Échantillonnage efficace de l’espace de conception de biocapteurs génétiquement codés grâce à un plan d’expériences et à un flux de travail d’automatisation

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour l’optimisation globale systématique des biocapteurs génétiquement codés par la génération et l’évaluation de bibliothèques génétiques assistées par automatisation. Ceci est associé à des méthodologies de conception d’expérience pour rationaliser l’expérimentation et permettre la sélection de composants génétiques pour ajuster les biocapteurs à des résultats de conception spécifiques.

Abstract

Les biocapteurs génétiquement codés sont des outils puissants pour le traitement de l’information à haut débit, permettant la transduction de signaux d’entrée environnementaux ou chimiques en une variété de sorties. Cela permet une détection dynamique, un contrôle direct et une régulation précise de l’expression des gènes dans un large éventail d’applications biotechnologiques, notamment l’optimisation enzymatique, le développement de souches et le contrôle des processus microbiens. Pour les adapter à l’usage prévu, les performances des biocapteurs peuvent être affinées en modifiant la stœchiométrie des composants du circuit du biocapteur (par exemple, les transporteurs, les modules d’entrée et de sortie) et/ou en ajustant les interactions intermoléculaires hôte-biocapteur associées (par exemple, ADN-protéine, protéine-protéine). Cependant, ici, le grand nombre de permutations possibles de biocapteurs crée un espace de conception combinatoire complexe, nécessitant une optimisation minutieuse des stratégies de criblage pour identifier les configurations qui offrent les performances phénotypiques souhaitées. Cette complexité est encore aggravée par les caractéristiques de performance des biocapteurs, telles que l’accordabilité, qui nécessitent une analyse de titrage effecteur dans des conditions de criblage monoclonal. Par conséquent, la nécessité d’explorer des séquences et des espaces expérimentaux variés rend les méthodes d’échantillonnage fractionné particulièrement bien adaptées à cet effet. Ce flux de travail repose sur des algorithmes de plan d’expérience (DoE), qui sont bien placés pour permettre une cartographie structurée efficace basée sur des statistiques et un échantillonnage fractionnaire de cet espace de conception expérimental combinatoire.

Il s’agit d’une combinaison d’automatisation à haut débit et d’une approche computationnelle permettant d’échantillonner efficacement l’espace de conception de biocapteurs basés sur des facteurs de transcription allostériques afin de permettre des configurations distinctes avec des courbes dose-réponse numériques et analogiques. Le protocole commence par la création et la sélection automatisée de bibliothèques de sites de liaison des promoteurs et des ribosomes. Ces bibliothèques, et leurs données d’expression correspondantes, sont transformées en entrées structurées sans dimension, permettant une cartographie informatique de l’ensemble de l’espace de conception expérimentale. L’échantillonnage fractionné est ensuite effectué à l’aide d’un algorithme DoE et couplé à une analyse de titrage effecteur à l’aide d’une plateforme d’automatisation à haut débit. Ce flux de travail fournit un cadre agnostique pour le développement et l’optimisation de futurs systèmes de biocapteurs et de circuits génétiques, fournissant une boîte à outils réglementaire pour la communauté de la biologie synthétique.

Introduction

La capacité de réguler l’expression des gènes est une fonction essentielle dans toutes les formes de vie, facilitant des réponses dynamiques et en temps réel aux influences internes et externes, allant des effecteurs chimiques aux stimuli biophysiques¹. La myriade de systèmes de régulation transcriptionnelle que l’on trouve dans la nature a un énorme potentiel dans l’augmentation et l’accélération de l’ingénierie métabolique et de la recherche biotechnologique rendue possible par la biologie synthétique. Chez les procaryotes, une grande partie de la régulation qui se produit dans la cellule est contrôlée par des mécanismes de régulation à un composant pilotés par les interactions des facteurs de transcription allostériques (aTFs) avec un certain nombre de petits effecteurs moléculaires². Généralement constitués d’un domaine de liaison effecteur (EBD) et d’un domaine de liaison à l’ADN (DBD), les aTF agissent comme des commutateurs moléculaires lors de la liaison à des effecteurs spécifiques de petites molécules, modulant l’affinité de leur DBD pour des séquences d’opérateurs d’ADN spécifiques situées dans les régions promotrices du génome, entraînant l’activation ou la répression de la transcription³. Ce mécanisme d’une simplicité trompeuse a donné naissance à un certain nombre de stratégies de régulation diverses, allant des systèmes de répression/dérépression aux activateurs capables de détecter et de répondre à un nombre stupéfiant d’effecteurs de petites molécules ou de stimuli environnementaux⁴. Par conséquent, la biologie synthétique a tiré parti de cette diversité afin de construire des biocapteurs génétiquement codés capables de coupler une pléthore de signaux d’entrée en sorties sur mesure, c’est-à-dire la production de protéines rapporteures fluorescentes et la régulation des voies synthétiques. Lorsqu’ils sont appliqués dans des flux de travail biotechnologiques, ces systèmes permettent la surveillance en temps réel des concentrations intracellulaires de métabolites, la régulation dynamique des voies et des lectures faciles, ce qui contribue au développement de voies, de souches et de bioprocédés plus efficaces 5,6,7,8.

Fondamentalement, les biocapteurs sont caractérisés en fonction d’un certain nombre de paramètres, notamment la spécificité, la plage de fonctionnement, la plage dynamique, la sensibilité et la pente, la courbe dose-réponse d’un biocapteur décrivant ces paramètres par le biais du signal de sortie en fonction de la concentration du ligand (Figure 1)9,10,11,12 . L’équation de Hill peut être utilisée pour ajuster les caractéristiques de performance d’un biocapteur, fournissant des preuves semi-empiriques pour chacun des paramètres décrits ci-dessus, fournissant ainsi un moyen de caractériser le système de biocapteurs tout en permettant d’évaluer les efforts nécessaires pour ajuster le système vers des résultats axés sur l’application. La spécificité peut être définie comme les différences relatives de sortie de signal induites par un effecteur par rapport à un réseau d’autres molécules effectrices potentielles et est généralement modulée au niveau EBD de l’aTF. La plage de fonctionnement est définie comme la plage de concentrations de ligands que le biocapteur est capable de détecter, dictant la plage de concentrations à laquelle le biocapteur sera capable de répondre. La plage dynamique, en revanche, décrit le rapport entre l’état d’activation mesurable (ON) le plus élevé et l’état inactivé (OFF) et constitue un paramètre important pour s’assurer que le biocapteur signale de manière fiable les concentrations effectrices supérieures à l’autofluorescence de fond¹⁰. La sensibilité de la molécule effectrice est décrite comme la concentration nécessaire pour provoquer un certain signal de sortie, mesurée par la concentration demi-maximale (EC₅₀) de l’effecteur¹³. Enfin, la pente de la courbe est notée par la coopérativité (n_H) de l’aTF pour son site opérateur au niveau du promoteur et aboutit à un profil de sortie de réponse plus numérique ou analogique. La coopérativité résulte d’interactions protéine-protéine entre des aTF liés à des ligands formant des complexes multimériques qui renforcent l’affinité pour le site opérateur, entraînant une forte augmentation de la réactivité du circuit avec des concentrations de ligands saturants et un profil de réponse plus numérique¹⁴.

Les caractéristiques dose-réponse d’un biocapteur peuvent affecter de manière significative l’adéquation de ses applications et constituent souvent un point décisif pour toute application conceptuelle. Les performances des biocapteurs peuvent varier énormément d’un système à l’autre, la plage de fonctionnement variant généralement de 0,1 nM à 10 mM¹³, tandis que les plages dynamiques peuvent être de 1,4 à 2000 fois¹⁵. De plus, alors que le nombre de composés effecteurs rapportés pour les aTFs est large (produits métaboliques, acides aminés, métaux, antibiotiques, détection de quorum, etc.)¹¹, il n’est pas exhaustif et présente des défis pour les chercheurs lorsqu’il n’existe pas encore de biocapteur adapté à leur effecteur dans la littérature. La biologie synthétique a permis l’ingénierie de biocapteurs qui relèvent de tels défis, permettant d’ajuster la portée de l’effecteur et les caractéristiques dose-réponse pour s’aligner plus étroitement sur les résultats de recherche de l’application, et a été utilisée pour résoudre les deux problèmes susmentionnés, respectivement^16,17. Deux domaines clés de l’ingénierie peuvent être ciblés par la biologie synthétique, la région promotrice du biocapteur et l’aTF lui-même, médiant leurs effets au niveau transcriptionnel et protéique. Les approches qui se concentrent sur les éléments génétiques du biocapteur afin de moduler les performances au niveau du promoteur comprennent l’ingénierie du RBS, des sites d’opérateur et de -35, -10 (hexboxes) afin d’ajuster la sensibilité, les plages opérationnelles et dynamiques, et sont au centre de la méthodologie décrite dans ce manuscrit (Figure 1). Alternativement, la modification de la sélectivité et de la sensibilité du biocapteur par l’analyse de son domaine de liaison effecteur et la mutation des résidus impliqués dans la coordination des effecteurs (en utilisant l’homologie de séquence et/ou la biologie structurale) peut moduler sa réponse à un effecteur apparenté ^18,19,20 ou la changer entièrement vers un effecteur non apparenté d’intérêt 16,17,21. De tels efforts de réglage peuvent ensuite orienter les biocapteurs vers des applications spécifiques, il s’agit généralement de contrôleurs métaboliques (boucles de rétroaction, circuits de contrôle), d’outils de criblage primaires (découverte d’enzymes ou de souches), d’outils de criblage secondaires (criblage de variants enzymatiques, ingénierie métabolique) et de bioprospection de transporteurs 22,23,24. L’un de ces exemples implique l’utilisation d’un aTF sensible à l’acide muconique, CatM, combiné à une séquence de promoteur modifiée pour améliorer la plage dynamique et opérationnelle. Ce système a été intégré à un tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les souches productrices d’acide muconique les plus efficaces en fonction de la fluorescence GFP après évolution adaptative en laboratoire²⁵.

Bien que le succès des stratégies d’ingénierie décrites ci-dessus soit évident, les interdépendances des leviers dont dispose un biologiste synthétique pour régler les biocapteurs peuvent compliquer le processus de conception et prolonger la période consacrée au développement des biocapteurs, ce qui peut dissuader certains chercheurs d’intégrer des biocapteurs dans leurs propres flux de travail. Comme l’illustre la figure 1, les tentatives d’ajuster un biocapteur en fonction d’un résultat particulier en modifiant les boîtes hexagonales peuvent atténuer par inadvertance d’autres paramètres, cette interdépendance étant un défi reconnu dans l’ingénierie des biocapteurs¹². Les approches courantes de réglage des biocapteurs consistent en une conception rationnelle et une ingénierie d’évolution dirigée, la première s’appuyant sur une compréhension a priori des caractéristiques structurelles et mécanistes du système pour concentrer l’expérimentation sur les composants ayant une forte probabilité de succès ; tandis que le second s’appuie sur la mutagénèse aléatoire et l’évolution naturelle couplées à un criblage à haut débit pour sélectionner les variants présentant des caractéristiques optimisées 26,27,28,29,30. Bien qu’efficaces, les deux techniques présentent également quelques inconvénients : l’ingénierie ciblée, par exemple, en se concentrant sur des éléments structurels ou fonctionnels spécifiques, est sujette à une exploration limitée de l’ensemble de l’espace expérimental et peut ignorer les effets allostériques ou secondaires³⁰. La génération et le filtrage non ciblés de bibliothèques, bien qu’idéaux pour optimiser les conceptions de manière non guidée, nécessitant peu de travail de conception initial (c’est-à-dire la conception et la génération de bibliothèques), nécessitent un biais vers la mutation utile. En l’absence d’un tel biais, on s’attend à ce qu’un pourcentage beaucoup plus élevé de mutations soit délétère, ce qui nécessite un dépistage plus approfondi³¹. En tant que telles, les approches holistiques qui prennent en compte non seulement l’effet principal des composants du biocapteur (aTF, RBS, sites d’opérateurs et hexbox), mais aussi la façon dont ces composants interagissent les uns avec les autres pour influencer les paramètres du biocapteur sont très attrayantes.

Les méthodologies d’expérimentation multivariée structurée et de modélisation statistique ont été largement adoptées dans les flux de travail de l’ingénierie des procédés afin d’interroger l’espace expérimental multidimensionnel en utilisant le minimum possible d’expériences. Cette approche, qui combine l’expérimentation et la modélisation, appelée plan d’expériences (DoE), permet aux chercheurs d’optimiser des processus multivariés complexes vers des résultats définis sans nécessiter de connaissances a priori approfondies^23,30. Bien qu’il soit généralement appliqué à l’optimisation de variables continues pour lesquelles l’exploration expérimentale structurée est plus facile, le DoE a également été utilisé dans l’optimisation des voies métaboliques au niveau génétique 31,32,33. Il s’agit d’une étape de sélection initiale au cours de laquelle les facteurs considérés comme les plus importants pour le résultat souhaité sont sélectionnés, suivie d’une étape d’optimisation au cours de laquelle les facteurs sélectionnés sont ajustés pour obtenir le résultat souhaité, dans ce cas pour optimiser des paramètres spécifiques des biocapteurs afin d’augmenter leur champ d’application. Cette technique peut être couplée à des plates-formes de manipulation automatisée de liquides pour augmenter le débit de criblage jusqu’à des bibliothèques de taille moyenne de 10³ - 10⁴ afin d’optimiser globalement les performances des biocapteurs sur une base basée sur les données²³. Nous décrivons ci-dessous un protocole pour la mise en œuvre d’une approche DoE de l’optimisation des biocapteurs, assistée par la robotique de manipulation des liquides afin de rationaliser la génération de bibliothèques, le criblage et la collecte de données pour l’optimisation globale de la sensibilité des biocapteurs.

Protocol

1. Conception de pièces RBS/promoteur

1. Identifier les éléments régulateurs spécifiques aux biocapteurs qui peuvent être systématiquement réglés en tant que variables continues dans le processus DoE. Regroupez ces éléments réglementaires en modules distincts. Il peut s’agir de modules régulant le transport des effecteurs, l’expression des facteurs de transcription et/ou l’expression des gènes de sortie. Assurez-vous que chaque module est ajustable au niveau transcriptionnel et/ou translationnel par un promoteur ou RBS (par exemple, RBS_trans, P_reg, RBS_out et P_out, respectivement).
2. Déterminez les sites fonctionnels clés dans les régions de promoteur et de RBS sélectionnées, telles que les boîtes hexadécimales, les sites d’opérateur et les séquences RBS.
   REMARQUE : De nombreux promoteurs et RBS caractérisés existent dans la littérature pour créer des bibliothèques à partir de 34,35,36. Cependant, pour les séquences promotrices non caractérisées (généralement le promoteur P_reg), voir ci-dessous les étapes supplémentaires pour localiser les éléments de séquence génétique accordables s’ils ne sont pas disponibles dans la littérature.
   1. Localiser d’autres opérons contenant les séquences de biocapteur d’intérêt via les recherches BlastP de l’aTF avec l’entrée de détection souhaitée. Extraire la région intergénique de l’aTF et ses gènes régulés pour obtenir des séquences promotrices.
      REMARQUE : L’emplacement et le nombre de séquences promotrices varient en fonction de la classe d’aTF utilisée.
3. Utilisez plusieurs outils d’alignement de séquences et d’autres logiciels de motifs pour rechercher les promoteurs présumés des motifs conservés tels que les boîtes hexadécimales et les sites d’opérateurs. Sur la base de l’analyse des séquences du promoteur, sélectionnez des séquences nucléotidiques pour la randomisation avec des bases dégénérées, par exemple, N = n’importe quoi, R = n’importe quelle purine, Y = n’importe quelle pyrimidine, etc.
   REMARQUE : Les lecteurs sont invités à consulter la publication source pour plus de détails sur l’analyse des promoteurs et la randomisation de base²³.

2. Assemblage et validation de la bibliothèque de pièces

1. Concevoir et commander des amorces qui amplifieront spécifiquement le vecteur d’expression souhaité pour permettre l’insertion de variantes de séquence promoteur/RBS en amont d’un marqueur fluorescent (par exemple, GFP). Diluer les amorces lyophilisées à l’arrivée à une concentration finale de 100 μM dans du H₂O désionisé stérile.
   1. Assemblez le mélange réactionnel PCR sur de la glace dans des tubes PCR selon les paramètres de la polymérase spécifique. S’assurer qu’une polymérase haute fidélité est utilisée pour empêcher la transmission de mutations dans le squelette du vecteur d’expression. Ajustez la température de recuit et le temps d’extension en fonction des besoins des amorces et de la longueur du produit PCR souhaité.
   2. Analysez le produit PCR par électrophorèse sur gel et purifiez le vecteur linéarisé à l’aide d’une purification par PCR ou d’un kit d’extraction de gel. Mesurez la concentration d’ADN vecteur linéarisé et stockez-le à -20 °C.
2. Commandez les bibliothèques de variantes conçues (RBS ou promoteurs) pour les insérer dans le vecteur linéarisé en tant qu’oligonucléotides dégénérés monocaténaires avec des bras d’homologie plasmidique de 30 pb aux extrémités 5′ et 3′ pour une recombinaison homologue ciblée dans le vecteur d’expression.
   1. À l’arrivée, remettre en suspension les oligonucléotides lyophilisés à une concentration finale de 100 ng/μl dans du H₂O désionisé stérile.
3. Déterminez les volumes pour les quantités équimolaires de la bibliothèque de vecteurs et de variantes linéarisés à l’aide de calculatrices en ligne. S’assurer que le volume final de la réaction s’élèvera à 20 μL et qu’un rapport molaire de 2:1 entre l’insert et le vecteur est utilisé.
   1. Décongelez une aliquote du mélange maître d’assemblage commercial Gibson (X2) sur de la glace et assemblez la réaction dans un tube PCR selon les volumes fournis par le calculateur choisi.
      REMARQUE : Gibson master mix peut également être fabriqué en laboratoire^37,38.
   2. Ajoutez 10 μL de 2x Gibson master mix aux fragments d’ADN et incubez pendant 1 h à 50 °C dans un thermocycleur ou similaire.
   3. Appliquez les 20 μL de produit de ligature sur 200 μL d’E. coli compétent dans un tube de microcentrifugation. Incuber sur glace pendant 30 min suivi d’un choc thermique pendant 45 s à 42 °C.
   4. Remettez les cellules dans la glace pendant 2 min, ajoutez 800 μL de bouillon super optimal avec un milieu de répression catabolite (SOC) dans le tube et laissez les cellules récupérer pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à agiter.
   5. Étalez 50 μL de cellules transformées sur plusieurs plaques de Pétri gélosées Luria-Bertani (LB) de 60 mm avec sélection d’antibiotiques appropriée. Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h.
4. Vérifiez les plaques pour les transformants, calculez le nombre de colonies qui représentent 3 fois la diversité théorique de la bibliothèque pour capturer une représentation suffisante de chaque variant. Optimiser l’assemblage isotherme si le nombre de colonies est faible/nul.
   REMARQUE : Un suréchantillonnage est nécessaire lorsqu’il s’agit d’envisager une banque idéale générée à partir de réactifs ou de synthèse haute fidélité. C’est généralement 3 fois plus grand que la taille totale de la bibliothèque. Par exemple, 4 positions de dégénérescence (NNNN) = 4⁴ = 256 séquences uniques. Par conséquent, grattez ~768 colonies.
   1. Grattez le nombre requis de colonies dans une seule fiole stérile de 125 mL contenant 25 mL de milieu LB complété par des antibiotiques appropriés. Incuber le ballon à 37 °C pendant 18 h dans un incubateur à agitation (180 tr/min), en veillant à ce que la culture soit visiblement dense une fois ce temps écoulé.
   2. Utilisez un kit de purification de plasmide midi-prep pour purifier la bibliothèque de variantes de la culture transformante préparée. Déterminer la concentration de l’ADN de la banque de plasmides ; 1 à 10 μg est nécessaire pour les étapes en aval. S’assurer que l’ADN de la banque est élué à l’aide de H₂O désionisé stérile.
      REMARQUE : Les étapes au-delà de ce point se concentreront sur le clonage et la validation de bibliothèques de variantes dans l’hôte d’expression Pseudomonas putida (P. putida) ; L’adaptation du protocole à d’autres hôtes peut nécessiter une modification des temps d’incubation, des températures d’incubation et des méthodes de transformation.
5. Préparez une plaque de gélose LB de l’expression hôte souhaitée P. putida en l’étalant à partir d’un stock de glycérol et en incubant la plaque à 30 °C pendant 18 h.
   1. Prélever une seule colonie de P. putida sur la plaque de gélose LB, inoculer 10 mL de milieu LB et cultiver à 30 °C pendant 18 h, en secouant à 180 tr/min.
   2. Préparez les cellules pour l’électro-compétence en centrifugeant la culture cultivée à 4000 x g à 18 °C pendant 2 min. Videz le surnageant, remettez en suspension dans 1 mL de_H2O désionisé stérile et transférez les cellules remises en suspension dans un tube de microcentrifugation stérile.
      REMARQUE : Les cellules de P. putida doivent apparaître rosâtres lorsqu’elles sont granulées.
   3. Centrifuger les cellules pendant 1 min à 4 x g dans une microcentrifugeuse, vider le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de H₂O désionisé stérile. Répéter les étapes de centrifugation et de remise en suspension 4 fois de plus.
      REMARQUE : Une perte de cellules peut se produire lors du déversement du surnageant pendant le lavage ; Ceci est normal et ne devrait pas affecter les rendements.
   4. Transférez 100 μL de cellules lavées dans une cuvette d’électroporation de 0,2 cm, ajoutez 1 à 10 μg d’ADN de la bibliothèque plasmidique dans la cuvette et mélangez.
   5. Allumez l’électroporteur, assurez-vous que la tension est réglée sur 2,5 kV pour la cuvette de 0,2 cm, insérez la cuvette dans la chambre d’électroporation et pulsez.
   6. Ajoutez 900 μL de milieu SOC dans la cuvette, mélangez et transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation stérile. Laisser les cellules récupérer pendant 2 h à 30 °C dans un incubateur à agitation.
6. Étaler 50 μL de cellules transformées sur de grandes plaques de Pétri carrées (230 mm) de gélose LB complétée par l’antibiotique approprié et incuber à 30 °C pendant 18 h.
   REMARQUE : Assurer une densité de colonie modérée sur les plaques de la bibliothèque (2-3 UFC/cm²). Cela dépendra de la compétence bactérienne et du volume de placage. S’ils sont trop faibles, l’optimisation de la transformation, ou des cycles successifs de transformation, peuvent être utilisés pour augmenter le nombre de colonies.
7. Sélectionnez entre 25 et 50 colonies sur toutes les plaques de transformant pour la validation de la séquence. Utilisez des amorces qui amplifient sur toute la séquence dégénérée, amplifiez la région par PCR et envoyez-la pour le séquençage de Sanger afin d’évaluer la diversité de la séquence, ainsi que la polyclonalité.
   REMARQUE : Si la polyclonalité devient problématique, l’étalement des transformations sur plusieurs lots de cuvettes avec 1 μg d’ADN peut aider à réduire cet effet.

3. Criblage clonal de la bibliothèque de pièces - automatisation

1. Configuration du manipulateur de liquides
   1. Créez 7 programmes sur une plate-forme de manipulation de liquides pour vous assurer que les étapes de pipetage intensives sont banalisées.
   2. Créez un programme de « transfert de liquide MTP », assurez-vous que le manipulateur de liquide est configuré pour pipeter un volume réglable à partir d’un réservoir préparé dans des plaques de microtitration vides (MTP) dans sa disposition.
   3. Créez un programme « Ajouter du glycérol au MTP », assurez-vous que le manipulateur de liquide est programmé pour pipeter un volume de 100 μL de glycérol à 50 % dans des plaques, assurez-vous que la vitesse de distribution et d’aspiration est de 5 à 20 μL/s.
      REMARQUE : Un programme distinct est créé pour tenir compte de la viscosité plus élevée de 50 % de glycérol, ce qui peut entraîner la formation de bulles, une aspiration incomplète ou une contamination croisée des puits voisins en raison des éclaboussures s’il n’est pas contrôlé.
   4. Créez un programme « DWB Liquid Transfer », configurez le manipulateur de liquides pour qu’il pipette dans des blocs de puits profonds (DWB) avec un réglage de volume réglable, et assurez-vous que le manipulateur de liquides pipette à partir d’un réservoir prérempli.
   5. Créez un programme « Inoculer à partir de MTP décongelé », assurez-vous que le manipulateur de liquide est programmé pour aspirer 5 μL de MTP décongelé contenant les colonies sélectionnées et transférez-le dans les plaques DWB correspondantes dans la disposition.
      REMARQUE : Portez une attention particulière à la disposition MTP et DWB dans la disposition, en assurant un ordre logique des événements pour éviter une double inoculation accidentelle ou des plaques manquées.
   6. Créez un programme de « Transfert vers le test DWB », assurez-vous que le manipulateur de liquide est réglé pour transférer 5 μL de cellules d’une position de plaque DWB à une autre position de plaque DWB. Le programme doit ensuite répéter cette action 4 fois, chaque transfert inoculant une position de plaque différente, c’est-à-dire P1 -> P2, P1 -> P3, etc.
      REMARQUE : Ce programme assure la sous-culture sans faille de 96 variantes dans différentes concentrations d’essai.
   7. Créez un programme « Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) », assurez-vous que le manipulateur de liquide pipette chaque DWB dans la disposition avec 500 μL de PBS, le programme doit également inclure une étape de mélange pour s’assurer que les granulés de cellule sont correctement remis en suspension.
   8. Créez un programme « Configuration du test - Cellules et ajout de PBS (MTP) », assurez-vous que ce programme comprend une étape pour transférer 200 μL de cellules remises en suspension d’une position de plaque DWB à une position MTP vide.
      REMARQUE : Pour toutes les étapes de la version 3.1, la programmation et la disposition des manipulateurs de liquides varient ; Les chercheurs doivent se référer aux manuels de certains manipulateurs de liquides commerciaux pour modifier les programmes ci-dessus en fonction de la capacité et des besoins de l’expérience.
2. Culture de bibliothèques de variantes et code-barres
   1. Déterminez la taille théorique de la bibliothèque et calculez le nombre de variantes individuelles pour garantir > couverture de bibliothèque de 95 % (3x la taille de la bibliothèque recommandée) (voir la remarque de l’étape 2.5.).
   2. Calculer le volume requis de milieux LB supplémentés en antibiotiques en fonction du nombre de colonies à dépister (200 μL par colonie + 10 % de plus).
   3. Ouvrez le logiciel de traitement des liquides et cliquez sur Exécuter à côté du programme MTP Liquid Transfer (voir Fichier supplémentaire 1). Placez le fluide préparé dans la position correspondante du réservoir et remplissez le plateau de MTP vides selon la disposition. Réglez le programme pour distribuer 200 μL de support. Cliquez sur OK pour confirmer le démarrage du programme.
      REMARQUE : Assurez-vous toujours que les réservoirs et les pointes sont correctement alimentés à la plate-forme de manipulation de liquides avant de confirmer le démarrage du programme pour éviter toute perturbation.
   4. Répétez le programme autant de fois que nécessaire, scellez les MTP remplis avec une membrane respirante pour maintenir la stérilité.
   5. Transférez les plaques MTP remplies vers une plate-forme de sélection de colonie et descellez, transférez également les plaques carrées de P. putida transformées avec l’ADN de la bibliothèque de variantes plasmidiques vers la plate-forme de sélection de colonie. Utilisez le sélecteur de colonies pour inoculer chacun des puits de plaques de microtitration préremplis avec une seule colonie à partir des plaques de bibliothèque transformantes.
      REMARQUE : Assurez-vous que la profondeur minimale de la gélose est de 25 ml pour éviter d’endommager la tête de cueillette de la colonie.
   6. Refermez et transférez les plaques inoculées dans un incubateur hors ligne à 30 °C (800 tr/min), en veillant à ce que le contrôle de l’humidité soit activé à 75 % pour éviter l’évaporation de la culture. Laissez-les pousser pendant 16 h.
      REMARQUE : Après l’incubation, les cultures apparaîtront visiblement denses à l’œil nu, si ce n’est pas le cas, vérifiez à nouveau les besoins en milieux et en antibiotiques.
   7. Après 16 h de croissance, remettez les plaques cultivées sur la plate-forme du manipulateur de liquides et descellez-les. Cliquez sur Exécuter à côté du protocole Ajouter du glycérol au MTP (voir Fichier supplémentaire 1), assurez-vous que la disposition de la plaque à l’écran correspond à celle de la station d’accueil du manipulateur de liquides. Cliquez sur OK et autorisez l’exécution du protocole.
   8. Une fois terminé, refermez les plaques et mélangez brièvement dans un incubateur à agitation hors ligne (800 tr/min) pendant 5 min avant de coder à barres et de stocker à -80 °C.
   9. Répétez les étapes 3.2.7. et 3.2.8. jusqu’à ce que tous les MTP aient reçu du glycérol, aient été mélangés, munis d’un code-barres et stockés à -80 °C.
      REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à ce stade pour se préparer aux étapes de caractérisation ci-dessous. De plus, le blocage des plaques dans différentes séries expérimentales peut être planifié en fonction de la capacité de la plate-forme de traitement des liquides utilisée ou pour réduire la charge de travail en une seule séance.
3. Criblage de banques de variants
   1. Calculer le volume requis de milieux supplémentés en antibiotiques pour le nombre de DWB à remplir (~495 μL par puits + 10 % de plus).
   2. Cliquez sur Exécuter à côté du programme DWB Liquid Transfer (voir Fichier supplémentaire 1), assurez-vous que le média est ajouté au bon réservoir dans la disposition du programme. Assurez-vous que les DWB vides sont ajoutés aux positions de mise en page correspondantes et qu’une réserve suffisante d’embouts est disponible. Réglez le programme pour distribuer 495 μL de fluide. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur OK pour démarrer le programme.
   3. Scellez les DWB remplis à l’aide d’une membrane respirante et transférez-les dans un entrepôt temporaire à 4 °C, en répétant l’étape 3.3.2. jusqu’à ce que le nombre requis de DWB ait été rempli de support.
   4. Cliquez sur Exécuter à côté du programme Inoculer à partir du programme MTP décongelé (voir Fichier supplémentaire 1), assurez-vous que les cryostocks MTP et les DWB remplis sont transférés vers la plate-forme de traitement des liquides conformément à la disposition. Assurez-vous qu’une quantité suffisante d’embouts est fournie. Cliquez sur OK pour initialiser le programme.
      REMARQUE : Décongeler les plaques de stock sur de la glace pendant 30 minutes, seulement lorsque les programmes et les plaques préalables ont été préparés pour assurer une viabilité optimale des cellules.
   5. Une fois le programme terminé, sceller les DWB inoculés pendant la nuit avec une membrane respirante, puis transférer dans un incubateur à plaques hors ligne avec un contrôle de l’humidité de 75 % et laisser pousser pendant la nuit pendant 16 h à 30 °C (180 tr/min).
   6. Refermez, mélangez et remettez les MTP du cryostock dans le congélateur à -80 °C conformément à l’étape 3.2.8.
   7. Répétez les étapes 3.3.4. à 3.3.6. autant de fois qu’il faut jusqu’à ce que le nombre requis de DWB pour la nuit ait été inoculé et transféré dans l’incubateur.
      REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer le moment où chaque lot de plaques est ajouté à l’incubateur pour tenir compte du décalage entre les cycles pendant l’inoculation et d’utiliser le même ordre pour les étapes en aval.
   8. Calculer le volume requis de milieu complété par différentes concentrations d’effecteur et d’antibiotique en fonction du nombre de DWB de nuit à dépister (495 μL par puits + 10 % de plus). Chaque concentration d’effecteur nécessite son propre réservoir séparé dans le manipulateur de liquide.
      REMARQUE : Pour la caractérisation initiale, comme le dépistage ON/OFF, deux concentrations effectrices sont suffisantes (p. ex., concentration finale de 0 et 1000 μM). Afin de générer des données dose-réponse pour une caractérisation plus robuste, cette plage est portée à un minimum de quatre concentrations (p. ex., concentration finale de 0, 1, 25 et 1000 μM). Les systèmes répresseurs ne nécessitent pas l’ajout d’un effecteur pour déterminer la fonction, tandis que pour les activateurs, tels que le système décrit, un effecteur est nécessaire.
   9. Cliquez sur Exécuter à côté du programme DWB Liquid Transfer (voir Fichier supplémentaire 1). Assurez-vous que les réservoirs contenant des fluides complétés par un effecteur sont dans les bonnes positions, conformément à la disposition. Ajoutez des DWB vides dans la plate-forme de traitement des liquides. Assurez-vous que la plateforme dispose de suffisamment de pourboires. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur OK pour démarrer le protocole de génération des DWB de test.
   10. Après le remplissage, scellez les DWB d’essai avec une membrane respirante et transférez-les dans un stockage temporaire à 4 °C, puis remplissez la plate-forme de manipulation de liquides avec d’autres plaques vides.
   11. Répétez les étapes 3.3.9 et 3.3.10 autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que le nombre requis de DWB soit rempli.
   12. Cliquez sur Exécuter à côté du programme Transfert vers l’essai DWB (voir Fichier supplémentaire 1). Assurez-vous que les DWB d’essai non scellés contenant des milieux supplémentés en effecteur sont ajoutés aux bons emplacements dans la disposition du manipulateur de liquides.
   13. Transférez et descellez les DWB de nuit contenant des P. putida cultivés inoculés à l’étape 3.3.4. à la plate-forme de traitement des liquides, en veillant à nouveau à ce que la disposition soit strictement respectée. Assurez-vous que la plateforme dispose de suffisamment de pourboires. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur OK pour démarrer le protocole.
       REMARQUE : Le transfert et la mise en réseau des sous-cultures dans les plaques d’essai devront généralement être effectués par lots en fonction de la taille de la plate-forme de manipulation de liquides.
   14. Une fois le programme terminé, appliquez les scellés et transférez les plaques de dosage dans un incubateur hors ligne à 30 °C, avec 75 % d’humidité pendant 16 h (180 tr/min), le volume final du test sera de 500 μL à ce stade.
   15. Jeter les DWB de nuit après l’inoculation et répéter les étapes 3.3.12 à 3.3.14 au besoin jusqu’à ce que tous les DWB requis aient été inoculés et se développent dans des incubateurs hors ligne.
   16. Retirer les DWB de l’incubateur, les transférer dans une centrifugeuse et les cellules de granulés à 4000 x g, 18° C pendant 5 min. Videz le surnageant et placez les DWB centrifugés sur la plate-forme de traitement des liquides.
       REMARQUE : Les volumes de pastilles cellulaires peuvent varier en fonction de la concentration de l’effecteur ou de la variante, de plus, certaines pastilles peuvent apparaître plus visiblement fluorescentes à l’œil que d’autres.
   17. Calculez le volume de 1x PBS requis en fonction du nombre de DWB à cribler (500 μL par puits + 10 % de plus).
   18. Cliquez sur Exécuter à côté du programme Assay Setup - PBS Resuspension (DWB) (voir Fichier supplémentaire 1), réglez le volume de distribution à 500 μL, assurez-vous que 1x PBS est ajouté au bon réservoir, puis disposez les plaques centrifugées selon la disposition du manipulateur de liquide. Assurez-vous que vous disposez de suffisamment d’indices. Cliquez sur OK pour démarrer le programme.
       REMARQUE : Le lavage des cellules est effectué pour éliminer les milieux de croissance résiduels, qui peuvent produire une certaine autofluorescence.
   19. Refermez et retirez les plaques en suspension du manipulateur de liquide. Assurez-vous que les granulés sont complètement remis en suspension en vérifiant le dessous de la plaque. Continuez à transférer les DWB granulés dans le manipulateur de liquides et répétez l’étape 3.3.18. jusqu’à ce que toutes les plaques aient été remises en suspension.
   20. Cliquez sur Exécuter à côté du programme Configuration du test - Ajout de cellules et de PBS (MTP) (voir le fichier supplémentaire 1). Transférez les DWB remis en suspension à partir de l’étape 3.3.18. dans le manipulateur de liquides selon la disposition proposée. Transférez les MTP vides dans le manipulateur de liquides selon la disposition. Assurez-vous que le volume de distribution est réglé sur 200 μL et qu’il y a suffisamment d’embouts disponibles. Cliquez sur OK pour démarrer le programme.
   21. Transférez les MTP remplis (volume final d’essai de 200 μL) vers un lecteur de plaques multimode hors ligne, mesurez la fluorescence relative à une longueur d’onde d’émission d’excitation appropriée (par exemple, sfGFP lEx/lEm = 488/520) et OD₆₀₀ pour chaque puits de la plaque.
       REMARQUE : Les paramètres de longueur d’onde d’émission d’excitation dépendront du choix du gène fluorescent codé dans le vecteur d’expression. Assurez-vous que les réglages de gain sur le lecteur de plaques sont cohérents et permettent de distinguer les variantes basses et hautes sans saturer le détecteur.
   22. Répétez les étapes 3.3.20. et 3.3.21. jusqu’à ce que tous les DWP d’essai aient été transférés aux MTP et mesurés.

4. Traitement/transformation des données et classement différentiel

1. Effectuez une normalisation des données collectées en divisant la fluorescence GFP (RFU) enregistrée par la mesure OD₆₀₀ enregistrée pour chaque variant pour chacune des concentrations effectrices évaluées (0 et 1000 μM).
   REMARQUE : La plupart des lecteurs de plaques peuvent être programmés pour normaliser automatiquement la fluorescence par OD₆₀₀ lors de la collecte de données.
2. Calculez ON/OFF pour obtenir la plage dynamique de chaque variante en divisant le RFU/OD₆₀₀ à 1000 μM (ON) par le RFU/OD₆₀₀ à 0 μM (OFF). Tracez toutes les valeurs ON/OFF des variantes sous forme de nuage de points à l’aide de l’ON/OFF de la construction du biocapteur de base pour déterminer les variantes qui présentent une activité au-dessus du niveau de base.
   REMARQUE : La caractérisation initiale de la séquence de type sauvage²³ a déterminé que l’activation et la désactivation de la construction initiale du biocapteur utilisé dans le protocole étaient de 3,6 fois.
3. Pour une caractérisation approfondie, ajustez les données dose-réponse à l’aide d’une fonction de Hill avec une pente variable pour extraire les valeurs de CE50 et/ou de pente de Hill à l’aide d’un logiciel analytique.
   REMARQUE : Pour estimer la sensibilité et l’EC₅₀, collectez au moins quatre points de données couvrant la plage où la réponse passe d’une activation faible à une activation élevée, généralement la partie la plus raide de la courbe. Bien que plus de points de données améliorent la résolution et la précision, quatre points sont suffisants pour estimer le classement de sensibilité.
4. Dans l’ensemble complet des variantes, sélectionnez un sous-ensemble de variantes (par exemple, N = 100) en assurant une couverture équilibrée des classements souhaités, dans ce cas EC₅₀. Pour ce faire, identifiez les variants qui couvrent une large gamme dans EC₅₀, en veillant à ce que les variants de haut rang et de faible rang soient représentés proportionnellement. Supprimez les variantes redondantes (par exemple, celles dont le classement est similaire et dont l’impact sur la couverture de distribution est minime).
5. Après avoir sélectionné la bibliothèque d’échantillons de variante finale (par exemple, N = 100), transformez les données à l’aide de l’équation de transformation linéaire-logarithmique (lin-log) suivante (Eq.1).
   Équation 1 :
   
   où
   
   
   
6. Pour les valeurs EC50, attribuez +1 pour la plus élevée (la moins sensible) et -1 pour la plus basse (la plus sensible). Une moyenne géométrique de 0 correspond à des niveaux d’expression intermédiaires.

5. Génération définitive de la conception de l’écran / DoE

1. Pour explorer systématiquement l’espace de conception des biocapteurs, utilisez un plan de dépistage définitif (DSD). Cette conception est préférée en raison de sa capacité à explorer efficacement l’espace de conception tout en adaptant l’étude aux besoins spécifiques du système.
2. Cliquez sur la catégorie DOE , puis sélectionnez le bouton Plan de dépistage définitif dans le logiciel statistique (voir le fichier supplémentaire 2).
3. Définissez les facteurs expérimentaux (par exemple, RBS_trans , P_reg , RBS_out et P_out) en tant que variables continues en cliquant sur le bouton Continu et en les nommant, en veillant à définir les valeurs sur +1 et -1 (voir Fichier supplémentaire 3).
4. Définissez les réponses souhaitées (par exemple, ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Slope) en cliquant sur le bouton Ajouter une réponse et en personnalisant le nom (voir Fichier supplémentaire 4).
   REMARQUE : Définissez l’objectif de la réponse en cliquant sur le menu déroulant de l’objectif, sélectionnez Aucun ou Maximiser en fonction de l’objectif de la conception (par exemple, exploration ou optimisation).
5. Une fois les facteurs et les réponses définis, cliquez sur Continuer pour ouvrir l’onglet des options de conception. Sélectionnez Aucun bloc requis, puis cliquez sur le bouton Créer une conception (voir Fichier supplémentaire 5).
   REMARQUE : Des blocs peuvent être ajoutés pour isoler la conception des facteurs de nuisance (facteurs non d’intérêt principal). Cela peut ajouter de la complexité aux expériences ; Cependant, il est utilisé à la discrétion du chercheur.
6. Le logiciel générera un tableau de conception expérimentale décrivant les combinaisons spécifiques de facteurs à tester. Les parties génétiques des bibliothèques transformées lin-log correspondantes seront utilisées pour générer les 17 constructions correspondantes. Enregistrez et exportez la table de conception en cliquant sur Créer une table (voir Fichier supplémentaire 6).

6. Répétez l’étape 2 - Conception et assemblage des conceptions génétiques éclairées par le DoE

1. Commencer à construire les plasmides multivariables selon le plan DSD (Definitive Screening Design).
   1. Identifiez une variable initiale (par exemple, promoteur, RBS, etc.). Concevez et commandez des amorces pour linéariser le vecteur d’expression, assurez-vous que les amorces flanquent la région variable ciblée, assurant ainsi la suppression de tous les éléments de séquence préexistants.
   2. Concevez et commandez des amorces qui amplifieront spécifiquement les séquences de variants correspondant aux niveaux de bibliothèque prédéfinis (par exemple, -1, 0, +1) pour chaque nœud régulateur (P_out P_reg RBS_out RBS_trans). Assurez-vous que chaque amorce comprend des bras d’homologie de 30 pb qui sont complémentaires au site d’insertion du vecteur d’expression.
   3. Purifier l’ADN plasmidique de la culture cryo-stock correspondante aux niveaux de banque +1, 0 et -1 pour la variable identifiée via miniprep.
2. Configurer les réactions de PCR pour le vecteur d’expression linéarisé et les fragments de banque sur de la glace et déterminer la concentration du produit comme indiqué aux étapes 2.1.1 et 2.1.2.
   1. Répétez les étapes 2.3 à 2.4 du protocole pour effectuer l’assemblage Gibson du vecteur d’expression linéarisé et des fragments de bibliothèque. Assurez-vous d’utiliser des boîtes de Pétri de taille standard à ce stade.
   2. Cribler les colonies à l’aide du séquençage de Sanger pour confirmer l’assemblage correct de chacun des modèles de DSD suggérés, puis procéder à la transformation de P. putida (étapes 2.5 et 2.6).
   3. À l’aide de la PCR, confirmez la présence du bon plasmide dans les colonies transformées. Choisir les transformants confirmés et les inoculer dans 10 mL de LB complété par un antibiotique pour une croissance nocturne à 30 °C pendant 18 h (180 tr/min). Créer des cryostocks (25 % de glycérol final) et les stocker à -80 °C.

7. Dépistage et rationalisation des données

1. À partir de cryostocks, la traînée P . putida transformée avec les constructions de conception DSD pertinentes en gélose LB complétée par un antibiotique, incuber à 30 °C pendant 18 h pendant la nuit pour faire croître les colonies.
   1. Prélever trois colonies simples dans chaque boîte correspondant aux modèles de DSD suggérés et les faire cultiver pendant une nuit dans 10 mL de milieu LB complété par un antibiotique à 30 °C pendant 18 h.
   2. Le lendemain, chargez un DWB avec un gradient de concentration de l’effecteur allant de 0 mM à 1 mM (concentration finale) par rangée jusqu’à un volume total de 50 μL par puits. Diluer les cultures de nuit 1/100 dans des LB frais et ajouter 450 μL de culture dans le DWB sur le gradient de concentration.
   3. Répétez manuellement les étapes 3.3.14 et 3.3.16 pour obtenir les DWB développés, puis passez aux étapes 3.3.18 et 3.3.20 et exécutez-les manuellement. et 3.3.21. pour obtenir les données RFU/OD pour chaque variante suggérée.
2. Ajustez les données dose-réponse (RFU/OD) à l’aide d’une fonction Hill (avec pente variable), en extrayant les paramètres (facteurs) appropriés pour l’optimisation, tels que EC₅₀, pente Hill, plage dynamique ou plage opérationnelle. Transformez les données résultantes en log10 et entrez les paramètres extraits dans la table DSD pour chacune des conceptions testées.
   1. Effectuez une analyse de dépistage à deux niveaux pour identifier les facteurs significatifs affectant les performances des biocapteurs. Utilisez le rapport t de Lun et l’analyse de graphique semi-normale^{23, 30} pour déterminer quel facteur s’écarte de la distribution attendue et à conserver dans le modèle. Maintenir l’effet de l’hérédité, en veillant à ce que tout facteur significatif uniquement dans l’interaction soit également inclus individuellement.
   2. Effectuez une modélisation de régression par les moindres carrés standard (SLSR)³⁰ pour chaque variable de réponse indépendamment, en incorporant uniquement les facteurs significatifs identifiés. Évaluez les diagnostics du modèle de régression, y compris les graphiques résiduels, les tests de manque d’ajustement et les valeurs R², pour garantir un ajustement correct des données.
   3. Utilisez un profileur de réponse pour déterminer les paramètres de facteur optimaux en fonction des caractéristiques de biocapteur souhaitées. Définissez des fonctions objectifs pour chaque réponse (p. ex., maximiser la plage dynamique tout en minimisant l’EC₅₀) afin de générer des paramètres de facteurs qui permettent d’obtenir le meilleur équilibre entre toutes les réponses tout en tenant compte des contraintes et des compromis du système.
3. Revenez aux bibliothèques de variantes et construisez le biocapteur optimisé selon les modules suggérés par le profileur de réponses, en suivant les étapes 6.1 à 6.2 du protocole. Valider les performances de la construction optimisée via la caractérisation dose-réponse.

Results

Initialement, les modules censés avoir un impact sur le fonctionnement des biocapteurs doivent être sélectionnés pour varier ; cela peut inclure la régulation des protéines de transport, qui peuvent affecter la concentration intracellulaire des ligands et donc la sortie du biocapteur, mais inclut également les niveaux relatifs de transcription et de traduction de l’aTF lui-même, ainsi que le rapporteur fluorescent ou le gène de sortie (Figure 1). La figure 2 illustre un flux de travail typique utilisé dans le développement d’une expérience basée sur le DoE pour l’optimisation des biocapteurs ; en commençant par l’organisation des éléments régulateurs en modules distincts susceptibles d’être manipulés par la biologie synthétique par des changements au niveau de la séquence, en particulier dans les sites d’opérateurs, les hexbox ou les RBS (Figure 2A). En tant que telle, la prochaine étape du flux de travail DoE est la randomisation des sites de séquence afin de générer des bibliothèques de variants (Figure 2B). Le degré de randomisation doit être soigneusement pris en compte, car le nombre de colonies dépistées doit correspondre au degré de randomisation 4^N, où N est égal au nombre de positions de base aléatoires. Le fait de traiter chaque promoteur unique ou séquence RBS comme une variable catégorielle unique dans le DoE augmenterait le nombre de constructions requises à des niveaux expérimentalement irréalisables, car une telle conversion en variables continues par la caractérisation des bibliothèques est une étape de triage nécessaire pour évaluer la plage de fonctions acquises par randomisation et pour définir les valeurs supérieure, moyenne, et les limites inférieures de la fonctionnalité. Ceci est d’abord réalisé par l’analyse de la production des banques comme mesure de la force de la variante RBS ou promotrice à travers un gène rapporteur (Figure 2C). Une transformation lin-log est effectuée, comme illustré, pour discrétiser les variables continues en niveaux qui peuvent être utilisés par le DoE pour explorer différentes combinaisons et pour développer un modèle qui décrit les effets de ces variants. Un plan de dépistage est ensuite mis en œuvre à l’aide de 3 niveaux qui décrivent la plage d’activité de chaque facteur de manière combinatoire (figure 2D). Grâce à l’assemblage et à la mise à l’essai des conceptions proposées, l’espace expérimental est exploré efficacement et les interactions entre les facteurs sont révélées. L’analyse statistique des données résultantes est utilisée pour déterminer quelle combinaison de facteurs a l’effet le plus significatif sur la sortie du biocapteur, et la SLSR est utilisée pour prédire le comportement du système selon différents critères, facilitant l’optimisation du biocapteur vers des résultats spécifiques tels que l’augmentation de la plage dynamique ou de la sensibilité (Figure 2D).

Graphique 3 démontre l’assemblage et le criblage d’une bibliothèque de promoteurs régulée par aTF. Un assemblage isotherme à l’aide d’un oligonucléotide dégénéré a été effectué pour créer une banque codée par un plasmide, dans laquelle chaque plasmide est randomisé de manière unique à des positions spécifiques. Le degré de diversité des bibliothèques déterminera en fin de compte le nombre de colonies à cribler, les plus grandes bibliothèques théoriques bénéficiant grandement de l’automatisation. L’analyse de la séquence du promoteur d’opérons homologues à TphR a fourni une carte de conservation des bases qui a été utilisée pour informer les emplacements de randomisation, en particulier les bases qui présentaient un certain degré de variation et qui pouvaient donc moduler l’activité sans être absolument essentielles²³. Trois bases dans chacune des cases hexagonales -35 et -10 ont été ciblées pour une randomisation complète, en plus de six bases dans le site de l’opérateur (Graphique 3A), ce qui a abouti à une bibliothèque de promoteurs théoriques de ~500 000. La banque de plasmides a ensuite été utilisée pour transformer la souche hôte. À ce stade, une bonne efficacité de transformation est cruciale afin d’obtenir une couverture de bibliothèque suffisante avec les approches de dépannage courantes présentées dans Graphique 3B. L’optimisation des concentrations d’ADN, de la méthode de transformation et de la conception du clonage peut améliorer considérablement les rendements des transformants. Graphique 3C Lors de l’obtention de transformants, des colonies individuelles correspondant à des variantes uniques doivent d’abord être cultivées dans un milieu avant que tout travail de caractérisation puisse commencer. Afin de couvrir la taille de la bibliothèque théorique, un grand nombre de variantes devront être sélectionnées et rangées en plaques. L’utilisation de systèmes automatisés tels que les manipulateurs de liquides et les cueilleurs de colonies peut banaliser cette étape à forte intensité de main-d’œuvre. Étape 1 de Graphique 3C illustre le transfert des milieux de croissance dans les PTM qui ont été chargés manuellement dans le quai de la manipulatrice de liquides, suivi d’une inoculation automatisée par un cueilleur de colonies. Certaines étapes, telles que le scellement des plaques et leur transfert vers des incubateurs hors ligne, sont manuelles mais peuvent également être automatisées si vous le souhaitez. Suite à la croissance des cultures, les manipulateurs de liquides peuvent également être utilisés pour générer des cryo-stocks par l’ajout de glycérol, comme le montre la Graphique 3C. À ce stade, le code-barres des plaques garantira que chaque variante choisie sera liée à une plaque spécifique et à l’emplacement du puits, ce qui permettra un référencement facile pour une caractérisation plus poussée en aval. L’un des principaux avantages des approches automatisées, outre la réduction de la main-d’œuvre, est la réduction des erreurs humaines, les erreurs au stade de la préparation de la bibliothèque étant moins susceptibles d’être reportées. Étape 2 de Graphique 3C illustre la phase de caractérisation automatisée de la préparation des bibliothèques. Cela commence via le remplissage des DWB avec des milieux à l’aide de la plate-forme de manipulation de liquides, suivi de l’inoculation à l’aide des cryo-stocks à code-barres. L’automatisation à ce stade permet de minimiser les erreurs de pipetage et la main-d’œuvre. Les plaques sont ensuite scellées et transférées manuellement dans des incubateurs hors ligne pour la croissance, après quoi l’installation de composés effecteurs dans de nouvelles plaques à puits profonds peut être initiée. Dans le cadre d’un criblage initial des bibliothèques de composants, un simple criblage ON/OFF peut être souhaitable car il peut être utilisé pour présélectionner des variantes non fonctionnelles qui présentent une activité égale ou inférieure à celle de la construction de base et enrichir le pool de variantes pour celles qui présentent une activité améliorée. Cela présente l’avantage supplémentaire de réduire les coûts des matériaux des pointes et des plaques, ce qui peut devenir prohibitif dans les protocoles de criblage des grandes bibliothèques. Cependant, lorsque l’optimisation de paramètres de performance de biocapteurs plus complexes est nécessaire (p. ex., EC₅₀), des concentrations effectrices supplémentaires seront nécessaires. Après la croissance des cultures, les plaques sont renvoyées à la plate-forme de traitement des liquides, qui commence à inoculer les plaques contenant des composés effecteurs avant d’être renvoyées manuellement à l’incubateur une fois de plus pour la durée du test. Figure 3D Illustre la dernière étape d’automatisation avant la collecte des données. Après la période écoulée de croissance et d’activation des biocapteurs, les plaques sont retirées de l’incubateur hors ligne et renvoyées sur la plate-forme de traitement des liquides. Pour éliminer les milieux de croissance résiduels, qui peuvent interférer avec la collecte de données de fluorescence, la centrifugation, l’élimination du surnageant et le lavage des cellules avec 1x PBS sont nécessaires. L’utilisation de manipulateurs de liquides peut à nouveau banaliser ce processus, la remise en suspension automatisée des cultures permettant un traitement rapide des plaques, y compris le transfert des cellules lavées vers des MTP au format 96 puits pour le criblage. La collecte de données peut être effectuée de manière manuelle ou automatisée, certains lecteurs étant équipés de piles de plaques qui peuvent s’interfacer avec les manipulateurs de liquides pour automatiser davantage le processus de collecte de données. En comparant le rapport entre l’activation du biocapteur en présence d’effecteur (ON) et son absence (OFF), 5 000 variants ont été évalués à l’aide du degré d’activation du biocapteur (changement de pli) pour déterminer la fonction du biocapteur ; Seules les variantes dont l’activité était supérieure à celle de la construction de base (3,6 fois) ont été retenues pour une caractérisation plus approfondie, comme l’indique la région ombrée rouge-rose du nuage de points (Figure 3D). Sur la base des positions des plaques et des puits du pool de variantes enrichies, une caractérisation robuste à l’aide de réplicats biologiques ou de différentes concentrations effectrices peut ensuite être effectuée en se référant aux plaques de cryostock à code-barres originales générées à l’étape 1 du flux de travail.

La figure 4 montre le criblage des variants triés à partir du criblage initial de la banque visant à développer une banque de promoteurs pour optimiser la sensibilité. À l’aide des données des 5 000 variants examinés dans le flux de travail précédent, un groupe trié de 226 variants du dépistage initial ON/OFF, déterminé comme étant plus actif que la séquence parentale, a ensuite été caractérisé et classé en fonction de leur sensibilité, afin de servir de niveaux autour desquels un DSD pourrait être conçu. Dans un premier temps, les variables catégorielles, dans ce cas les variantes P_{en haut} , doivent être converties en variables continues qui couvrent une large plage de sensibilité. Pour évaluer la sensibilité, il est nécessaire d’utiliser des courbes dose-réponse pour obtenir des données de_CE-50 à partir d’une fonction de Hill tracée ; cela augmente considérablement le travail de placage et est bien adapté à l’automatisation à l’aide de manipulateurs de liquides pour simplifier le processus de configuration et de criblage des tests, comme le montre la figure 4A. Conformément au flux de travail établi à l’étape 2 de la figure 3C, les codes-barres des plaques et les positions des puits correspondant au pool enrichi de variants ont été utilisés pour inoculer des DWB remplis de milieux de croissance et d’antibiotiques. Pour améliorer la robustesse expérimentale, les variants ont été criblés en triple plicat. Après le transfert des plaques dans l’incubateur hors ligne pour la croissance, les DWB frais ont été remplis de milieux de croissance enrichis par des effecteurs de 0, 1, 25 et 1000 μM à l’aide des manipulateurs de liquides pour réduire la main-d’œuvre. Afin de réduire le nombre de plaques requises pour l’essai, une plage de concentration englobant le milieu inférieur et le haut de la courbe a été choisie, les concentrations médianes révélant les sensibilités relatives de chaque variante, comme l’illustre la figure 4A. Après l’inoculation des mélanges variants à chaque concentration effectrice et l’analyse de la fluorescence et de la DO₆₀₀, des courbes dose-réponse ont été tracées, avec une analyse de régression non linéaire utilisée pour déterminer la CE₅₀. À ce stade, une bibliothèque brute de chaque variante avec une valeur EC₅₀ unique a été générée, les 100 variantes les plus robustes étant reprise, comme le montre la figure 4B , afin de réduire davantage la taille de la bibliothèque. Cependant, avant que cette bibliothèque puisse être utilisée dans DoE, la conversion des variantes uniques en une bibliothèque classée, représentant la plage de sensibilité contenue à l’intérieur, doit être générée. Pour ce faire, nous avons effectué une transformation lin-log des données, qui classe et redimensionne les données de sorte que chaque variante soit classée de la plus sensible (-1) à la moins sensible (+1), ainsi qu’en définissant une valeur médiane (0), qui représente la moyenne géométrique de l’ensemble de données Figure 4C. La transformation des données brutes a produit le graphique bleu illustré à la figure 4D, à partir duquel les séquences discrètes de P_sortant correspondant à +1, 0 et -1 ont été intégrées dans le plan de criblage définitif en tant que niveaux de facteur_{de sortie} P.

Graphique 5 démontre le flux de travail complet après la génération de la bibliothèque, de la génération DSD à la modélisation et à l’optimisation globale d’un biocapteur basé sur les apprentissages assistés par le DoE. Graphique 5A présente une décomposition d’un biocapteur typique en 3 modules avec 1 (modules de transport et de régulation) ou 2 (module de sortie) nœuds de régulation. Suivant l’exemple de Graphique 4, des bibliothèques RBS ou de promoteurs auront été développées, et des niveaux allant de +1, 0 et -1 auront été sélectionnés pour englober la plus grande variation de chaque facteur. La taille des bibliothèques sélectionnées déterminerait généralement le nombre d’expériences nécessaires pour explorer pleinement l’espace de conception, par exemple, si chaque bibliothèque était de taille 22, cela équivaudrait à 22⁴ (234,256) combinaisons. Le DoE vise à simplifier la charge de travail expérimentale en réduisant le nombre de combinaisons grâce à des conceptions de criblage structurées. Bien que de nombreuses méthodologies soient possibles, le DSD est idéal pour le développement de biocapteurs car il permet d’identifier les facteurs principaux et les interactions à deux facteurs tout en évitant les effets de second ordre. De plus, comme les conceptions DSD utilisent 3 niveaux, il est possible d’estimer la courbure (non-linéarité). Graphique 5A démontre une sortie DSD typique où chacun des 4 modules est réglé à des niveaux différents ; comme chaque niveau correspond à un promoteur particulier ou à une variante RBS, l’assemblage isotherme est utilisé pour générer les constructions génétiques correspondant aux conceptions recommandées du DSD. Après avoir assemblé et transformé la souche hôte à l’aide des constructions recommandées, des courbes dose-réponse sont ensuite obtenues à l’aide d’une gamme complète de concentrations effectrices afin d’offrir une plus grande confiance dans la performance de chacune des constructions Graphique 5B. Comme le DSD réduit considérablement le nombre de constructions, cette étape peut souvent être effectuée à la main ou à l’aide de manipulateurs de liquides automatisés si vous préférez. Graphique 5C présente le résultat du profil de prédiction obtenu après la construction et le test des combinaisons suggérées à partir de l’écran DSD et la construction de modèles prédictifs basés sur le coefficient de Hill (n_H) et EC₅₀ sortie de chaque combinaison testée. L’objectif de l’expérience était de développer une construction de biocapteur optimisée à l’échelle mondiale pour atteindre à la fois n_H et EC₅₀ par modulation de l’expression des 4 nœuds régulateurs pour maximiser les deux paramètres. Chaque facteur de régulation est représenté dans sa propre colonne avec le degré d’expression indiqué le long de l’axe des x correspondant au promoteur transformé en lin-log et aux bibliothèques de parties RBS (-1 à +1). L’effet de la modification de l’expression des nœuds sur les deux EC₅₀ et n_H est indiqué par les courbes dans les sous-parcelles. Les tracés de profil mettent en évidence la nature souvent peu intuitive de l’optimisation des biocapteurs, où le réglage d’un nœud régulateur peut avoir des effets opposés sur les paramètres de sortie. Par exemple, RBS_Trans n’a pas de forte corrélation avec n_H,_{cependant, il est positivement corrélé avec la CE50} de manière non linéaire. Des interactions d’ordre supérieur (non linéaires) sont également impliquées, dans le cas de RBS_dehors Une augmentation de la force augmentera la pente (n_H) avec une augmentation concomitante de la sensibilité (EC plus faible₅₀), ce qui se traduit par une courbe avec une pente plus numérique et une réponse plus nette à l’augmentation de la concentration de l’effecteur. À partir de ces modèles, les facettes non intuitives du réglage des biocapteurs peuvent être rendues plus claires, ce qui permet d’optimiser les nœuds de régulation vers un optimum global. Les modèles ont été utilisés pour prédire l’optimum global pour les deux CE₅₀ et n_H , les lignes rouges du graphique indiquant les niveaux optimaux de chaque nœud régulateur (Graphique 5C). Graphique 5D démontre le profil dose-réponse de la construction initiale du biocapteur parental (bleu) par rapport à la conception DSD la plus performante (vert) et à la construction optimisée à l’échelle mondiale (Lilas). Utilisation du modèle pour prédire les résistances idéales du module pour maximiser l’EC₅₀ et n_H, un variant correspondant à RBS_Trans (-1), P_Reg (-0,7), P_dehors (-0,3) et RBS_dehors (+1) a été assemblé et caractérisé avec la construction optimisée montrant des améliorations en EC₅₀ et n_H (Graphique 5D). Alors que le DSD et les biocapteurs optimisés à l’échelle mondiale affichent des EC similaires₅₀ (0,8 vs 0,7 μM), n_H s’est considérablement amélioré sans compromettre la₅₀ des gains qui avaient déjà été réalisés. Les résultats démontrent clairement les avantages de la conception basée sur les données par rapport aux approches basées sur l’intuition et servent à valider le DoE comme moyen de rationaliser et de simplifier le processus de réglage des biocapteurs.

Figure 1 : Réglage des paramètres des biocapteurs génétiquement codés. Disposition des modules génétiques d’un biocapteur génétiquement codé, y compris aTF, les sites d’opérateur (OS), les hexbox (-35, -10) et les composants RBS. Les cases colorées correspondent à des interactions qui affectent généralement les paramètres des biocapteurs tels que : l’affinité ligand-aTF (gris), l’opérateur aTF (rose), le RNAP-Hexbox (vert) et le RBS (orange). Les effets de chaque paramètre sur les caractéristiques dose-réponse sont indiqués dans les graphiques représentatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble d’un flux de travail typique d’optimisation de biocapteurs DoE. (A) Vue d’ensemble de la modularisation des composants du biocapteur montrant un module de transport codant pour une protéine de transport pour importer l’effecteur cible, un module régulateur appartenant à l’aTF et un module de sortie qui code pour une protéine rapporteure telle que sfGFP. Sont également illustrés les nœuds de régulation, tels que RBS_trans, P_reg, P_out et RBS_out, qui correspondent aux nœuds génétiques qui seront soumis à la randomisation afin d’explorer les paramètres des biocapteurs. (B) Une sélection d’éléments de séquence susceptibles d’être randomisés en base, y compris les promoteurs et les RBS. La séquence parentale du promoteur est indiquée sur la ligne du haut, avec la séquence mutante finalisée illustrée ci-dessous, les étoiles indiquent des bases inchangées, tandis que K, M et N se réfèrent à la guanine/thymine, à l’adénine/cytosine ou à n’importe quel nucléotide, respectivement. Les promoteurs offrent un plus grand potentiel de randomisation en ciblant des hexbox ou des sites d’opérateurs et peuvent également inclure la duplication ou la modification de l’espacement des séquences. Les bibliothèques RBS offrent des options de randomisation plus limitées, mais elles sont nettement plus faciles à cribler en raison de leur diversité maximale plus petite. (C) Les niveaux d’expression des variants sont caractérisés, puis convertis en une bibliothèque lin-log classée pour convertir les facteurs de variants catégoriels en 3 niveaux discrets qui se prêtent mieux à l’analyse par DoE. (D) La cartographie de l’espace expérimental est effectuée à l’aide de combinaisons multiplexées des trois niveaux de chaque module pour générer un modèle qui peut être utilisé pour éclairer les choix de conception afin d’ajuster les performances des biocapteurs en fonction des résultats souhaités, qu’il s’agisse d’une plage dynamique ou d’une sensibilité différente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Modularisation du biocapteur, construction d’une bibliothèque de promoteurs et flux de travail automatisé. (A) Exemple de randomisation de séquences spécifiques dans le promoteur aTF et d’insertion dans la construction du biocapteur via un assemblage isotherme. Les lettres en gras indiquent les positions qui ont été randomisées dans le site de l’opérateur ou les boîtes hexagonales selon la clé fournie lors de la synthèse d’oligonucléotides dégénérés. (B) Panel décrivant la transformation de la banque de variantes de biocapteur résultante en un hôte de clonage tel que E. coli, et les prochaines étapes en fonction du rendement du transformant. Une faible efficacité de transformation peut entraîner une mauvaise couverture théorique de la bibliothèque et une exploration inadéquate de l’espace de conception. À ce stade, il est impératif de dépanner les variants pour s’assurer qu’une partie importante des variants est disponible pour la caractérisation, avec des mesures de dépannage communes décrites. (C) Déroulement des étapes 1 et 2 tel que décrit dans le protocole, le symbole de la main rouge indiquant les étapes manuelles et le rouage indiquant les étapes automatisées. Le flux de travail de l’étape 1 met en évidence les étapes clés du protocole, de la sélection de la colonie à la génération du stock cryogénique. Le flux de travail de l’étape 2 démontre la revitalisation et la réorganisation des cryo-stocks pour le dosage par la courbe dose-réponse. (D) Le panel démontrant la procédure finale avant le dépistage, y compris le lavage des cellules et le transfert sur des plaques d’essai avant la mesure de la fluorescence et de la DO. Un groupe de variantes filtrées de 5000 est présenté dans le panneau, les variantes démontrant ON/OFF au-delà de la séquence du promoteur parental (3,6 fois) mises en évidence dans l’encadré orange. On peut voir que de nombreuses variantes se regroupent autour de 1, ce qui indique une faible performance et une faible variabilité, probablement en raison de la randomisation au niveau de la séquence entraînant une perte de fonction. Les 226 variantes montrées en encadré dans le graphique ont été représentées pour une caractérisation robuste. Les données ont été adaptées de la publication originale d’Alvarez Gonzalez et al²³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Criblage et discrétisation des variantes supérieures de la bibliothèque de promoteurs par transformation lin-log. (A) Aperçu de la procédure standard de génération de données d’expression pour une bibliothèque RBS ou promoteur. À l’aide des variants triés qui représentent une bonne gamme de niveaux d’expression, les manipulateurs de liquides sont utilisés pour générer des plaques de dosage préremplies avec une concentration prédéterminée d’effecteur à partir desquelles dériver les courbes dose-réponse des 226 variants triés. (B) Après la détermination de la CE₅₀ et la réduction supplémentaire de la bibliothèque caractérisée à 100 variants, les données sont représentées sous forme de graphique à barres montrant la combinaison de différentes sensibilités générées par la randomisation du promoteur. (C)Les données EC₅₀ sont transformées à l’aide de l’équation de vitesse lin-log pour convertir l’ensemble de données continues en un ensemble de données catégorielles plus adapté à la factorisation dans un DSD. (D) Les données transformées de la variante EC₅₀ sont maintenant réduites à une échelle simplifiée et classées de l’activité EC₅₀ élevée à faible. À partir de là, 3 niveaux correspondant aux variantes supérieure (+1) de la moyenne géométrique (0) et inférieure (-1) sont sélectionnés et seront reportés dans le DSD pour explorer l’espace expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Conception expérimentale DSD, tests et résultats d’apprentissage basés sur un modèle. (A) Flux de travail schématique montrant la génération d’une table de conception DSD basée sur les bibliothèques classées transformées lin-log des modules RBS_trans, P_reg, P_{out et RBSout}. La table de conception DSD suggère le plus petit nombre de combinaisons pour cartographier efficacement l’espace expérimental. Un exemple de sortie est donné dans lequel +1, 0 et -1 font référence aux variantes performantes supérieures, intermédiaires et inférieures pour chaque nœud réglementaire, comme décrit par les transformations lin-log. Ceux-ci sont construits par assemblage isotherme et confirmés par séquençage avant d’être transformés en hôte d’expression pour la caractérisation. (B) Après la transformation, les cellules sont cultivées et testées par rapport à une large gamme de concentrations effectrices, et la sortie fluorescente est mesurée pour générer des courbes dose-réponse. Divers paramètres, tels que nH et CE50, sont extraits des courbes dose-réponse et introduits dans le DSD pour générer des modèles prédictifs pour chaque facteur. (C) À l’aide des modèles, il est possible de faire des prédictions sur l’impact de la modulation d’un paramètre de biocapteur en modifiant le niveau d’expression de n’importe quel module de régulation. Il est important de noter que le réglage global des nœuds régulateurs devient possible, permettant de maximiser simultanément un ou plusieurs paramètres du biocapteur, indiqués par les lignes rouges pointillées dans chaque sous-parcelle. (D) L’optimisation du modèle vers une sensibilité maximale permet d’obtenir la construction optimisée à l’échelle mondiale (lilas), dont la courbe dose-réponse est tracée par rapport à la construction DSD la plus performante (vert) et à la construction du biocapteur parental (bleu). Les paramètres n_H et EC₅₀ extraits sont présentés sous le graphique, démontrant l’amélioration des deux paramètres au-dessus de la construction DSD la plus performante, validant l’efficacité des modèles prédictifs générés à partir du DSD. Les données ont été adaptées de la publication originale d’Alvarez Gonzalez et al²³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Étapes du protocole de manipulation automatisée des liquides utilisées pour la préparation de la bibliothèque de biocapteurs et la configuration des essais. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 à Figure supplémentaire 6 : Génération étape par étape d’un plan de dépistage définitif (DSD). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Des bibliothèques d’éléments génétiques englobant une large variabilité génétique sont cruciales pour le succès d’une méthodologie basée sur le DoE. Comme le montre la figure 2A, le nombre de variants théoriques augmente avec le nombre de positions à cibler pour la mutagénèse ainsi que le degré de randomisation, cette taille de bibliothèque en constante augmentation créant des goulets d’étranglement importants dans le dépistage. La réduction du nombre de positions ciblées ou du degré de randomisation peut réduire le nombre de variants qui doivent être dépistés et constitue une approche attrayante si une approche plus ciblée de l’ajustement est nécessaire ou s’il existe une connaissance a priori significative du système à titre indicatif. Cependant, dans le cas de systèmes tels que les biocapteurs, qui présentent de nombreuses caractéristiques qui se chevauchent ou qui peuvent ne pas avoir d’éléments génétiques bien caractérisés, il est difficile de contourner l’exigence de taille de la bibliothèque. L’utilisation de manipulateurs de liquides automatisés peut banaliser le travail de cueillette des colonies et de la culture des variantes, en particulier lorsqu’une collecte accrue de points de données est nécessaire pour le traçage de fonctions plus avancées telles que les courbes dose-réponse par rapport à deux comparateurs de points de données, tels que ON/OFF. Bien qu’il soit difficile de quantifier spécifiquement le temps économisé grâce à l’inclusion de flux de travail automatisés, Le principal avantage de sa mise en œuvre réside dans le temps qui peut être consacré à d’autres expériences parallèles³⁸.

Malgré cela, dans de nombreux cas où la taille des bibliothèques dépasse 10⁴, même les méthodologies assistées par la manipulation de liquides deviennent impraticables³⁹. Dans de tels cas, un dépistage préliminaire des variants à l’aide de cytomètres en flux est une approche très attrayante, avec une capacité de tri beaucoup plus importante allant jusqu’à 10⁷ cellules par h⁴⁰. L’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec deux cycles de sélection positive et au moins un cycle de sélection négative a été couramment utilisée dans le triage des variants les plus performants des biocapteurs avant une caractérisation plus poussée 16,26,42. L’élaboration et l’exécution de tels protocoles à l’aide du FACS ont été examinées en détail ailleurs³¹. Les cribles de triage initiaux sont possibles à l’aide d’essais de manipulation de liquides sur plaque, comme indiqué dans le protocole ci-dessus ; En comparant les données ON/OFF à l’aide d’une seule concentration effectrice, comme le montre la figure 3D, seuls les biocapteurs variants avec un gain de fonction appréciable (3,6 fois comme indiqué dans les méthodes) peuvent être sélectionnés pour une caractérisation plus détaillée, rationalisant le développement de banques et la durée d’exécution expérimentale. Cependant, les plateformes FACS et de traitement des liquides s’accompagnent d’investissements en capital importants pour le laboratoire et nécessitent souvent un certain niveau d’expertise technique pour leur exploitation et leur maintenance. Les cribles à base de plaques de gélose offrent une barrière technique et financière plus faible à l’entrée, et ont été utilisés en combinaison avec le criblage gfp ou le criblage de colonies bleu-blanc pour sélectionner des variantes de la banque RBS ainsi que des mutants enzymatiques en fonction de l’intensité de la fluorescence ^43,44. Ceux-ci sont toutefois limités dans le nombre de variants qui peuvent être efficacement dépistés, mais nécessitent également une différence significative de fluorescence pour être détectables⁴⁴. En tant que compromis entre la mutation simultanée entièrement combinatoire de plusieurs éléments à la fois, une méthodologie « diviser pour régner » vise plutôt à diviser de grandes bibliothèques de variantes en blocs de criblage plus gérables⁴¹. Bien qu’une approche modulaire puisse être pragmatique, elle n’explore pas efficacement l’espace de conception combinatoire, car la performance des composants biologiques est connue pour dépendre fortement du contexte, en particulier chez les bactéries, où le couplage transcriptionnel et translationnel est répandu. Cela peut aboutir à des choix de conception qui ciblent les maxima locaux au lieu des optima globaux.

Le transport et la reconnaissance d’inducteurs spécifiques représentent une autre caractéristique importante du développement des biocapteurs qui mérite d’être mentionnée, bien qu’elle ne soit pas l’objectif principal du protocole décrit. L’absence d’un aTF approprié pour la molécule cible représente un défi important pour les chercheurs. La sélection rationnelle d’un aTF existant qui se lie à un analogue structurel de l’effecteur cible peut fournir un modèle idéal sur lequel appliquer la randomisation des codons afin d’ajuster la spécificité de l’aTF à l’effecteur souhaité¹⁷. L’alignement de la séquence cible sur les structures résolues ou les prédictions Alphafold peuvent permettre l’identification de sites de liaison effecteurs avec des résidus d’acides aminés suspectés soumis à une randomisation et à un classement semi-rationnels, adaptables au protocole¹⁷. De même, la sélection et la modulation des transporteurs responsables de l’importation/exportation d’effecteurs peuvent modifier considérablement les caractéristiques dose-réponse des biocapteurs. L’expression du gène du transporteur s’est avérée être un acteur significatif de la réponse des biocapteurs, avec une bibliothèque diversifiée de promoteurs de P_tac et de RBS contrôlant l’expression d’un transporteur MucK utilisé pour stabiliser son expression sur plusieurs cycles de FACS, améliorant ainsi la robustesse de la réponse du biocapteur¹⁷. De même, le criblage de différentes protéines de transport elles-mêmes peut moduler la spécificité des biocapteurs, le criblage d’un ensemble putatif de transporteurs PcaK à l’aide d’un biocapteur sensible au PCA conduisant à l’identification de deux transporteurs capables de capturer des substrats 3,5-hydroxylés, élargissant ainsi l’ensemble des composés détectables par ce système²⁴.

Les plateformes automatisées peuvent devenir des outils de caractérisation et d’exploration encore plus puissants lorsqu’elles associent les principes DoE aux modèles d’apprentissage profond^46,47. Après avoir d’abord exploré l’espace de conception d’un biocapteur avec une plate-forme à haut débit, des algorithmes d’apprentissage automatique ont été exploités pour prédire la fonction de séquences non caractérisées avec une bonne précision ⁴⁷. Les méthodes décrites dans ce protocole pourraient facilement être appliquées dans la mise à l’essai de nouveaux modèles d’apprentissage du langage pour la conception de promoteurs, semblables aux modèles qui ont été développés sur la base de la prédiction de séquence inter-RBS⁴⁸. De plus, l’intégration de tels modèles peut tirer parti des données de séquence-fonction contenues dans les conceptions de promoteurs non fonctionnels et fournir des informations essentielles sur la fonctionnalité plus large du biocapteur dans son ensemble. En effet, cela aurait le potentiel de résoudre une limitation cruciale du flux de travail du DoE, à savoir que les faux positifs, par exemple un promoteur non fonctionnel, n’équivalent pas nécessairement à une sortie mesurée de zéro, avec des phénomènes tels que la transcription parasite ou l’introduction d’un élément de bruit dans les données du DoE, qui est difficile à identifier et à contrôler. De manière cruciale, afin d’englober l’ensemble de l’espace de conception expérimentale, toute bibliothèque générée doit présenter un large éventail d’activités, car une plage d’activité insuffisante entraînera des résultats de conception biaisés et créera un manque de fiabilité dans tous les modèles statistiques générés à partir de l’ensemble de données³⁰. Si la faible variabilité des banques devient un problème, l’exploration d’autres éléments de séquence ou l’augmentation du degré de randomisation peuvent être mises en œuvre, et la variation entre les bibliothèques peut être comparée jusqu’à ce qu’un pool de variantes approprié soit atteint.

Un aspect crucial du processus DoE implique l’estimation et la sélection correctes des effets primaires et secondaires obtenus à partir du DSD, qui seront ensuite incorporés dans l’analyse statistique. Le DoE, étant une approche basée sur la modélisation, est très sujet au surajustement et au biais, ce qui peut rapidement compliquer le processus d’optimisation en guidant les efforts d’ingénierie itérative vers des sections sous-optimales de l’espace de conception⁴⁹. En tant que tel, il est essentiel de s’assurer que toutes les conceptions sont solidement isolées de ces effets, tant au stade de la conception que de l’analyse des données. À l’étape de la conception initiale du dépistage, des essais centrés où tous les facteurs sont réglés sur la moyenne géométrique (c’est-à-dire 0,0,0,0) peuvent aider à réduire le biais du modèle en tenant mieux compte des interactions non linéaires, sans ajouter de fardeau expérimental significatif (1 à 3 essais supplémentaires)⁴⁹. De plus, l’inclusion de plans randomisés peut aider à tenir compte des variables étrangères qui ne sont pas incluses dans le plan expérimental, mais qui pourraient tout de même influencer les variables de réponse mesurées. Dans un contexte biologique, la randomisation aborde des problèmes tels que les effets spatio-temporels, tels que la position de la plaque, ou la variation d’un lot à l’autre, empêchant ces effets d’affecter de manière significative l’interprétation des données. L’attention portée à ces détails à ce stade précoce peut améliorer la robustesse des modèles et conduire à des conclusions plus fiables. Après avoir réalisé les expériences suggérées par DSD, une analyse statistique des données est nécessaire pour élucider les facteurs qui ont eu un impact significatif sur les paramètres de sortie. Les graphiques semi-normaux offrent une représentation visuelle intuitive des amplitudes des effets, les effets sans signification tombant généralement le long d’une ligne droite, tandis que les effets ayant un impact significatif s’écartent de cette ligne, ce qui permet de sélectionner facilement les facteurs les plus importants dans l’optimisation des biocapteurs. Dans cette optique, une approche conservatrice de la sélection des effets doit être adoptée, comme pour toute modélisation, afin de réduire le risque de surajustement du modèle.

La capacité de concevoir et d’optimiser rapidement des biocapteurs et d’autres circuits génétiques accélérera considérablement le rythme de la recherche dans le domaine de la biotechnologie, comme le développement de souches et d’enzymes, mais aussi dans le diagnostic en temps réel. L’émergence de méthodologies de criblage basées sur le DoE dans ce domaine est particulièrement prometteuse, facilitant l’utilisation efficace du temps et des ressources tout en explorant le maximum d’espace de conception possible, et a déjà été utilisée avec beaucoup d’efficacité dans l’optimisation des circuits génétiques pour les voies métaboliques et pour les biocapteurs 31,33,34,51. Le DoE est particulièrement bien adapté aux problèmes d’optimisation multifactorielle dans lesquels de nombreuses interactions de premier, deuxième ou même troisième ordre sont à l’œuvre, ce qui serait autrement difficile à interroger avec l’approche typique d’un facteur à la fois. De plus, les efforts visant à concevoir un aspect d’un biocapteur entraînent souvent par inadvertance le sacrifice d’un autre paramètre, comme l’amélioration de la sensibilité au détriment de la plage dynamique⁵¹. Grâce à la capacité du DoE à cartographier ces interactions cachées et à créer des modèles qui prédisent le comportement des biocapteurs, le cycle d’apprentissage des tests de construction est considérablement accéléré.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 et micro ; L CO-RE Embouts, stériles sans filtre	Hamilton  ;	235939
2,2 mL 96 Plaque Deepwell, puits carrés avec fond en V	Thermo	11594754
300 et micro ; L CO-RE Embouts, NTR empilés, stériles	Hamilton  ;	235985
96 plaques de microtitrage noires à fond transparent	Greiner  ;	655097
Agarose  ;	Invitrogen	16500100
ADN plasmidique assemblé	Fourni par l’utilisateur  ;	NA
Lecteur de microplaques ClarioStar Plus  ;	BMG	NA
Mélange de solution de dexynucloétide (dNTP)  ;	ONÉ	N0447L
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)  ;	Fisher BioReaggents  ;	Réf. BP231-100
Échelle d’ADN 100bp	ONÉ	N3231L
Échelle d’ADN 1KB	ONÉ	N° N3232L
Séquençage de l’ADN  ;	Source : Biosciences	NA
Synthèse de l’ADN  ;	IDT	NA
Escherichia coli DH5&alpha ; Cellules compotentes	ONÉ	C2987H
Colorant de chargement de gel, violet x6 sans FDS	ONÉ	B7025S
Cuvettes d’électroporation à impulsion génétique/micropulseur, espace de 0,2 cm	Biorad  ;	1652082
Bloc-notes graphique Prism 10  ;	Pavé graphique	NA
Hamilton Star Liquid Handler	Hamilton  ;	NA
HT multitron Incubateur à agitateur de plaques  ;	Infors HT	NA
Suite d’analyse statistique JMP  ;	JMP	NA
Bouillon LB (Miller)	Miller  ;	N° L3522
LB Bouillon (Miller) à l’agar  ;	Sigma	N° L3147
Électroporateur à micro-pulseurs  ;	Biorad  ;	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	ONÉ	E2621S
Q5 ADN polymérase haute fidélité	ONÉ	M0491S
QIAprep Spin Midiprep Kit	QIAGEN	; 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
Kit d’extraction de gel QIAquick	QIAGEN	Référence 28706X4
Kit de purification QIAquick PCR  ;	QIAGEN	28104
Qpix 420 Cueilleur de colonies	Dispositifs moléculaires Royaume-Uni	NA
Milieu d’excroissance SOC  ;	ONÉ	B9020S
SYBR Teinture de gel d’ADN sans danger	Invitrogen	Réf. S33102
Tampon TAE (Tris-acétate-EDTA, 50X)  ;	Thermo Fisher  ;	B49
Eau distillée sans Dnase/Rnase <TM/sup>	Invitrogen	10977015