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Article de méthode

Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes

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DOI :

10.3791/68463

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7 novembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1CNRS, Bordeaux INP, CBMN, UMR 5248, University of Bordeaux, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg

Dans cet article

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Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de biocapteurs basés sur BRET pour la mesure en temps réel de l’activation de la protéine G dans les cellules vivantes HEK293 lors de la stimulation du ligand du récepteur couplé à la protéine G. Ici, le récepteur β2-adrénergique et le récepteur cannabinoïde de type 1 servent d’exemples pour démontrer l’efficacité des capteurs pour plusieurs sous-types de protéines G et pour divers RCPG.

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires, jouant un rôle crucial dans la signalisation cellulaire en transduisant les stimuli extracellulaires en réponses intracellulaires. L’activation des RCPG conduit à des changements conformationnels qui permettent des interactions avec les protéines G hétérotrimériques. Lors de l’activation, la sous-unité Gα subit un échange GDP-GTP, se dissociant du dimère Gβγ et déclenchant des cascades de signalisation en aval. Pour étudier l’activation de la protéine G médiée par les RCPG, les biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) sont une approche très sensible et non invasive. Les capteurs d’activité tricistronique basés sur la protéine G (biocapteurs G-CASE), développés par Schihada et al., détectent la dissociation hétérotrimère comme proxy de l’activation et permettent la surveillance en temps réel de l’activité des RCPG à l’aide d’une transfection plasmidique unique, surmontant ainsi les limites des approches de co-transfection. Les tests BRET offrent plusieurs avantages par rapport aux techniques basées sur la fluorescence, tels qu’un bruit de fond plus faible, un photoblanchiment réduit et une sensibilité améliorée. Dans ce protocole, les biocapteurs G-CASE basés sur BRET ont été utilisés dans des cellules vivantes et des plaques à 96 puits. Plus précisément, nous évaluons l’activité du récepteur β2-adrénergique (β2-AR) et du récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1R) en termes d’activation de la protéine G. En utilisant des cellules de type sauvage HEK 293T transfectées transitoirement avec des cellules β2-AR et des cellules HEK293T exprimant de manière stable CB1R, la robustesse des biocapteurs Gs et Gi3 G-CASE est confirmée. Ce protocole soutient l’utilité de cette approche pour les études pharmacologiques et le criblage des RCPG à haut débit afin de mieux comprendre la capacité des ligands à activer des voies spécifiques, par exemple, via une signalisation biaisée et ainsi, facilitant la découverte de nouveaux composés thérapeutiques.

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande superfamille de récepteurs transmembranaires, responsables de la transduction des stimuli extracellulaires en cascades de signalisation intracellulaires entraînant des réponses biologiques spécifiques. Il s’agit de cibles pharmacologiques pivots, avec environ 30 % des médicaments commercialisés agissant sur les RCPG1. La liaison du ligand GPCR induit des changements conformationnels dans le récepteur, facilitant les interactions avec les protéines G hétérotrimériques et/ou les kinases GPCR (GRK) et les β-arrestines, initiant ainsi la signalisation en aval ou l’internalisation du récepteur2.

Les protéines G hétérotrimériques servent de transducteurs intracellulaires primaires de la signalisation GPCR et se composent de trois sous-unités : Gα, Gβ et Gγ. Ces hétérotrimères sont classés en quatre familles - Gi/o, Gs, Gq et G12/13 - en fonction du sous-type Gα , chacun activant des voies de signalisation distinctes : le sous-type Gi/o inhibe l’adénylate cyclase tandis que Gs la stimule, Gq active la phospholipase C-β et G12/13 régule les GTPases de la famille Rho.

L’activation des RCPG conduit à leurs réarrangements conformationnels, permettant un engagement rapide de la protéine G dans une cinétique inférieure à la seconde. Ce processus induit des changements conformationnels de la protéine G, favorisant l’échange GDP-GTP dans la sous-unité Gα. La liaison GTP modifie davantage la conformation de la sous-unité Gα, entraînant sa dissociation du dimère Gβγ, permettant la propagation du signal. Les protéines G sont donc cruciales dans la modulation de la spécificité et de la dynamique temporelle des réponses cellulaires en régulant diverses protéines effectrices telles que l’adénylate cyclase ou les canaux ioniques 3,4,5.

Ce protocole décrit la mesure de l’activation ou de l’inactivation de la protéine G à l’aide de biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) lors de la stimulation de ligands GPCR dans des cellules vivantes. Inspiré par des travaux pionniers sur les biocapteurs de protéines G 6,7,8,9, le système G-CASE (G protein tri-cistronic activity sensors), introduit par Schihada et al.10, est basé sur BRET entre les sous-unités Gα et Gβγ marquées et offre une approche rationalisée ne nécessitant qu’une seule transfection plasmidique. Cette caractéristique améliore la sensibilité et atténue les défis associés à la co-transfection de plusieurs plasmides codant pour les trois sous-unités (Gα, Gβ et Gγ) de la protéine G hétérotrimérique. Ces capteurs ont été mis à la disposition de groupes de recherche académiques à des fins commerciales (voir Table des matériaux).

BRET offre des avantages significatifs par rapport au transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET). Dans BRET, le transfert d’énergie se produit entre un donneur bioluminescent et un accepteur fluorescent sans avoir besoin de sources lumineuses externes. Cette bioluminescence intrinsèque réduit les problèmes associés à la FRET, tels que l’autofluorescence et la diffusion de la lumière, ce qui se traduit par un signal de fond plus faible et une sensibilité de test améliorée 6,7,11.

Cette absence d’excitation externe dans BRET minimise le photoblanchiment et les effets phototoxiques, ce qui entraîne des signaux de fond plus faibles par rapport au FRET. Par conséquent, les tests BRET présentent le plus souvent une sensibilité accrue, permettant de mesurer l’activation de la protéine G des RCPG constitutivement actifs. La sensibilité accrue des tests BRET facilite la détection d’interactions biologiques subtiles, ce qui est particulièrement précieux dans les études pharmacologiques où une mesure précise de l’activité du récepteur est cruciale.

Ces biocapteurs peuvent être traduits en criblage à haut débit dans des plaques de 96 puits ou de 384 puits, comme l’ont récemment démontré Scott-Dennis et al., où une méthode utilisant ces biocapteurs a été développée dans un test membranaire à 384 puits pour analyser l’activité des récepteurs cannabinoïdes CB1R et CB2R12. Cet article décrit l’utilisation de ces biocapteurs dans des plaques à 96 puits dans des cellules vivantes en mesurant l’activité du β2-AR en tant que RCPG prototypique de classe A, qui se lie à la protéine Gs et le CB1R qui appartient aux RCPG de classe A et active la protéine de la famille Gi/o . L’utilisation de deux biocapteurs G-CASE est validée : Gs et Gi3 dans les cellules HEK 293T avec le RCPG soit de manière transitoire (avec le β2-AR), soit exprimée de manière stable (avec le CB1R).

Il est important de noter que cette expérience peut être réalisée dans différentes lignées cellulaires, démontrant la polyvalence et la robustesse de cette technique dans divers contextes cellulaires. Cela garantit que la méthode peut être appliquée à divers modèles expérimentaux, ce qui en fait un outil précieux pour étudier la signalisation des RCPG dans différents contextes physiologiques et pharmacologiques. La figure 1 illustre le principe des capteurs d’activité de la protéine G basés sur BRET.

figure-introduction-1
Figure 1 : Principe des capteurs d’activité de la protéine G basés sur BRET. Les capteurs de protéines G sont constitués de trois sous-unités : Gα, Gβ natif et Gγ. La sous-unité Gα est fusionnée à la petite et brillante NanoLuciférase (Nluc), tandis que la sous-unité Gγ est marquée N-terminalement avec Vénus permutée circulairement (cpVenus173). Les gènes codant pour ces sous-unités de la protéine G modifiées sont combinés en un seul plasmide. La liaison des ligands aux RCPG induit des changements conformationnels des RCPG, favorisant le recrutement de la protéine G et la dissociation ultérieure suivie d’une hydrolyse des RCP. Cette dissociation perturbe le transfert d’énergie entre les partenaires, ce qui entraîne une diminution du signal BRET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Ensemencement en bonne couche (Jour 1)

REMARQUE : Suivez tous les protocoles de culture cellulaire dans une hotte à flux laminaire stérile pour maintenir des conditions stériles. Des plaques à puits blancs à fond plat transparent sont utilisées pour suivre la croissance et la viabilité des cellules. Utilisez la plaque de puits entièrement blanche pour éviter d’utiliser un autocollant à l’étape 3.2.1.

  1. Revêtement de plaque de puits
    REMARQUE : Des plaques pré-revêtues peuvent être utilisées pour contourner cette étape.
    1. Verser dans un réservoir multicanaux environ 6 mL de solution de poly-L-lysine (PLL) filtrée stérile (0,01 %). À l’aide d’une pipette multicanaux, remplissez chaque puits d’une microplaque à 96 puits blancs avec 60 μL de PLL.
    2. Placez la microplaque dans un endroit sombre et incubez pendant 20 min.
    3. Pendant l’incubation, procédez à la préparation des cellules comme décrit aux étapes 1.2.1 à 1.2.3.
    4. Aspirez la solution PLL à l’aide de la pipette multicanaux et conservez-la à 4 °C dans un tube de 15 ml.
    5. Lavez la plaque trois fois avec du DPBS afin d’éliminer les cellules libres qui pourraient provoquer la dégradation des cellules.
  2. Préparation et placage des cellules
    1. Cultivez des cellules HEK293 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C dans 5 % de CO2.
      REMARQUE : Le FBS est ajouté au milieu de culture pour fournir les nutriments et les facteurs de croissance nécessaires à la bonne viabilité cellulaire.
    2. Retirez le milieu et rincez les cellules avec 2 ml de DPBS.
    3. Ajouter 0,5 mL de trypsine et incuber pendant 3 à 5 min à 37 °C afin de détacher les cellules.
    4. Ajoutez 4,5 ml de DMEM dans le ballon pour neutraliser la trypsine, puis pipetez de haut en bas à plusieurs reprises pour détacher les cellules et les remettre en suspension.
    5. Transférez les cellules détachées dans un tube de 15 mL et centrifugez pendant 5 min à 1000 x g (à température ambiante, RT).
    6. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 2 mL de DMEM.
    7. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez et préparez 9 mL à 300 000 cellules/mL. Placez-les dans un réservoir multicanaux et ensemencez la microplaque de 96 puits en versant 100 μL par puits avec la pipette multicanaux (densité finale de 30 000 cellules/puits).
    8. Incuber la microplaque à 37 °C, 5 % CO2 pendant environ 24 h.
      REMARQUE : Les cellules doivent atteindre une confluence d’environ 70 % à 80 % pour une transfection efficace.

2. Transfection plasmidique (jour 2)

REMARQUE : La transfection des cellules peut être effectuée le premier jour sur les cellules suspendues avant le placage, lors de l’étape 1.2.7 et l’acquisition des données le 3e jour.

  1. Diluez 10 μg de l’ADN plasmidique souhaité (par exemple, 5 μg de récepteur β2-adrénergique et 5 μg de Gs(court)-CASE dans les cellules HEK wt ou seulement 10 μg de Gi3-CASE dans les cellules HEK CB1) et 20 μL de lipofectamine dans les tubes contenant 500 μL de milieu Opti-MEM. Incuber à RT pendant 5 min.
    1. Pour un contrôle négatif, remplacez le récepteur β2-adrénergique par un plasmide vide pcDNA 3.1 à la même concentration. Combiner les solutions dans un seul tube et mélanger pour obtenir un mélange de transfection (1 mL).
  2. Incuber le mélange de transfection à RT pendant 20 min.
  3. Ajoutez 10 μL de mélange de transfection de l’étape 2.2 goutte à goutte dans chaque puits et balancez doucement la plaque d’avant en arrière pour assurer un mélange complet.
    REMARQUE : Une concentration finale de 100 ng d’ADN par puits est obtenue.
  4. Incuber la microplaque dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % CO2 pendant 24 h.

3. Acquisition des données (Jour 3)

  1. Préparation du ligand
    REMARQUE : Tampon de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) : NaCl 140 mM, chlorure de potassium 5 mM, chlorure de calcium 1 mM, sulfate de magnésium heptahydraté 0,4 mM, chlorure de magnésium hexahydraté 0,5 mM, phosphate de sodium dibasique dihydraté 0,3 mM, phosphate de potassium monobasique 0,4 mM, D-glucose (dextrose) 6 mM, bicarbonate de sodium 4 mM, pH 7,4, filtré 0,22 μm.
    1. Préparer une solution mère à la concentration la plus élevée possible dans le solvant de solubilisation approprié pour les différents ligands (dans ce protocole, l’isoprotérénol est préparé dans H20 mQ et WIN-55.212-2 dans le DMSO).
      REMARQUE : La concentration de la solution mère de ligand doit être ajustée en fonction de la solubilité et de la constante de dissociation connue (Kd) du ligand.
    2. À partir de ce stock, préparer une dilution en série du ligand allant autour du Kd du ligand, de 10 μL dans le solvant de solubilisation approprié. Stockez cette dilution en série à -20 °C.
      REMARQUE : Selon le ligand, la plage de dilution en série peut être congelée et décongelée jusqu’à dix fois avant que la dégradation ne se produise. Préparer une solution contenant uniquement le solvant utilisé pour la dissolution du ligand afin d’inclure une condition de véhicule (dans ce protocole, H20 ou DMSO).
    3. Pour chaque concentration de ligand et véhicule, effectuer une dilution de 1/100 dans HBSS en ajoutant 1,3 μL de chaque concentration à un volume total de 130 μL. Il en résulte une concentration finale de 1 % du véhicule dans HBSS.
      REMARQUE : Cette dernière plage de dilution est celle utilisée pour les expériences en ajoutant 10 μL pour obtenir un volume total de 100 μL par puits. Il en résulte une concentration finale de 0,1 % de véhicule dans tous les puits. Le volume de 130 μL correspond à la quantité nécessaire pour remplir une rangée d’une plaque de 96 puits : (10 x 12) ± 10 %. Chaque rangée correspond à une concentration de ligand différente, la dernière rangée servant de commande du véhicule.
    4. Préparez 980 μL de furimazine 1/100 dilution à partir d’une solution mère (9,8 μL dans 970,2 μL de HBSS pour obtenir un volume total de 980 μL).
      REMARQUE : Préparez une solution fraîche de furimazine et laissez-la incuber pendant au moins 3 min. Ensuite, ajoutez-le immédiatement avant l’acquisition. Il ne doit pas être préparé trop tôt, car le signal a une demi-vie d’environ 120 min à température ambiante. Pour surmonter cette limitation, des dérivés de la furimazine à action prolongée, tels que la vivazine et l’endurazine, peuvent être utilisés. Ces substrats maintiennent un signal BRET stable jusqu’à 48 h.
  2. Relevés de plaques
    REMARQUE : Utilisez un lecteur de plaques multimode. Ajustez la mesure aux conditions étudiées et au nombre de répétitions. Ici, l’acquisition des données est divisée en trois lectures de 4 colonnes, ce qui correspond à 32 puits. Toutes les lectures sont effectuées avec une optique supérieure avec un couvercle transparent pour éviter l’évaporation du tampon. Avant toutes les lectures, ajustez le gain de mesure. Dans cette étude, le gain a été fixé à 3600. Il est possible d’éviter l’ajout manuel de ligands en utilisant un système automatisé d’injecteur ou de seringue, qui est disponible dans de nombreux lecteurs de plaques.
    1. Retirez le fluide des 4 premières colonnes de la plaque à 96 puits. Rincez bien chaque avec 100 μL de HBSS et ajoutez 80 μL de HBSS. Collez un autocollant blanc sur le dessous de l’assiette. Cela améliore les mesures de fluorescence et/ou de bioluminescence.
    2. Enregistrement des spectres de luminescence de la protéine G : Insérez la plaque à 96 puits dans le lecteur de plaques. Enregistrez l’émission du cpVenus173 à l’aide d’un monochromateur 535/30 nm et mesurez l’émission de luminescence entre 500 et 600 nm avec une résolution de 2 nm.
      REMARQUE : Cet enregistrement est une commande pour s’assurer que la fluorescence est émise lors de l’excitation de cpVenus173 .
    3. Enregistrement des spectres de luminescence de la protéine G : Enregistrez l’intensité d’émission de Nluc à l’aide d’un monochromateur de 450/40 nm et mesurez l’émission de luminescence entre 400 nm et 600 nm avec une résolution de 5 nm.
      REMARQUE : Cet enregistrement est un contrôle pour s’assurer qu’aucune bioluminescence n’est émise avant l’ajout du substrat Nluc, la furimazine.
    4. Retirer la plaque du lecteur de plaques et ajouter 10 μL de la solution de furimazine préalablement préparée (étape 3.1.4.) dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
    5. Répétez l’étape 3.2.3.
      REMARQUE : Cet enregistrement est un contrôle pour s’assurer que la bioluminescence est émise lors de l’ajout de furimazine. Passer directement à l’étape 3.2.6 après cette mesure pour éviter les variations du signal dues à la consommation et/ou à la dégradation de la furimazine. Une variation du signal BRET peut se produire en raison de la consommation et/ou de la dégradation de la furimazine et des processus de régulation qui se produisent pour mettre fin à la réponse induite par la stimulation agoniste. Pour surmonter cette limitation, des inhibiteurs de GRK (CMPD101) et des inhibiteurs d’internalisation (dynasore) ou des cellules génétiquement modifiées dépourvues de GRK ou d’arrestines pourraient être utilisés.
    6. Enregistrement de la protéine G basale BRET : Avant d’ajouter le ligand des RCPG, enregistrez l’intensité d’émission de Nluc et de cpVenus173 à l’aide d’un monochromateur de 450/40 nm et d’un monochromateur de 535/30 nm, respectivement. Mesure 3 cycles de 60 s avec un intervalle de mesure de 0,30 s (temps de lecture total de 3 min).
      REMARQUE : L’augmentation du temps d’intervalle de mesure à 0,90 s améliore généralement considérablement le rapport signal/bruit, mais entraîne un temps de lecture beaucoup plus long. L’expérimentateur doit décider si la résolution temporelle plus élevée ou l’amélioration du rapport signal/bruit est plus importante pour leur application.
    7. Retirez la plaque du lecteur de plaques et ajoutez 10 μL de la plage de dilution précédemment préparée du ligand GPCR (étape 3.1) respectivement dans chaque puits d’une colonne à l’aide d’une pipette multicanaux. Suivez la même procédure pour les 3 autres colonnes.
    8. Enregistrement du BRET induit par le ligand de la protéine G : Enregistrez l’intensité d’émission de Nluc et de cpVenus173 à l’aide d’un monochromateur de 450/40 nm et d’un monochromateur de 535/30 nm, respectivement. Mesure 16 cycles de 60 s avec un intervalle de mesure de 0,30 s (temps de lecture total de 16 min).
      REMARQUE : Configurez les paramètres de mesure pour mesurer les puits en colonnes. Les doublons sont lus avec une différence de temps de 2,4 s.
    9. Répétez l’étape 3.2. pour les quatre colonnes suivantes 2 fois.

4. Analyse des données

REMARQUE : Collectez les données de chaque lecture dans des fichiers de tableur de données distincts.

  1. Valeurs de contrôle
    1. Tracez l’intensité de l’émission en fonction de la longueur d’onde.
  2. Relevés basaux de BRET
    1. Pour chaque puits, calculez le rapport BRET des trois lectures. Le rapport BRET est défini comme l’émission de l’accepteur par rapport à l’émission du donneur.
      figure-protocol-1
    2. Pour chaque puits, calculez la moyenne des trois rapports BRET avant l’ajout de ligand. Cette valeur est appelée rapport BRET basal avant stimulation par ligand : Ratiobasal.
    3. Pour normaliser les rapports BRET précédents de tous les puits, pour chacune des trois mesures, soustrayez respectivement la valeur du rapport BRET calculée des puits de contrôle du véhicule du rapport BRET au moment de mesure correspondant.
      REMARQUE : Les données analysées correspondent aux points temporels avant l’ajout du ligand. Étant donné que les puits dans lesquels le ligand est ajouté sont connus, les puits de contrôle du véhicule peuvent être identifiés en conséquence.
  3. Lectures BRET induites par le ligand de la protéine G
    1. Pour chaque puits, calculer le rapport BRET de chaque lecture, comme décrit à la section 4.2.1. Ces valeurs sont appelées Ratiostim.
    2. Pour quantifier les changements induits par le ligand, calculez le ΔBRET pour chaquestim de rapport de chaque puits en pourcentage sur le basal. Pour cela, utilisez le Ratiobasal correspondant précédemment calculé à la section 4.2.2.
      figure-protocol-2
    3. Calculez le ΔBRET( %) pour normaliser les valeurs ΔBRET de chaque puits. Pour cela, soustrayez les valeurs ΔBRET respectives du véhicule.
    4. Pour visualiser la cinétique ΔBRET dans une feuille de calcul de données, ajoutez les trois lectures basales de BRET normalisées à l’étape 4.2.3. devant les valeurs ΔBRET( %) correspondantes calculées pour chaque puits à la section 4.3.3.
    5. Tracez les données précédentes en fonction de l’heure de la lecture pour obtenir un graphique cinétique.
    6. Lorsqu’un plateau est atteint, prenez les valeurs ΔBRET( %) à un moment choisi et comparez-les à la concentration du ligand utilisé, car chaque puits correspond à une concentration de ligand différente. Une courbe dose-réponse est obtenue.
      REMARQUE : Le plateau est généralement atteint environ 5 minutes après la stimulation par ligand. Dans ce protocole, les valeurs obtenues après 15 min de stimulation de ligand sont tracées. Pour comparer les données de différentes expériences, ajustez le temps en fonction de la cinétique d’activation.
    7. Tracez les données précédentes dans un logiciel d’analyse et ajustez-les à l’aide d’un ajustement sigmoïdal dose-réponse à trois paramètres basé sur l’équation suivante :
      figure-protocol-3
      où, X est la concentration du ligand utilisé, Y est les valeurs ΔBRET( %), Haut et Bas représentent les plateaux, et EC50 est la concentration du ligand nécessaire pour atteindre 50 % de l’effet maximal. Cela permet d’obtenir le Emax et l’EC50.
    8. Comparez les données de la condition de contrôle à l’aide d’un test de Mann-Whitney non paramétrique. Les résultats sont considérés comme significatifs à p < 0,05.

figure-protocol-4
Figure 2 : Étapes clés de la réalisation du test BRET. Vue d’ensemble des trois principales étapes expérimentales décrites dans ce protocole (ensemencement cellulaire, transfection cellulaire et acquisition du signal BRET) et guide détaillé par étape pour l’acquisition des données. Dispositif expérimental : Le jour 1, les cellules sont ensemencées dans une plaque blanche de 96 puits pré-enduite de PLL avec un fond plat et transparent à une densité de 30 000 cellules/puits. Le jour 2, les cellules sont transfectées avec le capteur de protéine G sélectionné avec les plasmides GPCR ou pcDNA3.1 étudiés. Après 24 h d’incubation, l’activité du capteur de protéine G est mesurée par des lectures de bioluminescence et de fluorescence lors de l’ajout de ligand. Acquisition des données : Après le lavage HBSS des cellules, 80 μL de HBSS sont ajoutés dans les puits, et l’émission de fluorescence de cpVenus173 est mesurée entre 500 nm et 600 nm à l’aide d’un monochromateur 535/30 nm (1). Ensuite, la bioluminescence de Nluc est mesurée entre 400 nm et 600 nm à l’aide d’un monochromateur 450/40 nm, avant (2) et après (3) l’ajout de furimazine. Enfin, le signal BRET pour l’activité des protéines G induites par le basus et le ligand est mesuré à l’aide de monochromateurs 450/40 nm et 535/30 nm, respectivement, sur 3 min (3 cycles de 60 s avec un intervalle de mesure de 0,30 s) (4) et 16 min (16 cycles de 60 s avec un intervalle de mesure de 0,30 s) (5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Un schéma généralisé de la configuration et de l’exécution de l’expérience est détaillé à la figure 2. L’activation des protéines de la famille Gs ou Gi/o suite à l’activation ligand de deux RCPG a été évaluée à l’aide des biocapteurs G-CASE. Tout d’abord, une famille prototypique de RCPG A a été étudiée, le β2-AR transfecté transitoirement dans les cellules HEK 293T. Lorsqu’un agoniste (c’est-à-dire l’isoprotérénol) a été appliqué à de...

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Discussion

Le présent protocole décrit l’utilisation de biocapteurs BRET pour la mesure en temps réel de l’activation de la protéine G dans les cellules vivantes en réponse à la stimulation des RCPG avec des ligands spécifiques. En utilisant le principe de transfert d’énergie donneur-accepteur bioluminescent, cette approche permet de détecter les changements de conformation et la dissociation des protéines G hétérotrimériques lors de l’activation du récepteur, fournissant une plate-forme robuste et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les cellules HEK-CB1 ont été un cadeau de M. Guzman (Université Complutense, Madrid, Espagne), et le plasmide du récepteur β2-adrénergique a été un cadeau de D. Perrais (IINS, Institut interdisciplinaire de neurosciences, Bordeaux, France). Gi3-CASE et Gs(court)-CASE étaient un cadeau de Gunnar Schulte (plasmide Addgene # 168122 ; Addgene plasmide # 168124). Certaines des illustrations ont été créées à l’aide de BioRender.com. Ces travaux sont soutenus par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche et financés par l’Agence nationale de la recherche (ANR) PolyFADO (ANR-21-CE44-0019), AlzCaBan (ANR-24-CE44-4647) et SCHIZOLIP (ANR-22-CE44-0034).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de culture avancée à 96 puits, blanche avec fond plat transparent, avec couvercle, Greiner bio-oneDutscher655983
Film blanc BrightMax ClearLineDutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD4540
DPBS modifié, sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium, liquide, filtré stérile, adapté à la celluleSigma  ;D8537
Dulbecco » s modifié Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAXSigmaD0822Il fait chaud à 37 °C Bain marie en C avant utilisation
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma  ;F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-VénusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Don de Gunnar Schulte
Galphas (isoforme courte)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-VénusAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
Don de Gunnar Schulte
HEK-293T exprimant de manière stable CB1R (HEK CB1)Cadeau généreux de M. Guzman (Université Complutense, Madrid, Espagne)
HEK-293T de type sauvage (HEK wt)
IsoprotérénolSigmaI6504Solubilisé dans H20 et stocké à &ndash ; 20 & degrés C
Lipofectamine 2000Invitrogen  ;11668019
Opti-MEM I complément sérique réduit medium GlutaMAXFischer11564506
pcDNA3 Flag tag bêta-2-récepteur adrénergique FLAG C-terGénéreux don de D. Perrais (IINS, Bordeaux)
pcDNA3.1-(vide)-TAGAddgene138209
Pénicilline/streptomycineSigma  ;P4333
Solution de poly-L-lysine (PLL)SigmaRNBL7086
Trypsine-EDTA & nbsp ;Sigma  ;T3924
VICTOIRE : 55 212-2Cayman Chemicals10009023Solubilisé dans le DMSO et stocké à &ndash ; 20 & degrés C

Références

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
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Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

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Activit des GPCRessai BRETimagerie sur cellules vivantesactivation des prot ines Gsignalisation biais e des ligandsplaque 96 puitscellules HEK293Tr cepteur b ta 2 adr nergiquer cepteur cannabino de CB1
Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes
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