec une nécrose ou une fibrose supérieure à 50 %, la présence concomitante d’une infection grave ou d’une maladie auto-immune, des antécédents d’autres tumeurs malignes et le refus du patient de participer.
1. Préparation du réactif de culture cellulaire
- Milieu de culture pour les AOP CRC : Préparer le milieu complet pour les AOP CRC selon la composition décrite dans le tableau 1.
- Milieu complet (CM) pour les TIL16 : Compléter RPMI1640 milieu avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, HEPES, du 2-mercaptoéthanol et 3000 UI/mL d’IL-2.
- Milieu d’expansion TILs (EM) : Compléter RPMI1640 milieu avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, HEPES et 600 UI/mL d’IL-2.
- AdDMEM++++ : Complétez le DMEM avancé avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 1 % d’HEPES, 1 % de glutamine et 5 mM d’Y-27632.
- Tampon de digestion CRC : Ajouter 50 μL de collagénase de type IV et 10 μL de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B à AdDMEM++++.
- Solution de lavage des tissus : Ajouter 2 % de pénicilline-streptomycine au PBS.
2. Traitement des tissus dérivés du patient
- Réséquer le tissu tumoral primaire du cancer colorectal (à effectuer par des chirurgiens expérimentés). Après le prélèvement, divisez le tissu en deux parties. Placez une partie dans AdDMEM++++ dans une glacière et transportez-la au laboratoire pour la dissociation et la culture des cellules tumorales. Placer l’autre partie dans du paraformaldéhyde à 4 % pour l’analyse histopathologique17.
- Décongelez lentement le Matrigel dans un réfrigérateur à 4 °C. Préchauffage du tampon de lyse érythrocytaire à température ambiante. Préparez des ciseaux tissulaires, des pinces, un milieu AdDMEM++++ et un tampon de digestion CRC.
- Transférez le mouchoir dans une boîte de Pétri et rincez-le trois fois avec 5 ml de PBS. Remplacez-le par un nouveau plat et rincez-le trois fois avec un tampon de lavage pour mouchoirs en papier de 5 ml afin de minimiser la contamination.
- Émincez le tissu avec des ciseaux, transférez-le dans le tampon de digestion et incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes jusqu’à dissociation complète.
- Coupez le tissu avec des ciseaux à tissus et transférez-le dans la solution de digestion des tissus. Digérez le tissu dans un bain-marie à 37 °C et surveillez jusqu’à ce que la dissociation des tissus soit complète.
- Ajoutez un volume égal d’AdDMEM++++ pour neutraliser la digestion. Centrifugeuse à 380 × g pendant 5 min à 25 °C.
- Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Observez le nombre d’érythrocytes dans la pastille. Ajouter 1 à 3 mL de lysat d’érythrocytes et incuber pendant 10 min à 25 °C.
- Terminez la lyse avec un volume égal d’AdDMEM++++. Centrifuger à 380 × g pendant 5 min à environ 25 °C.
- Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié d’AdDMEM++++.
- Quantifier les cellules viables en utilisant l’exclusion au bleu de trypan pour obtenir une suspension unicellulaire de tissu tumoral.
3. Mise en place du modèle PDO et culture des TIL
- Divisez la suspension unicellulaire de tissu tumoral en deux parties : utilisez l’une pour l’établissement du modèle PDO et l’autre pour la culture de TILs.
- Après le comptage des cellules, mélanger 80 000 cellules par puits de suspension cellulaire avec du Matrigel dans un rapport de 1:1 pour l’établissement du modèle PDO.
- Remettre en suspension la suspension cellulaire restante dans la CM dans une plaque à 24 puits à une concentration de 1 × 106 cellules/mL pour la culture de TILs.
- Observez quotidiennement. Prendre des photos pour enregistrer l’état des AOP et des TIL. Changez de support tous les 2 jours.
4. Purification et expansion des TIL
- Cultivez les TIL pendant 10 à 20 jours avant la purification.
- Collectez les TIL dans un tube à centrifuger. Rincez la plaque du puits avec un fluide frais et récupérez toutes les cellules restantes de la plaque du puits.
- Centrifuger à 125 × g pendant 5 min à environ 25 °C.
- Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Laver avec 2 mL de PBS et centrifuger à nouveau à 125 × g pendant 5 min à environ 25 °C.
- Effectuez le comptage des cellules.
- Utiliser des billes magnétiques CD3+ pour le tri afin d’isoler les lymphocytes T CD3+ 18.
- Incuber l’anticorps avec la suspension cellulaire à 4 °C pendant 10 à 15 min.
- Incuber les billes magnétiques avec la suspension anticorps-cellule à 4 °C pendant 10 à 15 min.
- Placez la colonne de tri dans l’aimant de tri. Ajoutez la suspension de cellule à la colonne et ne laissez que les cellules positives marquées par des billes magnétiques être conservées dans la colonne de tri.
- Retirez la colonne de tri du champ magnétique. Ajouter une solution tampon pour éluer les cellules positives retenues dans la colonne. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de PBS et centrifuger à 195 × g pendant 5 min à environ 25 °C.
- Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre les cellules en suspension dans une plaque à 12 puits avec un milieu EM frais à une concentration de 1 × 106 cellules/mL. Ajouter 5 μg/mL d’anticorps CD3. Passage des cellules dans de nouveaux flacons de culture tous les 3 jours.
5. Histologie et caractérisation IHC des AOP
- Aspirer le milieu de culture une fois que les organoïdes ont atteint une taille de 50 μm.
- Fixez les sphères organoïdes directement dans du paraformaldéhyde à 4 %. Aspirer les organoïdes, centrifuger à 195 × g pendant 5 min à environ 25 °C, incorporer dans de l’agarose à 2 %, laisser durcir et transférer dans du paraformaldéhyde à 4 % pour une fixation pendant la nuit.
- Le lendemain, effectuez une déshydratation en gradient. Préparez des blocs de cire, coupez des sections de 4 μm, réhydratez-vous à l’aide d’un gradient et effectuez une coloration immunohistochimique à l’aide d’anticorps CK7, CK20, Ki-67 et CDX-2.
6. Caractérisation des TIL FI
- Purifier les TIL, les cultiver jusqu’à ce qu’un nombre adéquat soit atteint, et en extraire une portion pour la caractérisation.
- Caractériser les cellules de suspension à l’aide de la méthode de floconnage. Réglez la vitesse de rotation de la floconneuse à 343 × g pendant 4 min à environ 25 °C.
- Comptez et ensemencez les cellules à 1 × 104 par lame.
- Fixez fermement les cellules aux lames par centrifugation.
- Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes et lavez-les trois fois avec du PBS.
- Incuber avec une solution bloquante (PBS contenant 2 % de FBS) pendant 1 h.
- Incuber avec des anticorps primaires (CD45, CD3, EpCAM) pendant 1 h à température ambiante. Lavez trois fois avec du PBS.
- Préparez et incubez avec l’anticorps secondaire selon la concentration recommandée par le fabricant pendant 1 h à température ambiante. Lavez trois fois avec du PBS.
REMARQUE : Faites attention à l’homologie des anticorps. - Incuber avec du DAPI pendant 15 min à environ 25 °C.
- Observez les cellules colorées au microscope à fluorescence.
7. Système de co-culture des AOP et des TIL
- Ajouter de l’IFN-γ au milieu organoïde pour améliorer la présentation de l’antigène. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h15.
- Diluez l’anticorps anti-CD28 avec du PBS. Enduisez une plaque de 96 puits en ajoutant 50 μL de la solution d’anticorps dans chaque puits. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et incubez à 4 °C pendant 24 h.
- Après 24 h, dissociez les organoïdes en cellules uniques à l’aide de TrypLE. Comptez les cellules et lavez-les deux fois avec du PBS.
- Collectez les TIL appariés, comptez les cellules et lavez-vous deux fois avec du PBS.
- Inoculer des organoïdes à 1 × 104 cellules par puits et inoculer des TIL à 1 × 10à 5 cellules par puits pour obtenir un rapport effecteur-cible (E :T) de 10:1 pour la co-culture.
- Effectuer une co-culture dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 3000 U/mL d’IL-2 et 20 μg/mL d’anticorps bloquant la-1. Incuber pendant 3 jours et capturer des images pour l’observation et la documentation.
REMARQUE : Configurez des organoïdes sans TIL en tant que groupe de contrôle.
8. Dosage fonctionnel des TIL par cytométrie en flux
- Collecter les AOP et TIL à la fin de la période de co-culture.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation à 300 × g pendant 5 min à chaque fois. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Préparez le cocktail d’anticorps contenant CD3-FITC, CD4-APC/Cyanine7, CD8-APC, CD107a-PE-Cyanine7, CD279-PE et 7-AAD.
- Remettre les cellules en suspension dans 100 μL du cocktail d’anticorps et incuber à température ambiante pendant 20 min, à l’abri de la lumière.
- Ajouter 1 mL de PBS pour laver les cellules. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de PBS.
- Effectuer une analyse par cytométrie en flux. Voir la figure supplémentaire 1 pour la stratégie d’analyse détaillée.
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Résultats
Etablissement et caractérisation des AOP CRC
Des échantillons de tumeurs ont été obtenus chez des patients atteints de CCR. Du tissu tumoral du CCR fraîchement réséqué a été utilisé pour établir des PDO et des TIL, qui ont ensuite été utilisés dans des expériences de co-culture PDO-TIL (Figure 1).
...
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Discussion
Cette étude utilise du tissu CRC dérivé de patients pour obtenir à la fois des cellules tumorales et des TIL, à partir desquels les PDO sont établies et les TIL sont élargis. L’interaction entre ces deux composantes est ensuite étudiée par le biais d’un système de co-culture.
Dans des études précédentes, les TIL ont été extraits à l’aide d’instruments complexes19 ou directement à partir de suspensions de tissus tumoraux
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [82172822] ; Programme de soutien à l’innovation des talents de haut niveau du Bureau des sciences et de la technologie de Dalian [2021RD02] ; Plan conjoint du programme provincial de science et de technologie du Liaoning [2024JH2/102600067] ; Projet provincial de coopération scientifique et technologique internationale du Liaoning [2024JH2/101900006].
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 avancé | Gibco | 12634028 | |
| 2-Mercaptoéthanol | sigma | 63689 | |
| 4 % de paraformaldéhyde | BBI | E672002-0100 | |
| 7-AAD | Biolégende | 420403 | |
| N° A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Supplément B27 | Gibco | 17504-44 | |
| CD107a-PE-Cyanine7 | Biolégende | 328618 | |
| CD279-PE | Biolégende | 329906 | |
| Anticorps monoclonal CD3 (OKT3) | Invitrogen | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Biolégende | 300406 | |
| CD45 (domaine intracellulaire) (D9M8I) ; | CST | N° 13917S | |
| CD4-APC/Cyanine7 | Biolégende | 300518 | |
| CD8-APC | Biolégende | 344722 | |
| CDX-2 | MXB | RMA-0631 | |
| CK20 | MXB | Réf.-0025 | |
| CK7 | MXB | Réf.-0021 | |
| Dylight 488, IgG anti-lapin de chèvre | Abbkine | N° A23220 | |
| Dylight 549, IgG anti-souris de chèvre | Abbkine | Réf. A23310 | |
| FEM | Peprotech | AF-100-15 | |
| EpCAM | CST | Référence 36746T | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Cellmax | SA211.02 | |
| FGF 10 | Peprotech | 100-26 | |
| Gastrin (Humain) | Tocris | 3006 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Hepes | Sigma | N° H4034 | |
| HEPES | Sigma | N° H4034 | |
| Kit de séparation de cellules CD3+ humaines (RUO) | RWD | Référence K1201-10 | |
| Protéine recombinante IFN-gamma humaine | PeproTech | Référence 300-02-20UG | |
| Ki-67 | CST | Roues 9449 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| N-acétylcystéine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Nivolumab (anti--1) | Sellerk | A2002 ; | |
| Pénicilline/streptomycine | Sigma | V900929 | |
| Pénicilline-streptomycine | NCM Biotech | Réf. C100C5 | |
| Primocin | Invivogen | Fourmi-pm-1 | |
| Coussin de lyse des globules rouges | Thermo-invitrogène | 00-4300-54 | |
| IL-2 humaine recombinante (sans porteur) | Biolégende | 589104 | |
| RPMI 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Sellerk | S1077 | |
| Trypan Teinture Bleu 0.4 % | Thermo-invitrogène | Réf. T10282 | |
| Ultra-LEAF Anticorps anti-CD28 humain purifié | Biolégende | 302934 | |
| Ultra-LEAF Anticorps anti-CD3 humain purifié | Biolégende | 317325 | |
| Y-27632 | Sellerk | S1049 |
Références
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Réimpressions et autorisations
