Il s’agit de la première partie d’un protocole complet d’échantillonnage de Xenopus . Les tissus échantillonnés sont le ventricule cardiaque, le tronc artériel, le lobe hépatique gauche, la vésicule biliaire, le poumon, le pancréas, la rate, le larynx, l’œsophage, l’estomac, les intestins, les testicules, les corps adipeux, l’oviducte, les reins appariés, le plexus sciatique, la peau, le thymus et l’œil entier.
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Article de méthode
Techniques efficaces pour l’échantillonnage complet des tissus accessibles chez le xénope adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le xénope est depuis longtemps un organisme modèle essentiel pour l’étude du développement et des maladies des vertébrés, offrant des informations approfondies sur les processus cellulaires et la fonction des gènes. Malgré la richesse des informations sur le xénope embryonnaire, il reste une lacune importante dans les méthodes standardisées d’échantillonnage des tissus adultes, en particulier pour les approches modernes comme la protéomique quantitative. Cette étude présente un protocole complet pour un échantillonnage rapide, précis et efficace de plusieurs tissus chez le xénope adulte. Le protocole relève les défis associés aux différences anatomiques subtiles par rapport aux autres anoures, garantissant la reproductibilité même pour ceux qui ont une expérience limitée de la dissection de grenouilles. Ce protocole est optimisé pour des analyses biochimiques de haute qualité en privilégiant la fraîcheur des échantillons. Nous facilitons le prélèvement rapide de jusqu’à 18 tissus en une heure. De plus, les méthodes s’appliquent aux conditions perfusées et non perfusées, offrant une flexibilité pour une gamme de besoins expérimentaux. Ce travail comble non seulement une lacune méthodologique critique pour Xenopus laevis et tropicalis , mais constitue également une ressource précieuse pour les chercheurs qui adaptent les techniques à des modèles d’amphibiens similaires, améliorant ainsi la portée et la fiabilité des études biologiques et évolutives comparatives.
Introduction
Le xénope offre des avantages uniques par rapport aux souris, aux poissons-zèbres et à d’autres organismes modèles pour l’étude des maladies humaines, en particulier dans des contextes de développement et d’évolution. Son développement embryonnaire externe et ses grands embryons facilement manipulables permettent l’observation en temps réel et les interventions expérimentales (par exemple, greffe de tissus, édition de gènes) qui sont difficiles chez la souris, qui se développent en interne et nécessitent des procédures invasives. De plus, le cœur à trois chambres et les membres tétrapodes du xénope fournissent un pont évolutif plus direct pour l’étude des malformations congénitales1, de la régénérationdes membres 2 et du développement cardiaque3. Contrairement aux souris, les têtards de xénope peuvent régénérer leurs membres et leurs organes, modélisant des processus de régénération absents chez les mammifères, tandis que leur stade de vie aquatique permet une étude non invasive des impacts environnementaux ou toxiques. Combiné à une reproduction plus rapide, à des coûts plus faibles et à moins de contraintes éthiques, le xénope est supérieur pour les études mécanistes à haut débit de l’organogenèse et des réponses au stress qui sont difficiles à reproduire dans les systèmes mammifères.
Cet article vise à offrir des orientations claires pour un échantillonnage précis et reproductible des tissus adultes du xénope, comme c’est le cas pour les têtards de xénope 4. Bien qu’il soit possible d’obtenir une « dissection numérique »5 et une « imagerie micro-TDM »6 du xénope adulte, il reste difficile d’obtenir un prélèvement cohérent d’organes et de tissus chez le xénope adulte sans les instructions détaillées fournies pour d’autres modèles adultes, tels que les souris 7,8,9.
Bien qu’un guide d’échantillonnage pour six tissus cruciaux soit disponible10, il n’existe actuellement aucun guide de dissection et d’échantillonnage spécifique et étendu pour le xénope . Il existe un guide de dissection complet pour Rana sp.11 et divers manuels de dissection en classe sont disponibles pour d’autres anoures12, Cependant, pour les personnes qui n’ont pas d’expérience dans les techniques d’échantillonnage ou l’anatomie des amphibiens, les différences subtiles entre Xenopus et les autres anoures rendent les ressources existantes insuffisantes pour un échantillonnage de tissus cohérent et reproductible.
Ce guide a été élaboré pour prioriser la fraîcheur des tissus pour la protéomique et l’immunochimie. Pour un utilisateur expérimenté, tous les tissus peuvent être prélevés sur une seule personne en moins d’une heure. Il est recommandé, si un utilisateur manque d’expérience, d’essayer ce protocole sur des spécimens qui ont été euthanasiés pour d’autres raisons avant de sacrifier tout animal plus difficile à remplacer.
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Protocole
Toutes les expériences ont été approuvées et réalisées conformément aux règles et règlements de l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3) de la Harvard Medical School. Si le protocole de perfusion13 est suivi avant l’échantillonnage, passez à l’étape 2.3.
1. Préparation (sans perfusion)
- S’assurer que l’établissement de recherche a approuvé la technique d’euthanasie décrite dans le présent protocole.
- Préparez une solution de 5 g/L de MS-222 (méthanesulfonate de tricaïne) et de 5 g/L de bicarbonate de sodium (voir le tableau des matières). Vérifiez le pH pour vous assurer qu’il est de ≥7.
REMARQUE : Le volume doit être supérieur au volume requis pour couvrir complètement les animaux euthanasiés. - Effectuez l’euthanasie primaire en plaçant le Xénope dans la solution MS-222 (à partir de l’étape 1.2), en gardant l’animal immergé pendant un total de 1 h14.
- Placez la surface de dissection (plateau ou feuille de mousse) inclinée à l’intérieur d’un récipient secondaire ou disposez-la de toute autre manière pour faciliter le drainage du sang.
- Une fois que la grenouille a été dans la solution pendant 1 h, l’euthanasie primaire a été terminée. Retirez la grenouille et vérifiez la perte de réponse à la douleur en effectuant un pincement du pied.
- Consigner l’âge (s’il est connu), le sexe et l’état de santé de l’animal échantillonné, ainsi que s’il a été perfusé. Pesez le Xenopus et prenez toutes les mesures supplémentaires nécessaires avant l’échantillonnage.
- Placez la grenouille sur son dos et épinglez les membres antérieurs à proximité du corps (figure 1A).
- À l’aide de ciseaux de dissection, coupez à travers la peau, le long de la ligne médiane, puis latéralement, en faisant deux rabats.
- Identifiez la linea alba (figure 1B). À l’aide d’une pince, saisissez la linea alba et retirez-la de la cavité cœlomique. Utilisez soigneusement des ciseaux pour couper vers la tête, à travers la musculature. Faites deux rabats à partir de la paroi de la cavité et coupez ou épinglez tous les rabats à l’écart.
- Identifiez le cœur, qui doit encore battre. Si le cœur n’est pas facilement accessible, utilisez des ciseaux à dissection pour réduire les os coracoïdes (Figure 1B).
REMARQUE : Si le cœur a cessé de battre avant le prélèvement, la fraîcheur de l’échantillon a été compromise. - Si vous le souhaitez, suivez le protocole de perfusion rapide9.
2. Échantillonnage
REMARQUE : Si l’animal a été perfusé, passez à l’étape 2.3. Toutes les marges doivent être d’environ 25 mm. Les pinces et les ciseaux doivent être essuyés ou remplacés entre les échantillons. Tous les tissus doivent être échantillonnés dans l’heure suivant l’euthanasie, pour une fraîcheur maximale.
- À l’aide d’une pipette de transfert, rincez la cavité cœlomique avec du PBS réfrigéré ou 0,7x PBS15 pour éliminer le sang et maintenir la visibilité.
- Identifiez le péricarde mince (figure 2A) et tirez-le tendu à l’aide d’une pince à tissus. À l’aide de la pointe des ciseaux d’iridectomie, perforez-le doucement, en faisant attention de ne pas couper les tissus sous-jacents. Décollez le péricarde des trois cavités du cœur (figure 2B).
- Coupez les oreillettes en les coupant à l’endroit où elles rencontrent le ventricule et le tronc artériel.
- À l’aide d’une pince, saisissez le ventricule par l’apex et coupez-le en dessous de l’endroit où il rencontre le tronc artériel, en laissant une marge (Figure 2C).
- Inspectez visuellement le ventricule sous grossissement pour vous assurer qu’aucun tissu indésirable n’est attaché.
REMARQUE : Le centre du ventricule peut inclure du tissu valvulaire en spirale de couleur claire ; Celle-ci peut être conservée. Chez les animaux non perfusés, l’ablation du ventricule peut être qualifiée d’euthanasie secondaire (également appelée anesthésie terminale). - Immédiatement après l’échantillonnage, rincer les échantillons de tissus dans du PBS réfrigéré ou du PBS 0,7x, selon les besoins expérimentaux15.
REMARQUE : Chez les animaux perfusés, on s’attend à ce que tous les tissus, à l’exception du foie, soient rincés proprement. Si ce n’est pas le cas, il faut en prendre note. Dans les tissus non perfusés, tous les supports de rinçage seront saturés de sang. Les étapes 2.5 à 2.6 doivent être suivies après l’échantillonnage de chaque tissu. - Observez que le tronc artériel se divise en deux troncs aortiques (également appelés aortes latérales) et que chacun se divise en trois arcs artériels (Figure 2D). Tirez le tronc artériel tendu et coupez les troncs aortiques immédiatement après l’endroit où ces arcs se séparent.
- Observez les trois lobes du foie (Figure 3A). Saisissez la lèvre du lobe gauche (à droite du spectateur) et soulevez-la doucement pour que les canaux hépatiques et kystiques soient visibles. Prélevez un échantillon des 2/3 inférieurs du lobe, sous ces attaches (figure 3B).
- Identifiez la vésicule biliaire, dont la couleur peut varier considérablement. Saisissez la vésicule biliaire, retirez-la du lobe droit du foie et sectionnez son attache (Figure 3C). S’il n’éclate pas, rompez-le avec des ciseaux d’iridectomie.
- Saisissez l’apex du poumon et tirez-le tendu. Notez la texture des alvéoles et déterminez où cette texture se termine et où commence la bronche. Coupez à cette marge (figure 3D). Si le poumon est fusionné au péritoine, détachez-le soigneusement.
- Identifiez l’ovaire, qui est enveloppé d’une couche de péritoine viscéral appelée épithélium germinal. Déplacez doucement les lobes jusqu’à ce qu’ils soient sur leurs côtés respectifs pour rendre la zone d’attache visible (Figure 4A) ; Ces attaches sont directement ventrales au rein apparié. À l’aide de ciseaux, retirez les ovaires le plus près possible des reins, sans les endommager (Figure 4B). Au cours de ce processus, si des ovocytes s’échappent, prélevez-les puis rincez-les.
REMARQUE : L’ablation de l’ovaire est utile pour avoir un meilleur accès aux tissus d’une grenouille femelle. - Inspectez le lobe antérieur (également appelé lobe médian) du foie et notez comment il se connecte à l’estomac et au duodénum par le mésentère (Figure 3A et Figure 4C). Sectionnez le mésentère et le ligament hépatoduodénal à l’aide de ciseaux d’iridectomie. La masse charnue restante est le pancréas et le canal cholédoque.
- Sectionnez la connexion du pancréas et du canal cholédoque au lobe antérieur du foie, en laissant une marge. Saisissez l’estomac avec une pince dentée et une extrémité du pancréas avec une pince à tissus. Sous grossissement, retirez doucement le pancréas de l’estomac (Figure 4D).
- Si le pancréas ne se détache pas proprement, retirez le tissu pancréatique restant. Alternativement, détachez méthodiquement le pancréas à l’aide de ciseaux d’iridectomie et de pinces à tissus.
REMARQUE : En plus du canal cholédoque, on s’attend à ce qu’un peu de mésentère et de canal pancréatique soient inclus dans cet échantillon.
- Si le pancréas ne se détache pas proprement, retirez le tissu pancréatique restant. Alternativement, détachez méthodiquement le pancréas à l’aide de ciseaux d’iridectomie et de pinces à tissus.
- Identifiez la rate et prélevez-la en coupant son attache au péritoine (figure 4E).
- Retirez et éliminez les tissus hépatiques restants.
- Retirez l’autre poumon et la bronche restante à l’endroit où ils se fixent au larynx. En saisissant le larynx par son extrémité inférieure, commencez à le soulever hors de la cavité, sectionnant les attaches claires au fur et à mesure qu’elles deviennent apparentes.
- Au fur et à mesure que le larynx est soulevé, son attachement à l’œsophage deviendra perceptible. Pelez soigneusement et coupez le tissu œsophagien du larynx à l’aide de ciseaux d’iridectomie incurvés (Figure 5A). Ensuite, tirez le larynx vers le bas et coupez-le loin de la cavité buccale. Coupez tous les attachements clairs qui deviennent apparents.
- Remarquez la courbure de l’estomac, qui le différencie de l’œsophage, ainsi que la restriction pylorique qui différencie l’estomac des intestins (Figure 5B). Coupez le tube digestif immédiatement en avant de la courbure de l’estomac, en le séparant de l’œsophage.
- Ouvrez la bouche et identifiez l’ouverture commune des trompes d’Eustache sur son toit16. La bouche ouverte, tirez sur l’œsophage pour noter son attachement (Figure 5C). Soulevez l’œsophage hors de la cavité, en sectionnant les attaches claires en cours de route. Sectionnez l’œsophage de la cavité buccale immédiatement en dessous de l’ouverture eustache.
- Saisissez l’estomac et coupez-le à l’endroit où il rencontre le duodénum, au niveau de la restriction pylorique (Figure 5A,B).
- Tirez le côlon tendu et coupez-le le plus près possible du cloaque (Figure 5D). Tirez les intestins vers l’extérieur, en sectionnant toutes les attaches péritonéales claires.
- Si la grenouille est un mâle, identifiez les testicules et retirez-en un à l’aide de ciseaux d’iridectomie, en prenant soin de ne pas endommager le rein sous-jacent (Figure 6A).
- Séparez les corps gras de manière à ce qu’ils soient sur leurs côtés respectifs ; La zone au-dessus du rein, où le corps adipeux se connecte au péritoine, sera visible. Saisissez la base de l’un ou l’autre corps adipeux et utilisez des ciseaux pour l’éloigner du péritoine, en laissant une marge (Figure 6B).
- Identifiez et retirez la vessie en coupant le plus près possible du cloaque (Figure 6C).
- Si la grenouille est une femelle ou si elle a un oviducte vestigial distinct, saisissez l’extrémité inférieure de l’oviducte, retirez-la du cloaque et coupez-la aussi près que possible du cloaque (figure 6D). Retirez l’oviducte de la cavité cœlomique, en sectionnant toutes les attaches péritonéales au fur et à mesure qu’elles deviennent apparentes (Figure 6E).
- Retirez et jetez les corps adipeux restants et les testicules ou l’oviducte.
- À l’aide d’une pince, saisissez les reins à leur base inférieure et notez qu’ils sont recouverts par le péritoine clair (rétropéritonéale)17. Sectionnez le péritoine à la base du rein (figure 7A), puis soulevez les reins hors de la cavité cœlomique (figure 7B), à l’aide de ciseaux, pour sectionner le péritoine au besoin.
- Sous grossissement, coupez l’excès de péritoine et tout tissu adipeux restant, ovaire ou testicules.
- Observez le faisceau de nerfs périphériques qui relie l’extrémité de la colonne vertébrale à chaque jambe ; Il s’agit du plexus sciatique. Saisissez le faisceau de nerfs à l’aide d’une pince et sectionnez-le à l’endroit où il sort de la cavité cœlomique (Figure 7C). Soulevez le faisceau hors de la cavité et coupez-le à l’endroit où les nerfs quittent la colonne vertébrale (Figure 7D).
- Retirez les goupilles de l’animal, retournez-le sur son ventre et épinglez à nouveau les membres de l’animal. Sélectionnez l’une ou l’autre des pattes postérieures à échantillonner et épinglez le pied de ce membre.
- Retirez un lambeau de peau en forme d’amande sur le gastrocnémien/tibiofibule (Figure 8A, B).
- Saisissez la peau du dos et coupez-la latéralement de manière à ce qu’il y ait une coupe continue autour de la section médiane de l’animal (figure 8C).
- Retirez les goupilles, fixez les pattes d’une main et saisissez la peau dorsale antérieure avec une pince dentée. Écorchez l’animal en tirant la peau dorsale sur la tête et les bras, en utilisant la force (figure 8D).
- Identifiez la masse graisseuse recouvrant l’articulation de la mâchoire, sectionnez le bord postérieur de la masse à partir de laquelle elle est fusionnée aux tissus musculaires roses, puis utilisez des ciseaux d’iridectomie pour la couper de l’os sous-jacent (Figure 9A). En fonction de l’âge et de la maturité de l’animal, un amas de mélanophores apparaîtra (Figure 9B). Coupez la masse de manière à ce qu’aucune attache musculaire ou cartilage ne soit attaché.
- Épinglez l’animal et sélectionnez un œil. Insérez des ciseaux d’iridectomie incurvés dans l’orbite autour de la courbure de l’œil (Figure 9C). Coupez doucement autour de l’œil, en sectionnant les attaches musculaires.
- Faites glisser les ciseaux plus profondément dans l’orbite et détachez le nerf optique, derrière l’œil. Utilisez ces ciseaux pour déloger l’œil hors de l’orbite, puis réduire davantage les attaches musculaires.
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Résultats
En suivant toutes les étapes de ce protocole, le ventricule cardiaque, le tronc artériel, le lobe hépatique gauche, la vésicule biliaire, le poumon, le pancréas, la rate, le larynx, l’œsophage, l’estomac, les intestins, les testicules, les corps adipeux, l’oviducte, les reins appariés, le plexus sciatique, la peau, le thymus et l’œil entier ont été proprement excisés dans l’heure qui a suivi l’euthanasie (voir figure 1, figure 2, fig...
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Discussion
Le protocole présenté ici est conçu pour offrir de la flexibilité aux utilisateurs de différents niveaux d’expérience tout en assurant la collecte des tissus essentiels en temps opportun et de manière efficace. Il est conseillé aux nouveaux utilisateurs de suivre chaque étape du protocole comme décrit pour assurer le prélèvement systématique de tissus. Cependant, les utilisateurs plus expérimentés peuvent choisir de sauter certaines étapes et de n’échantillonner que les tissus dont ils o...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention OD R24 des NIH ODO31956. Nous tenons également à remercier Samantha Jalbert et Jill Ralston pour leur aide et leur soutien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1x PBS ; | Corning | 21-040-CV | |
| Loupe 5x avec lumière LED et support | amazon.com | la lumière B08QJ6J8P1 | ne doit pas produire de chaleur |
| Pipettes de transfert jetables | VWR | 414004-036 | |
| Pince à pointes fines de dissection | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Ciseaux de dissection piont pointus, droits 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Plateau de dissection | Fisher Scientific | 14-370-284 | sont une alternative acceptable |
| Conteneur d’euthanasie | US Plastic ; | Objet ; 2860 | contenants opaques alternatifs acceptables |
| Couvercle de récipient d’euthanasie | US Plastic ; | Objet ; 3047 | |
| Ciseaux d’iridectomie 6 | "VWR | 470018-938 | ciseaux à iris sont une alternative acceptable |
| MS-222 : Syncaine (anciennement tricaïne) | Pentair AES | TRS1 | |
| 5,5 po, acier inoxydable | Fisher Scientific | S08100 | |
| Bicarbonate de sodium, poudre, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Pince à échantillons, dentelée | VWR | 82027-442 | |
| Goupilles en T pour la dissection Fisher | Scinetific | S99385 |
Références
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Réimpressions et autorisations
