Fabrication reproductible de SPOT en tant que plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage

Résumé

Ce protocole documente la fabrication et l’assemblage de SPOT, une plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage, dans des formats à 96 et 384 puits. Il détaille également le processus d’ensemencement de SPOT, à la fois manuel et à l’aide d’un manipulateur de liquide disponible dans le commerce.

Résumé

Les organoïdes dérivés de patients (OLO) sont de plus en plus utilisés dans le domaine de la recherche sur le cancer pour modéliser les tumeurs. Ils combinent les avantages des modèles in vivo et des modèles in vitro traditionnels, récapitulant la complexité et l’hétérogénéité des tissus tout en restant constitués de cellules humaines. L’essor des modèles PDO physiologiquement représentatifs a suscité le besoin de dispositifs permettant une analyse simple du comportement des organoïdes. Ce protocole explique comment assembler et utiliser la plate-forme SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues), un dispositif de culture d’organoïdes tridimensionnel (3D) à haut débit. Cette plateforme élimine le ménisque généralement formé par les hydrogels ensemencés pour permettre une imagerie précise et rapide, similaire au processus d’imagerie pour les cultures bidimensionnelles (2D). Par conséquent, les organoïdes et les co-cultures ensemencés dans SPOT peuvent facilement être imagés à l’aide de la microscopie à haut débit. Conçu pour une utilisation standard, SPOT est accessible aux chercheurs ayant une expérience de base de la culture tissulaire et est compatible avec les flux de travail d’ensemencement manuels et automatisés. Ce protocole détaille la fabrication de SPOT aux formats 96 et 384 puits, y compris les instructions étape par étape pour l’assemblage, l’ensemencement, le contrôle de la qualité et le dépannage. Alors que la fabrication nécessite 3 à 4 h, sans compter le temps d’inactivité, plusieurs plaques peuvent être produites simultanément, ce qui améliore l’évolutivité. En rationalisant la culture et l’analyse des AOP, SPOT fournit un outil robuste pour le dépistage de médicaments à haut débit et la recherche translationnelle sur le cancer.

Introduction

Malgré les progrès de la recherche biomédicale, la mise au point de tests in vitro pertinents sur le plan physiologique reste un défi. Un test idéal doit s’adapter à un large éventail de types de cellules, de formulations de traitement, de délais, d’instruments commerciaux et de lectures analytiques pour répondre aux besoins des chercheurs de diverses disciplines. Cependant, en raison du manque d’outils adaptés, les chercheurs s’appuient souvent sur des modèles simplistes, tels que les monocouches 2D de lignées cellulaires immortalisées, qui ne parviennent pas à récapituler la complexité et la pertinence clinique, en particulier dans la recherche sur le^cancer1,2. Pour y remédier, les biobanques tumorales à grande échelle et la collaboration des cliniciens ont conduit au développement de modèles in vitro haute fidélité tels que les organoïdes tumoraux dérivés de patients (APO), qui conservent des profils génétiques et thérapeutiques plus spécifiques au patient par rapport aux lignées cellulaires ^3,4,5. Parallèlement, les progrès en matière d’automatisation des laboratoires et de découverte de médicaments exigent des plateformes qui s’intègrent de manière transparente dans les flux de travail à haut débit. Bien que les plateformes existantes abordent soit la fidélité biologique, soit l’évolutivité, peu d’entre elles ont été en mesure de résoudre les deux défis simultanément ^6,7,8. Le développement de modèles automatisés à haut débit qui reproduisent les principales caractéristiques des maladies est crucial pour faire progresser la recherche biomédicale et accélérer la génération de données pour les applications translationnelles.

De nombreux modèles émergents visent à relever les défis associés à la culture de types de cellules spécialisés, tels que les AOP, à haut débit (Figure 1). Les plates-formes standard, où les organoïdes sont mélangés à de l’hydrogel dans des plaques de 96 ou 384 puits, présentent plusieurs limites : (i) un volume élevé de gel cellulaire entraîne un accès inégal aux nutriments, (ii) la courbure du ménisque crée des artefacts d’imagerie et des gradients cellulaires, (iii) l’ensemencement d’hydrogel manque d’uniformité entre les lots et le personnel, (iv) incompatibilité avec la fabrication automatisée et la microscopie automatisée, et (v) l’utilisation d’une matrice extracellulaire (ECM) qui est généralement un échantillon de risque mou et fragile destruction à des densités tissulaires physiologiques ou incorporation de types de cellules contractiles ^1,9. À l’heure actuelle, la majorité des études PDO sur plaque sont menées soit par ensemencement manuel du gel cellulaire dans la plaque^10,11, soit par une méthode de recouvrement de gel, où l’hydrogel est dilué avec un milieu moins visqueux, et les cellules sont centrifugées au fond du puits pour les placer dans le plan optique approprié^12,13. Les deux approches ne parviennent pas à fournir un soutien mécanique à la culture à long terme. D’après nos observations précédentes (données non publiées), l’hydrogel commercial mélangé à des cellules dans des plaques de puits standard se contracte à partir des surfaces du puits pour 9 puits sur 12 sur 12 sur 12 jours, tandis que la méthode de recouvrement de gel manque d’interactions physiologiques cellule-matrice. De plus, les cultures résultantes ne peuvent pas être maintenues pendant de longues périodes en raison de l’espace limité à l’intérieur du puits et sont incompatibles avec les tests qui nécessitent un rapport réactif/cellule-milieu élevé 14,15,16. Ces obstacles pratiques entravent l’adoption de modèles 3D et limitent la reproductibilité expérimentale sur le terrain.

Figure 1 : Évaluation des modèles de culture en fonction de l’évolutivité et de la pertinence biologique. Le positionnement relatif de divers systèmes de culture in vitro et in vivo en fonction de l’évolutivité (axe y), défini par le débit de plaques, et de la pertinence biologique (axe x), mettant en évidence les compromis entre le potentiel de débit et la fidélité physiologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Motivés par ces défis, la porosité élevée et le renforcement mécanique d’un échafaudage mince en cellulose ont été mis à profit pour développer la plate-forme SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues), disponible en formats 96 et 384 puits. SPOT intègre un échafaudage pré-structuré en polymère à l’aide d’une méthode d’infiltration¹⁷ précédemment développée qui correspond à la disposition de la plaque, permettant un placement précis des gouttelettes de gel cellulaire et fournissant un support structurel pour la phase hydrogel (Figure 2A). La mèche capillaire dans l’échafaudage guide la solution cellule-gel, formant un réseau de biocomposites à force mécanique (Figure 2B). En raison de la structure poreuse de l’échafaudage, le cellule-gel s’infiltre et forme une fine couche (environ 70 μm d’épaisseur), nécessitant dix fois moins de cellule-gel pour couvrir le fond du puits¹⁴. La compatibilité de SPOT avec l’ensemencement d’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) a également été démontrée par l’évaluation de leur croissance à l’aide de tests métaboliques et de mesures basées sur l’image. Depuis sa mise au point, SPOT a fait preuve d’une grande polyvalence et d’une grande facilité d’utilisation pour les chercheurs qui pratiquent la culture d’organoïdes. De plus, la conception de SPOT permet une évolutivité conviviale, avec des volumes de réactifs réduits et des capacités d’imagerie améliorées grâce à sa géométrie de microgel plate et sans ménisque, garantissant une pénétration uniforme de la lumière et une imagerie précise à haut contenu¹⁴ (Figure 2C,D). SPOT soutient également la co-culture avec d’autres types de cellules pertinentes, tels que les fibroblastes, pour mieux récapituler le microenvironnement tumoral¹⁸.

Figure 2 : Vue d’ensemble de l’appareil 96-SPOT et du flux de travail d’analyse d’images. (A) Représentation schématique de la fabrication des plaques SPOT : l’appareil est assemblé en assemblant une plaque commerciale sans fond (en haut), un échafaudage à motif PMMA (en bleu) et un film de polycarbonate (en bas) à l’aide de couches d’adhésif polyacrylique double face (en jaune). (B) Ensemencement des cellules dans le puits de l’échafaudage : les cellules sont suspendues dans un hydrogel non polymérisé (en rose) et pipetées dans chaque puits où elles s’infiltrent dans l’échafaudage. On laisse ensuite l’hydrogel se gélifier pour encapsuler les cellules dans l’hydrogel soutenu par un échafaudage. (C) Microscopie : le microtissu résultant peut être imagé à l’aide de la microscopie automatisée à grand champ. (D) Analyse basée sur l’image : Les images acquises de cellules fluorescentes (vertes) en suspension dans du gel peuvent être analysées à l’aide de pipelines d’analyse d’images standard. Image représentative de microscopie à épifluorescence de cellules KP4 exprimant la GFP dans un puits 96-SPOT. La barre d’échelle est de 500 μm. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁴. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un autre avantage de SPOT est que le système peut être intégré à un manipulateur de liquides open source, ce qui facilite la fabrication automatisée et reproductible de cultures PDO. Cette avancée réduit la variabilité des utilisateurs et prend en charge des conceptions expérimentales complexes, y compris le criblage de médicaments à haut débit et les approches de médecine personnalisée¹⁸. Il a également été démontré précédemment que SPOT est compatible avec la caractérisation multiplexée des phénotypes cellulaires dans des environnements tumoraux hétérogènes et la récupération des cellules à la demande de SPOT par digestion¹⁸. Ces caractéristiques positionnent SPOT comme un outil polyvalent pour les applications de criblage, où des données longitudinales à haute résolution sont essentielles pour évaluer l’efficacité des médicaments et le comportement cellulaire dans des conditions physiologiquement pertinentes^14,18. En combinant ces innovations techniques, SPOT s’attaque aux limites critiques des systèmes de culture 3D traditionnels.

Ce protocole fournit un guide complet pour la fabrication de composants SPOT, l’assemblage de plaques et les méthodes d’ensemencement pour des cultures d’organoïdes 3D robustes et reproductibles. Il comprend des instructions détaillées pour l’ensemencement manuel des plaques à l’aide d’une micropipette et des flux de travail d’ensemencement automatisés avec un manipulateur de liquides, qui prend en charge les formats 96 et 384 puits. De plus, ce protocole décrit les mesures essentielles de contrôle de la qualité, telles que la vérification de la distribution uniforme du gel et de l’intégrité de l’échafaudage, afin de maintenir des normes expérimentales élevées. Des stratégies de dépannage sont également fournies pour résoudre les problèmes courants, tels que l’infiltration incomplète de gel, l’évaporation pendant l’ensemencement et le détachement de l’échafaudage, fournissant aux chercheurs des solutions pratiques pour optimiser leurs flux de travail et obtenir des résultats fiables.

SPOT est conçu pour combler les lacunes auxquelles sont confrontés les tests organoïdes traditionnels, y compris les défis liés à la réalisation de tests et de changements de supports tout en préservant l’intégrité du gel 10,11,12,13. L’objectif global de cette méthode est de fabriquer une plate-forme soutenue par un échafaudage qui soutient la culture d’organoïdes sur une période de 12 jours. De plus, cette méthode couvre également la génération de réseaux de tissus dans SPOT par le biais d’un ensemencement manuel ou assisté par un manipulateur de liquides pour permettre aux utilisateurs d’effectuer toute perturbation en aval, y compris les tests de médicament IC50 et le criblage de petites molécules.

Protocole

Dans ce protocole, les organoïdes de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) ont été utilisés à titre d’exemple. Ces organoïdes ont été établis à partir de patients de l’ACPE, achetés à la biobanque du Réseau universitaire de santé du Centre de cancérologie Princess Margaret (identificateur PMLB PPTO.46 du Réseau universitaire de santé, Canada) en vertu d’un protocole conforme aux lignes directrices du comité d’éthique de la recherche de l’Université de Toronto (protocole #36107). Veuillez consulter tous les matériaux, réactifs et équipements requis dans la table des matériaux.

1. Préparation d’une solution de PMMA-acétone (Durée : 20 min + ~8-16 h d’inactivité)

REMARQUE : Une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA)-acétone est utilisée dans le SPOT pour délimiter les puits et prévenir les fuites entre puits. La procédure générale consiste à dissoudre le PMMA solide dans de l’acétone. Auparavant, la solution PMMA-acétone était utilisée pour modeler un échafaudage en papier similaire afin de bloquer les milieux et les échanges gazeux afin d’obtenir l’hypoxie dans un modèle de culture 3D différent¹⁷. Ici, la formule PMMA-acétone est adaptée pour générer des échafaudages infiltrés de PMMA pour la fabrication SPOT.

1. Dans un tube à centrifuger conique de 50 ml étiqueté, ajoutez 1,75 g de poudre de PMMA. Ensuite, dans une hotte, ajoutez 7,84 mL d’acétone et fermez bien le tube pour éviter l’évaporation du solvant.
2. Si la visualisation du motif polymère est nécessaire, ajoutez 5 à 10 gouttes de vernis à ongles dans la solution. Fermez bien le tube de centrifugation. Secouez manuellement le tube pour commencer à mélanger le vernis avec la solution de PMMA-acétone.
   REMARQUE : Pour être cohérent sur plusieurs lots de traçage, diluez une quantité connue de vernis à ongles dans de l’acétone, puis pipetez cette solution sous forme de 7,84 ml d’acétone.
3. Placez la solution de PMMA-acétone sur le mélangeur vortex pendant la nuit pour vous assurer que la solution se dissolve. Conservez la solution de PMMA-acétone à 4 °C pendant 2 semaines maximum, si elle n’est pas ouverte.

2. Fabrication d’échafaudages infiltrés en PMMA

(Chronométrage : Pour le structurage 96-SPOT : 15 min de configuration + 6 min par échafaudage ; pour le modelage 384-SPOT : 15 min de réglage + 10 min par échafaudage)

REMARQUE : La fabrication d’échafaudages infiltrés en PMMA pour 96-/384-SPOT est réalisée exclusivement sur un établi (environnement non stérile). Pour fabriquer des échafaudages 96/384-SPOT, assurez-vous que le logiciel de montage graphique ou la bibliothèque de contrôle du traceur vectoriel correspondant a été installé. Veuillez noter que certaines sous-sections de la procédure s’appliquent à la fois au 96-SPOT et au 384-SPOT, tandis que d’autres sont spécifiques à une seule taille de plaque. Dans ce dernier cas, les options A (pour 96-SPOT) et B (pour 384-SPOT) seront présentées. Pour le motif (A) 96-SPOT, il y a trois couches ; tout d’abord, les lignes d’amorçage établissent un flux constant de la solution de PMMA-acétone ; deuxièmement, le réseau de 96 cercles ; enfin, un modèle de voyageur de commerce (TSP) trace les espaces inter-puits. Pour le modèle (B) 384-SPOT, le premier module contient des lignes d’amorçage ; deuxièmement, la bordure entourant la plaque de puits ; Enfin, une grille est tracée de telle sorte qu’il reste 384 régions. Pour les deux modèles, la taille des puits peut être contrôlée en modifiant le code source, comme l’ont démontré Li et ^al.14.

1. Configuration pour le processus d’infiltration d’échafaudage
   1. Laisser agiter la solution de PMMA-acétone (conservée à 4 °C) pendant 10 min à température ambiante. Laissez le support de tube jusqu’à ce que le traçage commence.
   2. Connectez le traceur à l’alimentation à l’aide du câble d’alimentation. Un voyant vert clignotant indique que l’appareil est allumé. Branchez le câble USB du traceur sur l’ordinateur désigné pour le traçage.
   3. Couvrez le chevalet de la pince avec un morceau de papier sulfurisé. Assurez-vous que toute la surface du chevalet est couverte.
      1. Pour guider le traçage des motifs 96/384-SPOT, préparez un modèle 96/384-SPOT sur une feuille de papier d’imprimante. Effectuez les étapes 2.2-2.3 à l’aide d’un stylo au lieu d’une seringue et du papier d’imprimante à la place du papier sulfurisé et du filtre à thé. Une fois le modèle prêt, positionnez-le sur le chevalet à pince et couvrez-le de papier sulfurisé. Passez à l’étape 2.2 et suivez le protocole pour fabriquer des échafaudages 96-/384-SPOT.
   4. Fixez le papier sulfurisé sur le chevalet à l’aide de pinces à reliure (Figure 3A). Prenez une feuille d’échafaudage (c’est-à-dire du papier filtre à thé) et coupez-la le long des côtés où les deux couches sont fusionnées (figure 3B).
   5. Positionnez le filtre à thé coupé - appelé ci-après échafaudage en papier - sur le chevalet à pince, avec le côté lisse (côté extérieur du filtre à thé) vers le haut. Serrez-le sur trois côtés. Assurez-vous que l’échafaudage en papier est complètement aplati sur le chevalet à pince ; Il ne doit y avoir aucune ride dans la zone de traçage.
2. Tracé de la configuration 96/384-SPOT
   1. Pour configurer le logiciel du traceur et le fichier pour 96-SPOT, suivez l’option 2.2.2 ; Pour configurer le logiciel et le fichier pour 384-SPOT, suivez l’option 2.2.3.
   2. Configuration du logiciel de traçage et du fichier de traçage 96-SPOT
      1. Dans l’application logicielle, ouvrez le fichier SVG pour 96-SPOT (Fichier supplémentaire 1 ; Figure 4A). Dans la barre de menus, accédez à Extensions > Contrôle du traceur (Figure 4B).
      2. Lorsque la nouvelle fenêtre apparaît, ajustez les paramètres pour qu’ils correspondent à la Figure supplémentaire 1. Revenez à l’onglet Tracé de la fenêtre Extension de contrôle du traceur. Laissez cette option ouverte pour plus tard.
   3. Configuration de l’API de la bibliothèque de contrôle du traceur vectoriel et du fichier de traçage 384-SPOT
      1. Ouvrez la fenêtre d’invite de commande (Windows) ou le Terminal (Mac). Entrez la commande pour lancer le bloc-notes informatique interactif désigné. Assurez-vous que le bloc-notes s’ouvre dans un navigateur.
      2. Sélectionnez le fichier de code 384-SPOT (Fichier supplémentaire 2) pour l’ouvrir. À l’aide d’un embout de 20 g (ou d’un embout de 16 g pour le modèle 384-SPOT), aspirez 1 mL de solution de PMMA-acétone à l’aide de la seringue de traçage de 3 mL (figure 3C).
         REMARQUE : La soupape de régulation de débit entre la seringue de chargement de 10 mL et le tube EVA doit être ouverte (parallèlement au cylindre). Comme le processus d’infiltration est entraîné par gravité, assurez-vous que la seringue de traçage de 3 mL est toujours remplie entre le marquage de 0,5 à 1,5 mL afin de maintenir un volume de distribution constant pendant le traçage.
   4. Alors que l’extrémité de la seringue de traçage de 3 mL est encore à l’intérieur de la solution de PMMA-acétone, fermez la soupape de régulation de débit entre la seringue de chargement de 10 mL et le tube EVA (amenez-la perpendiculairement au canon).
   5. Fermez rapidement le tube de solution de PMMA-acétone. Chargez la seringue de 3 ml sur le porte-stylo. Ajustez la hauteur de la seringue par rapport au support pour obtenir l’alignement suivant (Figure 3D).
   6. Ajustez la position du chevalet à pince de sorte que l’extrémité de la seringue de 3 ml repose à l’origine du motif tracé (c.-à-d. le point sombre en haut à gauche du motif du modèle). Soulevez le porte-stylo traceur avec la seringue attachée à celui-ci, pour glisser le chevalet à clip en dessous.
   7. Débranchez rapidement la seringue de 10 ml de la tubulure pour permettre à la pression atmosphérique d’exercer une pression sur la solution de PMMA-acétone stockée dans la seringue de traçage de 3 ml. Ouvrez la vanne de régulation de débit.
   8. Pour commencer à tracer le motif 96-SPOT, suivez les étapes 2.2.9 ; pour commencer à tracer 384-SPOT, suivez l’étape 2.2.10.
   9. Lancez le traçage de 96-SPOT dans le traceur désigné comme décrit ci-dessous.
      1. Dans le logiciel, cliquez sur Appliquer dans les extensions de contrôle du traceur. Le traceur va maintenant commencer à fonctionner, traçant le motif PMMA. Aucune autre action n’est nécessaire tant que le traçage n’est pas terminé et que le porte-stylet du traceur ne revient pas à sa position d’origine.
      2. Pour mettre le traceur en pause pendant le traçage, appuyez sur le petit bouton argenté situé sur le côté gauche du traceur. Ensuite, via l’onglet Extensions de contrôle du traceur > Reprendre dans le logiciel graphique, choisissez de reprendre le traçage à partir de l’endroit où il s’est arrêté ou de remettre le porte-stylet à sa position d’origine (Figure supplémentaire 1C(iii)).
   10. Lancez le traçage de 384-SPOT dans l’interface de calcul désignée, comme décrit ci-dessous.
       1. Dans l’interface, cliquez sur Redémarrer le noyau et réexécuter (double flèche sur la barre d’outils). Le code va maintenant commencer à s’exécuter, en traçant le motif PMMA. Aucune autre action n’est nécessaire jusqu’à ce que le motif ait fini de tracer et que le porte-stylet revienne à sa position d’origine.
       2. Pour mettre le traceur en pause pendant le traçage, appuyez sur le bouton Small Silver situé sur le côté gauche du traceur. Déplacez manuellement la tête d’impression complètement vers l’arrière et vers la gauche afin qu’elle atteigne sa position d’origine. Rebranchez le traceur à l’alimentation. Contrairement au traçage 96-SPOT, il n’y a aucun moyen de reprendre le traçage pour 384-SPOT à partir de l’endroit où il a été mis en pause ; Remplacez l’échafaudage en papier et recommencez le code depuis le début.
3. Déchargement de la seringue et nettoyage
   1. Une fois le traçage terminé, rattachez la seringue de 10 ml au tube. Retirez la seringue de 3 ml du porte-stylo traceur et transférez toute solution de PMMA-acétone restante dans le flacon de stock ou jetez-la si une évaporation importante s’est produite au cours des étapes précédentes.
   2. Laver le corps de la seringue de 3 ml en pipetant à l’acétone. Laissez le système de seringue sécher à l’air libre avant de le remettre dans son lieu de stockage.
   3. Détachez soigneusement l’échafaudage SPOT du chevalet à clip.
   4. Inspectez les échafaudages SPOT tracés pour vous assurer qu’ils peuvent être utilisés pour des expériences (Figure 3E,F). Pour obtenir des conseils, reportez-vous au Tableau 1 de dépannage et aux Tableau 2 et 3 de l’assurance et du contrôle de la qualité.
   5. Rangez tous les échafaudages à motif PMMA dans un sac à fermeture éclair dans un endroit frais et sec.

3. Découpe de bande à 96/384 puits

(Durée : pour le motif 96-SPOT : 15 min par 5 morceaux de ruban ; pour le motif 384-SPOT : 30 min par 5 morceaux de ruban)

REMARQUE : Il s’agit de l’un des moyens les plus efficaces de couper des bandes avec précision et efficacité, en particulier pour les modèles de bande à 384 puits. Cette méthode offre également la possibilité de graver au laser une couche du ruban (capot supérieur, plastique) pour améliorer la facilité d’utilisation pendant le processus d’assemblage. Alternativement, les bandes peuvent également être coupées à l’aide de coupe-papier à un rythme plus lent sans le processus de gravure.

1. Ouvrez le fichier de découpe laser de motif de bande à 96/384 puits (Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4) et chargez le motif d’impression codé avec trois couleurs différentes dans le logiciel de découpe laser en cliquant sur Tracer avec les paramètres suivants dans la Figure supplémentaire 2A.
2. Chargez un morceau de ruban adhésif sur la surface de la découpeuse laser et assurez-vous que le ruban est aplati en douceur sur la surface. Utilisez des rubans en papier ou des poids lourds pour maintenir les rubans pendant la coupe.
   REMARQUE : Assurez-vous que le ruban est à plat sur la surface de la découpeuse laser. Toute bosse peut affecter la qualité des bandes coupées, en particulier les bandes à 384 puits.
3. Ajustez l’emplacement du motif d’impression pour l’aligner sur l’emplacement de la bande en fonction du manuel de découpe laser.
4. Coupez les deux bandes à 96/384 puits en utilisant le même réglage de découpe laser que celui illustré à la figure supplémentaire 2B. L’ordre des lignes avec des couleurs spécifiques est important. Coupez d’abord la ligne rouge avant la ligne verte. Coupez le bleu à la fin.
   Ligne rouge : mode Rast/Vest avec une puissance laser de 45 %, une vitesse de 80 %, un PPI de 1000 et un axe Z de 0,50 mm.
   Ligne verte : mode Rast/Vest avec une puissance laser de 7 %, une vitesse de 100 %, 1000 PPI et un axe Z de 0,50 mm.
   Ligne bleue : mode Rast/Vest avec 50 % de puissance laser, vitesse de 80 %, 1000 PPI et axe Z de 0,50 mm.
5. Rangez correctement les rubans à motifs jusqu’à l’assemblage SPOT.

4. Assemblage 96/384-SPOT (Durée : 1 h)

REMARQUE : Cette section décrit en détail la procédure d’assemblage des dispositifs 96/384-SPOT dans un environnement stérile tel qu’une enceinte de biosécurité (ESB). Alternativement, les appareils 96/384-SPOT peuvent être pré-assemblés dans un environnement non stérile, puis stérilisés par un procédé de stérilisation au gaz éthylène.

1. Préparation de l’échafaudage SPOT pour le montage
   1. Prenez un échafaudage à motif PMMA pour 96 ou 384 SPOT. Coupez l’excédent de papier autour de la région bleue de l’échafaudage. Laissez 5 mm d’espace blanc autour du périmètre de la région bleue. La feuille résultante sera d’environ 760 mm x 1300 mm.
      REMARQUE : Ne coupez pas la ligne d’amorçage. Il est utile pour déterminer quel côté de l’échafaudage est rugueux/lisse (Figure 3E,F).
   2. Pour préparer un échafaudage 96-SPOT pour l’assemblage, suivez l’étape 4.1.3. Pour préparer un échafaudage 384-SPOT, suivez l’étape 4.1.4.
   3. Réalisation de la perforation des espaces inter-puits sur l’échafaudage 96-SPOT.
      1. Posez un morceau de film de polyéthylène (1000 mm x 1500 mm) sur un support acrylique rigide (2700 mm x 2700 mm). Placez le support recouvert d’un film de polyéthylène sur la surface de travail et posez l’échafaudage sur le film de polyéthylène (Figure 5A).
      2. Alignez un bord de la règle entre les deux premières rangées de sorte que le traçage le long de ce bord ne trace pas dans un puits.
      3. Placez la roue de traçage contre la règle au bas de l’échafaudage. Faites rouler la roue de suivi vers le haut jusqu’au sommet de l’échafaudage, en utilisant la règle pour guider la trajectoire de la lame. Répétez cette opération pour tous les espaces entre les rangées de l’échafaudage (c’est-à-dire 7x).
      4. Répétez les étapes 4.1.3.2 et 4.1.3.3 pour chaque autre espace entre les colonnes, en commençant par l’espace entre les deux premières colonnes.
   4. N’effectuez aucune perforation des espaces inter-puits sur l’échafaudage 384-SPOT en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Ne percez pas les inter-puits de l’échafaudage 384-SPOT. Passez directement à l’étape 4.2.
2. Stérilisation des matériaux SPOT et des équipements d’assemblage
   1. Placez l’échafaudage imprimé, deux bandes à 96 puits (ou bandes à 384 puits), une plaque sans fond à 96 puits (ou une plaque sans fond à 384 puits), un couvercle de plaque à 96 puits (ou un couvercle de plaque à 384 puits), un film polypolycarbonate, une plaque de polydiméthylsiloxane (PDMS), un sac en plastique refermable, une pince à épiler et un couteau de précision dans l’ESB, à l’aide d’un UV pendant 20 minutes (Figure 5B).
   2. Retournez tous les matériaux et équipements d’assemblage de l’autre côté et UV pendant encore 20 min.
3. Fixation de l’échafaudage sur le premier ruban à 96/384 puits
   1. Posez l’échafaudage à l’envers (figure 3F) sur la dalle PDMS, de sorte que les rangées soient horizontales. Utilisez la ligne d’amorçage pour déterminer quel côté est rugueux (la ligne d’amorçage alignée à droite indique le côté rugueux vers le haut).
   2. Lissez l’échafaudage sur la dalle PDMS de manière à ce qu’il n’y ait pas de plis ou de bulles sur (ou en dessous) de l’échafaudage. Retirez la couche protectrice du côté non gravé du ruban adhésif double face. Bouclez légèrement le milieu du ruban et alignez les deux colonnes du milieu du ruban avec l’échafaudage.
   3. Une fois aligné, appuyez sur le milieu du ruban vers le bas. Lissez le ruban sur l’échafaudage, en commençant par le milieu et en allant vers l’extérieur.
      REMARQUE : Un échafaudage mal aligné aura un motif PMMA évident qui se chevauche dans la zone de bien ensemencement.
   4. Utilisez la pince à épiler pour retirer soigneusement l’échafaudage de la dalle PDMS et stocker la dalle pour de futures fabrications.
4. Fixation de l’échafaudage sur un deuxième ruban à 96/384 puits
   1. Placez l’échafaudage sur l’établi. Retournez l’échafaudage de manière à ce que le côté lisse (côté non scotché) soit orienté vers le haut.
   2. Retirez la couche protectrice intermédiaire du côté gravé du deuxième ruban. Assurez-vous que les deux colonnes centrales du ruban sont exposées. Si le modèle de ruban non gravé est utilisé, retirez complètement la couche protectrice d’un côté.
   3. Bouclez légèrement le milieu du ruban et alignez les deux colonnes du milieu du ruban avec l’échafaudage.
   4. Une fois que le ruban est aligné sur l’échafaudage, appuyez sur le milieu du ruban vers le bas. Si le motif du ruban gravé est utilisé, retirez les deux autres couches protectrices adjacentes à la partie centrale exposée du ruban. Lissez le ruban sur l’échafaudage, en commençant par le milieu et en allant vers l’extérieur.
5. Fixation de l’échafaudage sur la plaque sans fond
   1. Retirez la couche protectrice du ruban adhésif du côté rugueux de l’échafaudage. Si vous utilisez le motif de ruban gravé, retirez uniquement la couche de protection intermédiaire.
   2. Alignez l’échafaudage sur la face inférieure de la plaque sans fond (avec un couvercle). Une fois aligné, appuyez le milieu de l’échafaudage sur le dessous de la plaque. Si vous utilisez le motif gravé, retirez les couches protectrices adjacentes au milieu exposé. Lissez l’échafaudage sur la plaque du milieu vers l’extérieur.
6. Fixation de l’échafaudage sur le film polycarbonate
   1. À l’aide d’une pince à épiler, desserrez soigneusement la couche protectrice du film de polycarbonate. Une fois desserré, décollez lentement la couche protectrice du film. Ne créez pas d’indentations dans le film, car cela affecterait ses propriétés optiques pour l’imagerie microscopique.
   2. Répétez l’étape 4.6.1 avec l’autre côté du film de polycarbonate. Une fois les deux couches protectrices retirées, mettez le film de côté sur l’établi.
   3. Retirez la couche protectrice du ruban adhésif fixé au bas de la plaque. Appuyez le film de polycarbonate sur l’échafaudage, en commençant par le milieu vers l’extérieur.
   4. Appuyez fermement le film de polycarbonate sur le fond de la plaque de sorte que tous les puits obtiennent une bordure bien prononcée.
   5. À l’aide d’un couteau de précision, coupez soigneusement l’excédent de matériau du fond de la plaque.
      REMARQUE : Faites très attention à ne pas couper dans la plaque ou l’un des puits. Si le couteau ne coupe pas facilement, vérifiez s’il coupe dans la plaque.
7. Stockage du 96/384-SPOT après montage
   1. Après avoir entièrement assemblé 96-SPOT, placez-le dans un sac en plastique transparent refermable. Apportez le sac à l’extérieur de la BSC.
   2. Placez un support en acrylique rigide sur la face inférieure de l’assiette. Fixez le support en acrylique à la plaque sur les coins opposés (Figure 5C). Maintenir serré pendant au moins 30 minutes à chaque coin avant utilisation.
   3. Rangez la plaque dans un endroit propre et sec jusqu’à utilisation.

5. Ensemencement 96/384-SPOT (Durée : 2 h 45 min)

REMARQUE : Cette section décrit en détail la procédure d’ensemencement des appareils 96/384-SPOT pour créer des microtissus 3D uniformes. Le processus d’ensemencement consiste à distribuer soigneusement un volume défini de cellule-gel (par exemple, 5 μL pour le 96-SPOT ou 2 μL pour le 384-SPOT) sur l’échafaudage SPOT pré-assemblé. Pour assurer une infiltration et une distribution uniformes du gel, la gouttelette de gel cellulaire est guidée le long de la structure poreuse de l’échafaudage par évacuation capillaire. Cette étape peut être effectuée manuellement à l’aide d’une micropipette ou automatisée avec manipulation de liquides. Après l’ensemencement, les plaques sont incubées à 37 °C pour permettre la polymérisation du gel et l’encapsulation cellulaire.

1. Préparation de la plaque 96/384-SPOT
   1. Défixez le 96-/384-SPOT et retirez le support en acrylique par le bas.
   2. Dans un BSC, retirez SPOT du sac en plastique. Allumez l’UV pour stériliser l’intérieur de la plaque et couvrez pendant 20 minutes avant de fermer le couvercle et de retourner vers le bas de la plaque pour 20 minutes supplémentaires de traitement UV.
   3. Pipeter 70 μL de PBS dans chaque espace interpuits de la plaque 96-SPOT. Ne pipetez pas le PBS dans la plaque 384-SPOT. Réfrigérer la plaque à 4 °C pendant au moins 30 minutes avant l’ensemencement.
2. Préparation des cellules
   1. Détachez les cellules des flacons de culture ou les organoïdes des dômes de gel en fonction de la manipulation recommandée et comptez la quantité de cellules à l’aide de l’hémocytomètre selon les instructions du fabricant. Notez la densité cellulaire de la suspension cellulaire (c.-à-d. le nombre de cellules par ml) pour calculer le volume de suspension cellulaire requis pour les étapes 5.4.1 à 5.4.2 en fonction de la densité d’ensemencement souhaitée.
3. Préparation du gel
   1. En suivant les instructions de préparation de l’hydrogel optimisées précédemment 17,19,20,21, créez l’hydrogel en distribuant 1 mL de collagène bovin de type 1 à 3 mg/mL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
      REMARQUE : Les composants et le mélange obtenu doivent être conservés sur de la glace pendant toute la durée de la préparation.
   2. Verser 125 μL de milieu essentiel minimum concentré (MEM) 10x dans le collagène bovin. Pipetez lentement de haut en bas pour mélanger jusqu’à ce que le mélange passe du rose au jaune.
   3. Verser 8 μL de bicarbonate de sodium 0,8 M dans le mélange de collagène bovin. Pipetez lentement de haut en bas pour mélanger jusqu’à ce que le mélange devienne rose pâle. Utilisez la solution mélangée dans les 30 minutes suivant la préparation pour assurer une gélification constante à travers plusieurs expériences.
      REMARQUE : Si le mélange reste jaune, titrer la solution à pH 7 en ajoutant 0,8 M dans des aliquotes de 0,5 μL jusqu’à l’obtention d’une couleur rose pâle. FACULTATIF : En suivant la même procédure, le gel peut être préparé pour les cultures nécessitant une concentration de collagène plus élevée. Pour la culture d’organoïdes, utiliser le mélange d’hydrogels caractérisé par Landon-Brace et ^al.17.
4. Suspension de cellules dans un gel
   1. Verser le volume de suspension cellulaire nécessaire pour la densité cible du gel cellulaire dans un tube de microcentrifugation et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
   2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le gel (le volume varie en fonction de la concentration cible)
5. Semis manuel des plaques 96/384-SPOT
   1. Placez la plaque 96-/384-SPOT sur un bloc réfrigérant congelé. Pour amorcer 96-SPOT, suivez les étapes 5.5.2. Pour amorcer 384-SPOT, suivez les étapes 5.5.3.
   2. Ensemencement manuel 96-SPOT
      1. Pré-enduire une pointe de pipette de 10 μL avec le mélange cellule-gel. Aspirez 5 μL de gel à l’aide d’une pipette de 20 μL et éjectez-le jusqu’à la première butée jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à l’extrémité. Touchez la gouttelette au milieu d’un puits.
         REMARQUE : L’éjection du gel en appuyant sur la pipette jusqu’à la deuxième butée peut introduire des bulles d’air. Tous les puits doivent être ensemencés dans les 5 minutes pour une gélification uniforme entre les puits.
      2. Après avoir ensemencer tous les puits souhaités, couvrez la plaque et incubez à 37 °C pendant 45 min selon les instructions du fabricant pour polymériser le gel. Versez 200 μL de milieu dans chaque puits ensemencé et incubez pendant au moins 1 heure ininterrompue avant toute imagerie ou perturbation requise.
   3. Ensemencement manuel 384-SPOT
      1. Pré-enduire une pointe de pipette de 10 μL avec le mélange cellule-gel. Aspirez 2 μL de gel à l’aide d’une pipette de 10 μL et éjectez-le jusqu’à la première butée jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à l’extrémité.
         REMARQUE : Une pipette multicanaux de 10 μL est fortement recommandée.
      2. Touchez la gouttelette au milieu d’un puits. Après avoir ensemencer tous les puits souhaités, couvrez la plaque et incubez à 37 °C pendant 45 min selon les instructions du fabricant pour polymériser le gel.
      3. Distribuer 60 μL de milieu dans chaque puits ensemencé et incuber pendant au moins 1 h sans interruption avant toute imagerie ou perturbation requise.
   4. Ensemencement 96/384-SPOT à l’aide d’un manipulateur de liquides
      1. Pendant la préparation du mélange cellule-gel, allumez le manipulateur de liquide et son module de filtre HEPA à haute vitesse. Vaporisez soigneusement de l’éthanol à 70 % à l’intérieur du manipulateur de liquide et essuyez-le avec des serviettes en papier imbibées d’éthanol.
      2. Chargez le protocole d’ensemencement 96-SPOT ou 384-SPOT (Fichier supplémentaire 5 ou Fichier supplémentaire 6) avant d’effectuer l’étalonnage de la tête de pipette. Installez les modules de température dans les emplacements 1 et 4 (Figure 6A).
      3. À des fins d’étalonnage, utilisez des boîtes désignées de pointes de filtre P20 et P200. Chargez-les dans les emplacements 5 et 6, respectivement (Figure 6B). Calibrez la tête de pipette en fonction des invites affichées sur le logiciel. Après l’étalonnage, passez aux boîtes stériles des pointes filtrantes P20 et P200 pour l’ensemencement sur les fentes 5 et 6. Vaporisez à nouveau la surface avec de l’éthanol à 70 % et fermez la porte jusqu’à l’ensemencement.
         REMARQUE : Il est essentiel de calibrer avec précision les pointes sur le dessus de la plaque 96-/384-SPOT. Il est recommandé d’utiliser du ruban d’étanchéité pour aider à visualiser l’axe z des pointes par rapport au haut de la plaque. La position idéale est lorsque les pointes de la tête multicanaux touchent toutes le ruban d’étanchéité de la plaque et créent une petite bosse.
   5. Allumez les deux modules de température et réglez-les à 4 °C pendant que les cellules sont sur la dernière étape de rotation pendant la préparation du mélange cellule-gel. Une fois l’étape 5.4 terminée, chargez la quantité désirée de mélange cellule-gel dans chaque tube des tubes PCR à 8 bandelettes de 0,2 mL à l’intérieur de l’ESB.
      REMARQUE : Le volume minimum de mélange cellule-gel à charger dans chaque tube est de : 96-SPOT : 5 μL multiplié par le nombre de colonnes à ensemencer plus le volume mort ; 384-SPOT : 2 fois 2 μL multiplié par le nombre de colonnes à ensemencer, puis plus le volume mort. Il est recommandé que le volume mort soit d’environ 10 à 20 μL par tube pour éviter les bulles et les colonnes incomplètes vers la fin.
   6. Fermez les tubes PCR à 8 bandes de 0,2 mL à l’aide des capuchons plats à 8 bandes avant de transférer le mélange cellule-gel hors de l’ESB sur de la glace.
   7. Chargez la plaque SPOT pré-réfrigérée sur le module de température de l’emplacement 4 à l’aide du bloc de format de plaque à fond plat (Figure 6B).
   8. Chargez les tubes PCR à 8 bandelettes de 0,2 mL avec un mélange cellule-gel sur le module de température de l’emplacement 3 avec le bloc de format à 96 puits.
   9. Ouvrez les bouchons plats et le couvercle de la plaque SPOT et rangez-les à l’intérieur du manipulateur de liquides, mais loin des fentes utilisées. Ouvrez le couvercle de la boîte des embouts de filtre P20 et P200.
   10. Exécutez le protocole. Après avoir ensemencer tous les puits souhaités, couvrez la plaque et incubez à 37 °C pendant 45 min selon les instructions du fabricant pour polymériser le gel.
   11. Distribuer 200 μL ou 60 μL (96-/384-SPOT) de milieu dans chaque puits ensemencé et incuber pendant au moins 1 h sans interruption avant toute imagerie ou perturbation requise.

Résultats

Le motif PMMA de l’échafaudage en papier sert de barrière physique pour empêcher l’échange de contenu entre les puits. Cette conception est essentielle pour garantir que les puits adjacents restent isolés chimiquement et biologiquement, empêchant la diffusion involontaire de fluides, de médicaments, de facteurs sécrétés ou même de cellules¹⁴. L’incorporation de PMMA permet une compartimentation précise, ce qui fait de SPOT une plate-forme fiable pour le criblage à haut débit et les études de co-cu...

Discussion

Dans ce protocole, un guide détaillé pour la fabrication et l’utilisation de SPOT à 96 et 384 puits est fourni, couvrant l’assemblage, le manuel et l’ensemencement de gels cellulaires assisté par manipulateur de liquides. Contrairement aux systèmes traditionnels de bouchons d’hydrogel, SPOT élimine les artefacts liés au ménisque, facilitant l’imagerie in situ non destructive des organoïdes, comme décrit précédemment 14,16,22.^<...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes PCR de 0,2 ml (bandelettes de 8)  ;	Sarstedt	72.985.002
Tube à centrifuger de 1,5 ml	FroggaBio	LMCT1.7B
1000-&mu ; L pointes de pipette	Éclipse	4-1019-260-000
Pipettes sérologiques de 10 mL	FroggaBio	394010
Seringue de 10 ml	BD, Canada	302995
10x Support essentiel minimal (MEM 10x)	Gibco	11430030
Plat de 150 mm	Corning	430599
Embouts de distribution de calibre 16 avec connexion Luer lock	McMaster-Carr, Illinois, États-Unis	Référence 6699A2
20 et micro ; Racks de filtres L	Les Opentrons	999-00099
200 et micro ; Racks de filtres L	Les Opentrons	999-00081
200-&mu ; L pointes de pipette	Éclipse	4-1030-260-000
Embouts de distribution de calibre 20 avec connexion Luer lock	McMaster-Carr, Illinois, États-Unis	Référence 6699A4
Plaque de puits sans fond de 384 puits (noire)	Greiner	82051-544
Seringue de 3 ml  ;	BD, Canada	309657
Tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 mL	VWR	CA21008-940
Tube à centrifuger conique en polypropylène de 50 mL	VWR	CA21008-940
Plaque de puits sans fond de 96 puits (noire)	Greiner	82050-714
Acétone	Fisher Scientific	Réf. A18-1
Balance analytique	N/A	N/A
Extension AxiDraw pour Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)	N/A	N/A
API Python AxiDraw (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)  ;	N/A	N/A
AxiDraw V3 Machine à écrire et à dessiner personnelle haute performance	Evil Mad Scientists, États-Unis	N/A
Collagène bovin (PureCol 3 mg/ml)	BioMatrice avancée	5005
Lignée cellulaire de votre choix	N/A	N/A
Chevalet à clip (inclus dans l’emballage AxiDraw V3)	Evil Mad Scientists, États-Unis	N/A
Milieux de culture de choix	N/A	N/A
Ruban de protection contre la saleté	3M	6851 PN36851
Ruban adhésif polyacrylique double face (800 mm x 1200 mm)	Recherche sur les adhésifs, ARcare	Référence 90106NB
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	12483-020
Filtres à thé Finum XL  ;	Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hambourg, Allemagne	420.69.00
Bouchons plats pour tubes PCR de 0,2 ml (bandes de 8)	Sarstedt	65.989.002
Pinces à ressort en plastique robustes	POINT DE RÉFÉRENCE	1024-554
Module HEPA &ndash ; Modèle 110-130V 60Hz	Les Opentrons	999-00109
Sac de glace (congelé, 1400 mm x 1800 mm)	N/A	N/A
Logiciel Inkscape	N/A	N/A
Découpeuse laser	Système laser universel	VLS3.75
Tube miniature en éthyl-acétate de vinyle (EVA) de 0,07 pouce de diamètre extérieur	McMaster-Carr, Illinois, États-Unis	1883T3
Pipette électronique multicanaux P20 (Gen2)	Les Opentrons	999-00005
Pipette électronique multicanaux P300 (Gen2)	Les Opentrons	999-00006
Vernis à ongles	Sally Hansen	Réf. SBS-006861	En option, pour la pigmentation de l’encre PMMA
Opentrons OT-2	Les Opentrons	999-00111
Pipette P1000	Gilson	FA10006M
Pipette 8 canaux P200	Gilson	F144072
Pipette P200	Gilson	FA10005M
Essuie-tout	N/A	N/A
Parafilm	Société Bemis, Inc.	52859-079
Papier sulfurisé  ;   ;	N/A	N/A
Pipettes Pasteur	VWR	14672-380
Pénicilline-streptomycine (P/S)	Sigma-Aldrich	Réf. P4333
Poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA)	Sigma-Aldrich	182230
Film polycarbonate (760 mm x 1300 mm)	McMaster-Carr	Référence 85585K102
Polydiméthylsiloxane monomère et réticulant (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)	Adhésifs Ellsworth	4019862
Couteau de précision	N/A	N/A
Support acrylique rigide (taille ajustée au fond de la plaque de puits)	McMaster-Carr	Référence 8560K239
Support en carton rigide	N/A	N/A
Règle	N/A	N/A
Ciseaux  ;	N/A	N/A
Bicarbonate de sodium (0,8 M dans l’eau distillée)	Sigma-Aldrich	S6014
Plateau de température avec blocs en aluminium (Gen2)	Les Opentrons	999-00097
Roue de traçage  ;	HEEPDD (Amazon)	B07YQWB284
Ruban adhésif transparent  ;	N/A	N/A
Trypan bleu	Gibco	15250-061
Trypsine	Gibco	25200-056
Brucelles	N/A	N/A
Mélangeur vortex  ;	N/A	N/A