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Article de méthode

Automatisation de l’implantation tumorale chez les larves de poisson-zèbre pour la recherche et la médecine du cancer

1.6K vues

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DOI :

10.3791/68441

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19 septembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Norwegian Centre for Molecular Biosciences and Medicine (NCMBM), University of Oslo, 2Life Science Methods BV, 3BioReperia AB, 4ZeClinics SL, 5Division of Diagnostics and Specialist Medicine, Linköping University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’implantation automatisée de xénogreffes tumorales dans des larves de poisson-zèbre à l’aide d’un système d’injection robotisé de pointe. De plus, nous présentons des vidéos d’injection et des données de validation démontrant les performances réussies du système.

Résumé

Les injections de larves de poisson-zèbre, y compris la xénogreffe de tumeurs sous-cutanées et orthotopiques cérébrales ainsi que l’administration de médicaments par voie intraveineuse, sont devenues des techniques centrales dans la recherche sur le poisson-zèbre. Cependant, ces procédures restent fastidieuses, techniquement difficiles et fortement dépendantes des compétences de l’opérateur, ce qui limite le débit et la reproductibilité. Pour remédier à ces limitations, nous introduisons un système robotique avancé qui automatise les micro-injections dans les larves de poisson-zèbre, améliorant ainsi considérablement l’efficacité, la précision et la reproductibilité par rapport aux injections manuelles. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour le fonctionnement de l’injecteur automatisé, un système à haut débit capable de délivrer des liquides, des particules ou des cellules cancéreuses sur trois sites anatomiques différents avec une précision et une vitesse supérieures à celles des chercheurs formés au poisson-zèbre. Nous décrivons les étapes essentielles, y compris la configuration, les étalonnages, les procédures d’injection et le dépannage, pour garantir des performances optimales. De plus, nous fournissons des exemples représentatifs de résultats de l’utilisation du robot et discutons de son potentiel à faciliter les injections larvaires à grande échelle, y compris pour le dépistage de médicaments et la médecine de précision. En intégrant un injecteur automatisé dans les flux de travail, les chercheurs peuvent surmonter les limites des injections manuelles et accélérer la découverte préclinique de médicaments et la sélection de traitements personnalisés.

Introduction

À mesure que notre compréhension du comportement du cancer et de la résistance aux médicaments s’améliore, il est devenu de plus en plus évident qu’il est nécessaire d’améliorer le diagnostic, la caractérisation et le ciblage thérapeutique des sous-types de cancer. Au cours des vingt dernières années, les publications dans le domaine de la médecine personnalisée (également connue sous le nom de médecine de précision) ont augmenté 1,2. En effet, la médecine de précision est définie comme la pratique consistant à adapter le traitement médical en fonction des caractéristiques de la maladie de chaque patient3. Cela correspond à notre compréhension actuelle qu’il n’existe pas d’approche médicamenteuse unique, ce qui est devenu particulièrement clair et pertinent dans le traitement du cancer. À l’heure actuelle, cependant, le manque d’approches de médecine de précision cliniquement pertinentes pour la plupart des patients atteints de cancer signifie que le processus de sélection de la stratégie de traitement la plus appropriée se fait par essais et erreurs. Il en résulte des retards importants et un inconfort inutile avec une diminution de la qualité de vie et une survie écourtée. Il est important de noter qu’un patient dont la qualité de vie est diminuée après plusieurs régimes de chimiothérapie inefficaces peut choisir de passer à un traitement palliatif4. Grâce à une méthode de dépistage adaptée et personnalisée, la sélection des médicaments peut être effectuée avec une plus grande précision et sans délai. Bien qu’il soit possible d’effectuer un séquençage génétique et protéomique sur des cellules cancéreuses5, ces données moléculaires sont globalement peu prédictives de l’évolution des patients et ont souvent peu de valeur clinique6. Dans le domaine du développement de médicaments, le fait d’avoir une approche de médecine de précision le plus tôt possible améliore considérablement les taux de réussite aux différentes étapes du développement de médicaments. En effet, le fait de comprendre à un stade précoce quels candidats médicaments ont le profil d’efficacité interindividuel le plus large, ou quels sous-types de cancer sont particulièrement sensibles à chaque candidat médicament, réduit les risques et améliore l’efficacité des essais précliniques tardifs et des essais cliniques7. Avec l’augmentation des coûts de R&D pharmaceutique8, la pression politique croissante pour faire baisser les prix des médicaments 9,10 et les progrès de la validation des cibles pilotée par l’IA11, le besoin d’une méthode de dépistage à grande échelle, efficace et centrée sur la médecine de précision dans le développement de médicaments n’a jamais été aussi grand.

Ici, les poissons-zèbres entrent en scène, en particulier les larves de poisson-zèbre 48 heures après la fécondation (hpf). Les modèles de xénogreffes tumorales basés sur des larves de poisson-zèbre comme hôtes constituent une plateforme de dépistage rapide in vivo pour prévoir les réponses cliniques à la chimiothérapie 6,12,13,14. Les modèles de xénogreffes de tumeurs de poisson-zèbre sont apparus comme une alternative puissante à la fois à la médecine moléculaire de précision (c’est-à-dire les approches génomiques ou de pathologie moléculaire pour guider le choix du traitement des patients atteints de cancer), ainsi qu’aux études de xénogreffes d’organoïdes et de souris pour le développement préclinique de médicaments15,16. Avec les xénogreffes de tumeurs de poisson-zèbre, des cellules tumorales fluorescentes (marquées génétiquement ou chimiquement) sont greffées dans des larves de poisson-zèbre avec une efficacité élevée13. Les médicaments ou candidats-médicaments ayant un mode d’action relativement rapide (par exemple, de sorte qu’ils ciblent directement ou indirectement la viabilité des cellules tumorales via, par exemple, l’activation de la cytotoxicité des lymphocytes T) peuvent ensuite être dépistés en seulement trois jours, ce qui permet d’obtenir des lectures rapides et fonctionnelles de l’efficacité des médicaments anticancéreux et antimétastatiques. Ensuite, une sélection éclairée de la thérapie qui montre une bonne efficacité peut être faite, avec des études montrant que cela devrait se traduire par un résultat de traitement solide pour le patient ou une chance de succès dans un projet de développement de médicament respectivement 12,17,18,19. De plus, ce processus de sélection est très pertinent pour sélectionner les composés à faire avancer dans le développement de médicaments.

Cependant, pour devenir un outil de diagnostic viable en milieu clinique et permettre des criblages de médicaments à grande échelle dans le cadre de la recherche sur le cancer et du développement de médicaments, le modèle de xénogreffe de tumeur de poisson-zèbre (ZTX) doit être rapide, fiable, reproductible et rentable. L’automatisation est essentielle pour atteindre ces objectifs, car elle minimise la variabilité de l’opérateur tout en augmentant le débit et en améliorant la précision de l’injection et de l’analyse des cellules tumorales. En normalisant ces procédures, nous pouvons améliorer la reproductibilité des données et éliminer l’erreur humaine, tandis que les flux de travail automatisés offrent des possibilités de dépistage à haut débit et rendent réalisables les études à grande échelle20,21. Récemment, nous avons mis au point un injecteur automatisé qui injecte des liquides, des particules ou des cellules d’origines diverses sur trois sites anatomiques différents avec une vitesse, une précision et une reproductibilité égales ou supérieures à celles des chercheurs formés au poisson-zèbre22. Ici, nous présentons un protocole pour l’injection automatisée de cellules tumorales dans des larves de poisson-zèbre de manière précise et contrôlée. À l’aide d’une reconnaissance d’image avancée, les larves de poisson-zèbre sont localisées sur la plaque d’injection, l’orientation est déterminée et le site cible de l’injection est identifié. L’aiguille est ensuite guidée automatiquement, et une ponction réussie est déterminée par le logiciel. Avec une formation minimale, les opérateurs peuvent utiliser ce système pour effectuer des injections complexes, par exemple, en créant des microtumeurs dans des larves de poisson-zèbre vivantes, permettant ainsi un dépistage efficace des stratégies de traitement.

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Protocole

Les lignes de poisson-zèbre ont été entretenues selon les protocoles standard (https://zfin.org) et manipulées conformément aux réglementations locales en matière de bien-être animal. Ces réglementations mettent en œuvre les Lignes directrices du Conseil de l’Europe pour la protection des animaux d’expérimentation (Directive 86/609/CEE), qui autorisent l’utilisation de larves de poisson-zèbre jusqu’au début de l’alimentation libre (5 jours après la fécondation). Comme toutes les larves utilisées dans cette étude n’avaient pas plus de 5 jours, aucune licence éthique n’était requise en vertu de la directive 86/609/CEE.

REMARQUE : Les larves de poisson-zèbre déchorionnées à 48 hpf et le matériel à injecter dans ces larves doivent être préparés avant de commencer la procédure à l’aide de l’injecteur automatisé. Des protocoles à cet égard se trouvent dans les méthodes supplémentaires (Fichier supplémentaire 1) associées à cet article. La figure 1 présente une présentation schématique du flux de travail du protocole. La figure supplémentaire 1 montre une représentation schématique des stades de développement des embryons de poisson-zèbre.

1. Préparation des micro-aiguilles

REMARQUE : Les micro-aiguilles sont nécessaires pour les injections et sont un élément essentiel du processus d’injection pour dépanner et régler à cette fin. Des aiguilles commerciales et des aiguilles fabriquées manuellement peuvent être utilisées dans l’injecteur automatisé. Voici la procédure à suivre pour tirer manuellement des micro-aiguilles à l’aide de l’instrument Sutter P-1000 ou PC-10, bien que la plupart des extracteurs de micro-aiguilles aient un fonctionnement similaire. La morphologie d’aiguille préférée est un cône progressif de 6 à 8 mm, avec une taille de pointe de 0,3 à 0,7 m, qui est ouverte manuellement avant l’injection à l’aide d’une pince tranchante.

  1. Préparez des capillaires en verre borosilicaté appropriés : 1,0 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur (DI). Assurez-vous qu’ils sont propres et exempts de poussière et de débris.
  2. Vérifiez que le serpentin de chauffage est intact et en bon état.
  3. Insérez le capillaire en verre dans les pinces et fixez-le fermement à l’aide des vis de serrage, mais pas trop fermement pour ne pas que le tube soit fissuré.
  4. Ajustez les paramètres : réglage de la chaleur, force de traction et temps de rampe. Lors de l’utilisation d’un extracteur d’aiguille PC-10, la morphologie correcte de l’aiguille est obtenue à l’aide d’une traction à un étage avec le réglage de chauffage 68 et des poids complets.
    REMARQUE : Ces paramètres influenceront la longueur et la largeur de la pointe conique et peuvent varier en fonction de l’épaisseur de la paroi du capillaire. Des essais et des erreurs sont nécessaires ici pour produire le meilleur résultat.
  5. Retirez les aiguilles des pinces avec précaution, pour ne pas endommager la pointe. Inspectez la pointe pour vous assurer d’un cône uniforme.
  6. Rangez soigneusement les micro-aiguilles sur du ruban adhésif, en veillant à ce que la pointe délicate n’entre en contact avec aucune surface.

2. Préparation de plaque de gel d’agarose pour l’injection robotisée

  1. Pesez 0,6 g d’agarose et transférez-le dans une bouteille en verre de 100 ml.
  2. À l’aide d’un cylindre mesureur, mesurer 40 mL de solution E3. Placez-le dans le flacon en verre avec l’agarose pour préparer une solution d’agarose à 1,5 %.
  3. Placez la bouteille en verre dans un micro-ondes et chauffez-la pendant 30 s à 900 W. Ensuite, continuez à chauffer par incréments de 30 secondes, en faisant tourner le contenu (avec des gants) entre chaque intervalle jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
    REMARQUE : Soyez prudent, car l’ébullition peut également commencer à la suite d’un tourbillonnage.
  4. Une fois fondue, refroidissez l’agarose en rinçant l’extérieur de la bouteille en verre sous l’eau courante jusqu’à ce qu’elle soit chaude mais pas chaude au toucher (environ 60 °C).
  5. Nettoyez et séchez soigneusement le porte-assiette réutilisable et la glissière en verre. Assemblez en glissant la glissière en verre dans la fente sur le côté du support de plaque (Figure supplémentaire 2A) et placez-la sur une surface plane.
    REMARQUE : Vérifiez que la plaque de verre ne dépasse pas du côté du support.
  6. Versez environ 40 ml du mélange d’agarose sur la plaque de verre, en veillant à ce qu’il s’étale pour couvrir toute la surface. Si nécessaire, inclinez-le de manière à ce que tous les bords soient atteints.
  7. Laisser l’agarose se solidifier pendant environ 5 min. La plaque est alors prête à l’emploi.
    REMARQUE : L’ajout de solution E3 sur la surface de la plaque d’agarose solide peut empêcher le séchage. Cependant, il doit être retiré avant d’être utilisé pour des injections.

3. Placer les larves de poisson-zèbre sur la plaque de gel d’agarose

  1. Humidifiez la plaque de gel d’agarose avec la solution E3.
  2. Tenez la plaque en biais, ce qui permet à l’excès de solution E3 d’être recueilli.
  3. Préparez une solution E3 contenant 40 μg/mL de tricaïne dans une boîte de Pétri. Placez environ 20 larves dans la solution et laissez-les anesthésier pendant 2 min.
  4. Placez soigneusement 10 à 20 larves anesthésiées sur la plaque (figure supplémentaire 2B), en veillant à ce que l’excès d’eau s’écoule naturellement.
  5. Assurez-vous que les larves sont étalées, sans se toucher, et évitez de les positionner trop près (5-10 mm) du bord de la plaque (figure supplémentaire 2B).
  6. Retirez tout excès de liquide de la plaque tout en veillant à ce que les larves restent humides.
    REMARQUE : Un excès de liquide peut induire un mouvement larvaire involontaire pendant l’injection, tandis que des niveaux d’humidité insuffisants peuvent augmenter les taux de mortalité.

4. Chargement de la micro-aiguille

REMARQUE : Chargez la micro-aiguille avec des cellules fluorescentes à haute densité juste avant d’effectuer une injection. Les cellules peuvent exprimer génétiquement un marqueur fluorescent, ou un marqueur chimique peut être utilisé23. Bien que le nombre de cellules injectées dans chaque larve soit relativement faible, généralement de 700 à 900 cellules, la densité cellulaire doit être élevée au stade de l’injection ; environ 300 000 à 500 000 cellules par μL, principalement en raison du volume infime (environ 2 nL) injecté.

  1. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 5 min et retirer le milieu cellulaire.
  2. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules, puis remettez la pastille en suspension dans du PBS stérile à température ambiante (RT) pour atteindre une densité finale de 300 000 cellules/μL.
  3. Prenez une micro-aiguille préparée et tenez-la soigneusement entre le pouce et l’index. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur, chargez la micro-aiguille avec 1 à 10 μL de suspension de cellules, en fonction du nombre de cellules.
    REMARQUE : Insérez la pointe à l’extrémité de la micro-aiguille et retirez-la lentement pendant qu’elle est remplie.
  4. À l’aide d’un stéréomicroscope à grossissement de 4x et d’une paire de pinces fines, cassez soigneusement la pointe scellée de la micro-aiguille pour produire une ouverture. Cette étape peut également être effectuée avant le chargement d’une suspension d’injection.
    REMARQUE : Une pointe d’aiguille biseautée facilite la perforation et peut être créée à l’aide d’une meuleuse d’aiguilles. Si vous utilisez une meuleuse à aiguilles, biseautez la pointe de l’aiguille avant de charger les suspensions d’injection. Dans ce cas, l’aiguille est déjà ouverte avant que les cellules ne soient chargées.

5. Fonctionnement du robot pour la micro-injection

  1. Effectuez la procédure de démarrage.
    1. Assurez-vous qu’une alimentation en gaz adéquate est connectée et allumée.
      REMARQUE : La pression d’entrée recommandée d’un compresseur d’air ou d’une vanne d’air dans un environnement de laboratoire avec de l’air centralisé et sous pression est de 0,6 MPa (6 bar). Le compresseur d’air ou la vanne peut rester allumé et ouvert en permanence sans qu’il soit nécessaire de l’éteindre fréquemment. De l’air comprimé, de l’azote ou du CO2 peuvent être utilisés pour la pression d’entrée.
    2. Insérez une clé USB dans l’un des ports à l’arrière du robot (facultatif).
      REMARQUE : Une clé USB doit être insérée dans la machine avant d’allumer le robot et n’est retirée qu’une fois le robot éteint.
    3. Appuyez sur le bouton d’alimentation vert à côté de l’écran pour allumer le robot (Figure supplémentaire 2C). Attendez que le panneau de configuration s’affiche (environ 1 min).
    4. Vérifiez s’il y a 15 cm d’espace libre sur les côtés gauche et droit du robot et appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle (Figure supplémentaire 2D).
    5. Appuyez sur OK dans la fenêtre contextuelle suivante (Figure supplémentaire 2E) à propos de la clé USB.
      REMARQUE : Cette fenêtre contextuelle n’apparaîtra pas si aucune clé USB n’est insérée.
  2. Réglez la connexion pour la télécommande (facultatif).
    REMARQUE : Une télécommande est utilisée pour visualiser et utiliser la machine à distance. Cette fonction est utile pour les démonstrations, les sessions de formation, les mises à jour logicielles et le dépannage.
    1. Insérez un câble Ethernet dans le port situé à l’arrière de la machine. Pour la configuration initiale, contactez le service informatique pour obtenir de l’aide.
    2. Appuyez sur l’icône de menu située dans le coin supérieur gauche de l’écran (Figure supplémentaire 2F).
    3. Appuyez sur l’icône des paramètres en bas au centre du menu (Figure supplémentaire 2F).
    4. Sélectionnez Mode de maintenance dans le menu des paramètres (Figure supplémentaire 2G).
    5. Appuyez sur Se connecter à LSM pour initier une connexion à distance (Figure supplémentaire 2H).
  3. Effectuez les paramètres d’injection.
    1. Appuyez sur les paramètres d’injection dans le menu (Figure supplémentaire 2F).
    2. Choisissez le stade de développement approprié des larves de poisson-zèbre pour l’injection (figure supplémentaire 3A).
      REMARQUE : Pour les injections dans le canal de Cuvier, l’espace périvitellin et le ventricule postérieur, il est recommandé de maintenir des larves à 48 hpf à 28,5 °C.
    3. Sélectionnez le site d’injection préféré parmi les options proposées pour effectuer les injections (figure supplémentaire 3B).
    4. Sélectionnez le lieu d’injection sur le schéma d’une larve de poisson-zèbre. Ajustez la position du diagramme larvaire, de la pointe de l’aiguille et de l’orientation de l’aiguille pour qu’ils s’alignent avec le site d’injection choisi (figure supplémentaire 3C).
      REMARQUE : Les emplacements suggérés de l’aiguille pour différents sites d’injection sont fournis dans un article publié antérieurement22. Pour l’injection dans le canal de Cuvier (DoC), l’aiguille est généralement placée au milieu du DoC en raison du flux sanguin plus élevé dans cette région. L’orientation de l’aiguille peut être dorsale ou ventrale. Pour l’injection dans l’espace périvitellin (PVS), il est recommandé de commencer l’insertion de l’aiguille à la limite de l’espace et de la positionner à un angle d’environ 30-45° par rapport à la notochorde. Pour l’injection du ventricule du cerveau postérieur, il est recommandé de commencer l’insertion de l’aiguille à l’extérieur du cerveau postérieur pour éviter qu’il ne glisse. L’angle de l’aiguille doit s’aligner entre les yeux et la vésicule otique.
    5. Sélectionnez la macro d’injection, qui offre des options pour les modes automatique et manuel (figure supplémentaire 3D).
      REMARQUE : Pour le mode automatique, le nom du site d’injection indique que le processus d’injection est effectué de manière autonome par le système. La sélection manuelle implique que le robot localise et approche les larves de manière autonome. Une fois les larves identifiées, une interface de contrôle apparaîtra pour permettre aux utilisateurs d’opérer le processus d’injection.
    6. Une fois les paramètres d’injection finalisés, appuyez sur Continuer à calibrer l’aiguille pour procéder à l’étalonnage de l’aiguille.
  4. Effectuer l’étalonnage de l’aiguille.
    REMARQUE : Comme chaque aiguille est différente, la position de la pointe de l’aiguille doit être calibrée. L’interface initiale de l’étalonnage de l’aiguille est illustrée à la figure supplémentaire 3E.
    1. Saisissez fermement le porte-aiguille et tournez la partie métallique dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour détacher le porte-aiguille du robot.
    2. Insérez le côté émoussé d’une aiguille remplie dans le côté tronconique du porte-aiguille.
    3. Appuyez sur Déplacer l’étape pour monter l’aiguillee affichée à l’écran (Figure supplémentaire 3E). La platine se déplacera dans une position sûre pour le montage de l’aiguille, et une règle sera affichée (figure supplémentaire 3F). Mesurez la longueur de l’aiguille à l’extérieur du porte-aiguille à l’aide de la règle. Il doit être d’environ 22 mm.
    4. Saisissez le porte-aiguille contenant l’aiguille remplie et tournez la partie métallique dans le sens des aiguilles d’une montre pour serrer solidement la connexion (Figure supplémentaire 3G). Appuyez sur OK pour continuer.
    5. Dans l’écran contextuel, positionnez l’aiguille au centre du cercle (Figure supplémentaire 3H) en ajustant les deux vis de la machine (Figure supplémentaire 3I). Une fois centré, appuyez sur la coche verte.
    6. Dans l’écran contextuel suivant (Figure supplémentaire 3J), ajustez la mise au point sur la pointe de l’aiguille en tournant la vis située à l’arrière de la tête du robot (Figure supplémentaire 3K). Lorsque vous êtes sélectionné, appuyez sur la coche verte. Le robot calibrera alors automatiquement la hauteur de l’aiguille. Par la suite, le robot fera pivoter l’aiguille et affichera les positions d’injection sous forme de points rouges à chaque rotation (figure supplémentaire 3L).
    7. Lorsque vous avez terminé, appuyez sur J’ai compris et Continuer l’étalonnage des gouttelettes en bas à droite de l’écran.
  5. Effectuez l’étalonnage des gouttelettes.
    REMARQUE : La taille des gouttelettes est calibrée à l’aide d’une injection dans de l’huile minérale.
    1. Préparez une plaque à 6 puits avec un puits rempli de 10 ml d’huile minérale et un autre puits avec 10 ml de tampon de nettoyage (par exemple, PBS ou eau). Placez la plaque à 6 puits sur la position gauche du support de plaque.
      REMARQUE : Veuillez retirer le couvercle de la plaque à 6 puits pendant l’expérience (entière) afin qu’elle puisse être réutilisée lorsqu’une aiguille est bouchée ou qu’une nouvelle aiguille est placée.
    2. Appuyez sur l’icône à côté de Calibrer à l’aide d’une plaque de puits (Figure supplémentaire 4A).
    3. Sélectionnez les positions du puits de pétrole et du puits de nettoyage (Figure supplémentaire 4B).
    4. Appuyez sur Créer un droplet pour générer un droplet avec les paramètres indiqués sur le côté gauche de l’écran (Figure supplémentaire 4C). Ajustez la pression d’injection, la contre-pression et la durée de l’impulsion d’air selon les besoins pour atteindre le volume cible. Vous pouvez également appuyer sur le bouton Amélioration automatique pour optimiser automatiquement les paramètres et atteindre le volume souhaité.
    5. Si l’aiguille est bouchée, appuyez sur le bouton bleu Nettoyer l’aiguille (Figure supplémentaire 4C) pour activer une impulsion de nettoyage à haute pression dans le puits contenant de l’eau ou du fluide.
    6. Si l’aiguille et la gouttelette apparaissent floues, ajustez la mise au point de l’aiguille et de la gouttelette à l’aide du bouton du tiers supérieur sur le côté droit de l’écran (Figure supplémentaire 4C).
    7. Appuyez sur la coche verte pour fermer l’écran.
  6. Effectuer la sélection des plaques.
    1. Cliquez sur Déplacer l’étage pour placer l’assiette, et le robot déplacera automatiquement l’étage dans une position appropriée pour placer l’assiette.
    2. Vérifiez que la plaque de gel d’agarose est sèche en dessous et placez la plaque avec les larves anesthésiées dans la bonne position du porte-plaque.
    3. Ensuite, cliquez sur OK et appuyez sur Continuer vers l’injection pour poursuivre le processus d’injection (Figure supplémentaire 4D).
  7. Effectuez l’injection.
    1. Dans l’interface d’injection, cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer le processus d’injection (Figure 4E supplémentaire). Le processus commence par le mouvement de l’étage du robot pendant que le système scanne la plaque d’agarose, à la recherche d’un poisson (figure supplémentaire 4F). Lors de l’identification d’une larve, l’aiguille navigue automatiquement vers le site d’injection désigné et ajuste automatiquement sa direction à l’angle prédéterminé.
    2. Si le mode automatique est choisi, le robot administre sans problème les injections sur le site sélectionné (figure supplémentaire 4G). Une fois l’injection en cours terminée, le robot continuera à rechercher la prochaine larve sur la plaque pour effectuer des injections.
    3. Si le mode manuel est sélectionné, une interface de commande manuelle apparaîtra lorsque l’aiguille s’approchera de la larve (figure supplémentaire 4H). Utilisez les flèches bleue et jaune pour déplacer l’aiguille et faites-la pivoter à l’aide du bouton de rotation circulaire situé sur le côté gauche de l’écran. Une fois l’aiguille positionnée à l’intérieur de la larve, appuyez sur le bouton rouge de la gouttelette pour effectuer l’injection. Vous pouvez également appuyer sur la touche m pour lancer la séquence de macros afin d’effectuer l’injection automatiquement.
    4. Lorsque toutes les larves ont été injectées, fermez l’interface d’injection en cliquant sur le bouton d’arrêt. L’aiguille sera placée automatiquement dans le puits d’huile.
    5. Retirez délicatement la plaque contenant les larves injectées.
  8. Transférez les larves de poisson-zèbre injectées.
    1. Pour transférer les larves injectées, inclinez la plaque au-dessus d’une boîte de Pétri et utilisez une pipette ou un flacon compressible pour rincer doucement les larves avec un débit d’eau contrôlé.
    2. Commencez par le haut et déplacez-vous vers le bas pour un rinçage efficace.
    3. Retirez toutes les larves mortes, remplacez l’eau par une solution E3 fraîche et placez la boîte de Pétri dans l’incubateur.
      REMARQUE : Si des cellules cancéreuses humaines ou des échantillons cliniques sont injectés, incuber la boîte de Pétri à 33-36 °C ; sinon, incuber à 28,5 °C.

6. Éteindre le robot

  1. Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille en visitant le menu d’étalonnage de l’aiguille et en appuyant sur Déplacer l’étape pour retirer l’aiguille (Figure supplémentaire 3E). Si l’on a l’intention de garder l’aiguille dans la machine pour une utilisation ultérieure, sautez cette étape.
  2. Allez dans le menu et appuyez sur le bouton d’alimentation , situé en bas à gauche (Figure supplémentaire 2D).
  3. Appuyez sur le bouton de stationnement de l’aiguille pour préserver l’aiguille (Figure supplémentaire 4I).
  4. Sinon, cliquez sur OK. La machine s’éteindra et le voyant vert du bouton d’alimentation s’éteindra une fois l’arrêt terminé.
    REMARQUE : Lorsque le robot est inactif, placez les plaques multipuits vides dans les deux supports de plaques multipuits pour empêcher la poussière de pénétrer dans la machine.

7. Enlever le gel d’agarose et nettoyer

  1. Retirez le gel d’agarose de la plaque et retirez soigneusement (portez des lunettes et des gants) la plaque de verre du support.
  2. Nettoyez soigneusement la plaque de verre et le support avec de l’eau tiède et de l’éthanol, en veillant à ce qu’il soit sec avant d’être réutilisé.
    REMARQUE : Nettoyez toutes les plaques de gel immédiatement après utilisation, car le gel d’agarose est plus facile à enlever lorsqu’il est encore humide.

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Résultats

Nous présentons ici le processus d’injection automatisé pour les trois sites d’injection les plus utilisés pour les xénogreffes de cellules cancéreuses.

La vidéo 1 montre l’injection automatique du conduit de Cuvier (DoC) à l’aide du système robotisé. Le robot scanne d’abord la plaque de manière systématique, en se déplaçant de haut en bas et de gauche à droite, pour localiser une larve de poisson-zèbre. Une fois qu’une larve est identifiée, l...

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Discussion

Le développement et la mise en œuvre de l’injecteur automatisé représentent une avancée significative dans le domaine de la xénogreffe de tumeurs de poisson-zèbre pour le dépistage de médicaments anticancéreux et la médecine de précision. Il s’agit, à notre connaissance, du premier robot disponible dans le commerce pour l’injection automatisée de suspensions cellulaires dans des larves de poisson-zèbre, et ce protocole est donc pertinent pour toutes les recherches qui impliquent de telle...

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Déclarations de divulgation

Y.D., K.J.v.d.K. et J.d.S. travaillent pour Life Science Methods, qui exploite commercialement le système robotique utilisé dans cette publication. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions sincèrement le programme Eurostars d’avoir soutenu nos recherches par le biais de la subvention ROBO-FISH (numéro de subvention : E ! 114899) et le programme EIC-PATHFINDER par le biais de la subvention ALADDIN (numéro de subvention : 101130574).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque à 6 puits   ;Greiner bio-one cellstar  ;réf. 657160
AgaroseVWR#N605-100G
Système d’injection automatisée + consommablesMéthodes des sciences de la viehttps://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774
Capillaires en verre borosilicateInstruments de précision mondiauxN/A1,0 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur
Compteur cellulaire & nbsp ;ThermoFisherComtesse 3
Aiguilles commerciales   ;Clunbury Scientific LLC  ;#B100-58-20
DNase type I  ;Roche#11284932001
Filtre pour les cellules cancéreusesSysmex CellTricsTM04-0042-231630 & micro ; m
Huile minérale & nbsp ;Diapharma  ;#330779-1L
Meuleuse à aiguilles ()Narishige  ;  ; EG-401
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma#102420477
Dissociateur Octo GentleMACSMiltenyi Biotechttps://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html

Références

  1. Goetz, L. H., Schork, N. J. Personalized medicine: motivation, challenges, and progress. Fertil Steril. 109 (6), 952-963 (2018).
  2. Jorgensen, J. T. Twenty years with personalized medicine: Past, present, and future of individualized pharmacotherapy. Oncologist. 24 (7), e432-e440 (2019).
  3. Ashley, E. A. Towards precision medicine. Nat Rev Genet. 17 (19), 507-522 (2016).
  4. Binotto, M., Reinert, T., Werutsky, G., Zaffaroni, F., Schwartsmann, G. Health-related quality of life before and during chemotherapy in patients with early-stage breast cancer. Ecancermedicalscience. 14, 1007(2020).
  5. Nalla, L. V., Kanukolanu, A., Yeduvaka, M., Gajula, S. N. R. Advancements in single-cell proteomics and mass spectrometry-based techniques for unmasking cellular diversity in triple negative breast cancer. Proteomics Clin Appl. 19 (1), e202400101(2025).
  6. Lindahl, G., et al. Zebrafish tumour xenograft models: a prognostic approach to epithelial ovarian cancer. NPJ Precis Oncol. 8 (1), 53(2024).
  7. Duan, X. P., et al. New clinical trial design in precision medicine: discovery, development and direction. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 57(2024).
  8. Research and development in the pharmaceutical industry. , Congressional Budget Office. https://www.cbo.gov/publication/57126 (2021).
  9. Dusetzina, S. B., Oberlander, J. The price of progress: Managing prescription drug spending. J Health Polit Policy Law. 47 (6), 621-628 (2022).
  10. Nagar, S., Rand, L. Z., Kesselheim, A. S. What should US policymakers learn from international drug pricing transparency strategies. AMA J Ethics. 24 (11), E1083-E1090 (2022).
  11. You, Y., et al. Artificial intelligence in cancer target identification and drug discovery. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 156(2022).
  12. Costa, B., et al. Zebrafish Avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Commun. 15 (1), 4771(2024).
  13. Ali, Z., et al. Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 58(2022).
  14. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
  15. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-X(L) inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028(2023).
  16. Pascoal, S., et al. Using zebrafish larvae as a xenotransplantation model to study Ewing sarcoma. Methods Mol Biol. 2226, 243-255 (2021).
  17. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293(2020).
  18. Costa, B., et al. Zebrafish Avatars of rectal cancer patients validate the radiosensitive effect of metformin. Front Oncol. 12, 862889(2022).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077(2021).
  20. Holland, I., Davies, J. A. Automation in the life science research laboratory. Front Bioeng Biotechnol. 8, 571777(2020).
  21. Brito, J. J., et al. Recommendations to enhance rigor and reproducibility in biomedical research. Gigascience. 9 (6), giaa056(2020).
  22. Ding, Y., et al. Automated microinjection for zebrafish xenograft models. NPJ Biomed Innov. 2, 13(2025).
  23. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  24. Martinez-Lopez, M., Povoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373(2021).
  25. Groenewoud, A., Yin, J., Snaar-Jagalska, B. E. Ortho- and ectopic zebrafish xeno-engraftment of ocular melanoma to recapitulate primary tumor and experimental metastasis development. J Vis Exp. (175), e62356(2021).
  26. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459(2017).

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine
Posted by JoVE Editors on 11/03/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68441

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