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Article de méthode

Test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN dans les cellules 32D exprimant le mutant FLT3 après une exposition à des inhibiteurs de FLT3 de type I et de type II

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DOI :

10.3791/68469

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17 octobre 2025

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1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace pour quantifier la différence dans les dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de type I et de type II dans les cellules mutantes FLT3 grâce à l’application du test de comète.

Résumé

La tyrosine kinase 3 de type FMS (FLT3), un récepteur tyrosine kinase de classe III, présente une fréquence de mutation d’environ 30 % chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LMA) et constitue une cible thérapeutique critique. En tant qu’inhibiteurs représentatifs de FLT3 de type I et de type II, respectivement, le giltéritinib et le quizartinib (AC220) sont utilisés cliniquement dans la prise en charge de la LAM avec mutation FLT3.

Le giltéritinib inhibe les protéines FLT3 activées et inactivées, avec une inhibition supplémentaire des cibles AXL pour aider à surmonter la résistance. L’AC220 inhibe FLT3 activé. Le test des comètes a été systématiquement utilisé pour quantifier et comparer les modèles de dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de FLT3 de type I par rapport aux inhibiteurs de type II dans les cellules mutantes. Les résultats expérimentaux ont révélé que les dommages à l’ADN causés par l’AC220 étaient significativement plus élevés que ceux causés par le gilteritinib. Pour les dommages importants à l’ADN, les inhibiteurs de FLT3 peuvent être combinés avec des inhibiteurs de réparation des dommages à l’ADN pour cibler les défauts de réparation de l’ADN. Les résultats fournissent un soutien expérimental à la stratégie de combinaison rationnelle de médicaments ciblant les dommages à l’ADN.

Introduction

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une maladie clonale des cellules souches hématopoïétiques définie par une expansion pathologique de progéniteurs myéloïdes indifférenciés, entraînant une suppression hématopoïétique et une insuffisance médullaire. L’hétérogénéité moléculaire inhérente à la LAM pose d’importants défis thérapeutiques1. D’une importance clinique particulière, les mutations de la tyrosine kinase 3 de type FMS (FLT3) constituent l’une des altérations génétiques les plus répandues dans la LAM, survenant dans environ 30 % des cas, et démontrent une forte corrélation avec des résultats cliniques défavorables2. La tyrosine kinase du récepteur FLT3 subit une activation au niveau de la membrane plasmique pour médier les cascades de signalisation PI3K/AKT et RAS/MAPK, tandis que la variante mutante FLT3-ITD est conservée dans le réticulum endoplasmique, induisant la phosphorylation persistante du transducteur de signal et de l’activateur de la transcription 5 (STAT5). Ces altérations génétiques entraînent la leucémogenèse par de multiples mécanismes oncogéniques, principalement par la dérégulation de la transduction du signal, la signalisation proliférative incontrôlée et la résistance apoptotique3.

L’AC220 et le gilteritinib, en tant qu’inhibiteurs typiques de FLT3, inhibent la prolifération cellulaire et induisent l’apoptose en supprimant l’expression de FLT3, mais avec des mécanismes d’action différents. Le giltéritinib (un inhibiteur de type I) couvre non seulement un spectre plus large de mutations activatrices de FLT3, mais inhibe également la tyrosine kinase AXL, qui est étroitement apparentée à FLT3. Grâce à la double inhibition, le giltéritinib peut bloquer la croissance des cellules cancéreuses de manière plus complète4. L’AC220 (un inhibiteur de type II) exerce son effet inhibiteur par une liaison compétitive à la conformation de la kinase activée, ciblant spécifiquement la poche de liaison à l’ATP avec une spécificité élevée5. Cette inhibition peut entraîner l’arrêt du cycle cellulaire et une augmentation du stress de réplication de l’ADN.

Le giltéritinib est associé à un faible risque de résistance et est indiqué en monothérapie dans le traitement de la LAM avec mutation FLT3 récidivante ou réfractaire. L’AC220 est efficace et sélectif pour les mutations FLT3-ITD, avec de bons taux de réponse clinique, mais il est inefficace pour les mutations FLT3-TKD, et peut être résistant aux mutations FLT3-TKD en raison de mutations secondaires FLT3-TKD (par exemple, D835 ou F691L) pour développer une résistance. Ces inhibiteurs ont pris de l’importance dans les traitements de la LMA sur la base de leur efficacité clinique démontrée et de l’amélioration des indices thérapeutiques6. Cependant, l’utilisation clinique de ces médicaments est remise en question par une résistance acquise et des effets hors cible. L’utilisation à long terme de l’AC220 en clinique entraîne une résistance due aux mutations FLT3-TKD, tandis que l’utilisation à long terme du giltéritinib peut présenter des limites pour les mutations composées (p. ex., FLT3-ITD combiné à la TKD) même si elle n’entraîne pas de résistance due aux mutations FLT3-TKD 7,8.

Ces deux classes d’inhibiteurs de FLT3 exercent un double effet thérapeutique en induisant indirectement un stress réplicatif par l’inhibition de FLT3 et le blocage de la voie de signalisation proliférative - signalisation RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5. Le blocage de la prolifération cellulaire conduit généralement à l’arrêt du cycle cellulaire, à des perturbations métaboliques (dérégulation de l’homéostasie redox) et, finalement, à l’apoptose 9,10. Ce mécanisme génère finalement des lésions de l’ADN qui activent des adaptations compensatoires de réparation de l’ADN dans les populations cellulaires résistantes. Le test des comètes permet une comparaison quantitative des profils de dommages à l’ADN spécifiques aux inhibiteurs dans les cellules mutantes FLT3. Cette approche expérimentale fournit des informations essentielles pour développer des thérapies combinées rationnelles qui exploitent les vulnérabilités aux dommages à l’ADN, surmontant ainsi la résistance thérapeutique acquise.

Les méthodologies contemporaines de détection des dommages à l’ADN englobent l’analyse immunohistochimique, l’électrophorèse sur gel d’agarose de fragments d’ADN, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS), chacun démontrant une sensibilité et une spécificité analytiques élevées11. Cependant, ces approches sont limitées par des exigences financières substantielles, des durées de traitement prolongées et des conditions expérimentales strictes. Cela souligne la nécessité d’adopter des stratégies de détection qui équilibrent la précision analytique et la simplicité opérationnelle.

Le test des comètes a été largement utilisé dans l’évaluation de la toxicologie environnementale et de la génotoxicité en raison de sa sensibilité supérieure, de son accessibilité technique, de la quantification visualisée des dommages à l’ADN et de sa large applicabilité dans les systèmes biologiques12,13. Trois variantes méthodologiques principales ont été établies : le dosage des comètes alcalines pour la détection des cassures simples/doubles brins, le dosage des comètes neutres pour l’analyse des cassures double brin et le dosage des comètes modifiées par enzymes pour l’identification de lésions spécifiques de l’ADN. 14

Le principe méthodologique implique : (1) l’induction de ruptures de brins d’ADN par un traitement expérimental ; (2) Dissolution des membranes cellulaires et nucléaires par tampon de lyse, permettant la diffusion de protéines cytoplasmiques/nucléaires et d’ARN dans un tampon d’électrophorèse, tandis que l’ADN de haut poids moléculaire reste immobilisé dans la matrice d’agarose ; (3) la dénaturation alcaline (pH > 13) induisant le déroulement de l’ADN et la libération des fragments d’ADN endommagés ; (4) Migration anodique électrophorétique de l’ADN fragmenté créant une morphologie caractéristique de la comète, avec un ADN intact conservant la structure nucléoïde sphérique15,16. La quantification des dommages à l’ADN est réalisée par l’analyse informatisée du pourcentage d’ADN de la queue (TDP), fournissant une mesure précise de l’impact génotoxique à une résolution de17 sur une seule cellule.

Cette étude a utilisé un cadre expérimental systématique pour comparer les effets génotoxiques différentiels du giltéritinib et de l’AC220 dans des cellules 32D mutantes FLT3 validées. La conception expérimentale comprenait deux composantes principales : (i) l’établissement d’un modèle de dommages à l’ADN spécifique à la mutation FLT3, et (ii) l’évaluation quantitative des dommages à l’ADN induits par le médicament par une méthodologie de dosage des comètes alcalines. La lignée cellulaire 32D mutante FLT3 a été maintenue dans des conditions standard in vitro avant l’exposition à des inhibiteurs de FLT3 dilués en série. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’essais CCK-8, puis de valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) par analyse de régression non linéaire. Une valeur IC50 quintuple a été choisie comme seuil d’induction des dommages à l’ADN. Des cellules traitées par des médicaments ont été récoltées et incorporées dans de l’agarose à bas point de fusion sur des lames pour une analyse ultérieure. Une séparation électrophorétique a été effectuée à 24 V (~0,74 V/cm) et 300 mA pendant 30 min dans un tampon alcalin, au cours duquel l’ADN fragmenté a migré anodiquement pour former une morphologie caractéristique de la comète, tandis que l’ADN intact a conservé la configuration nucléoïde sphérique. La quantification des dommages à l’ADN a été réalisée grâce à l’analyse d’images informatisée, le projet de logiciel d’analyse de comète (CASP) mesurant le moment de la queue, avec des valeurs accrues du moment de la queue d’olive directement corrélées à l’étendue de la fragmentation de l’ADN.

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Protocole

1. Construction d’un modèle d’atteinte à l’ADN dans des cellules 32D présentant des mutations FLT3-ITD 18

  1. Récupération cellulaire
    1. À l’aide d’une pince, transférez rapidement des cellules 32D mutantes FLT3-ITD cryopréservées (stockées à -80 °C). Prélevez les cryoflacons à l’aide d’une pince et plongez-les immédiatement dans un bain-marie à température régulée (37 °C ± 0,5 °C) pendant précisément 60 s pour terminer la décongélation contrôlée.
      REMARQUE : Pendant la décongélation, secouez par intermittence les cryoflacons dans le bain-marie pour assurer un chauffage uniforme.
    2. Centrifuger les échantillons cryoconservés à 150 × g pendant 5 min à 25 °C ± 1 °C. Aspirer soigneusement le surnageant à l’aide de pipettes sérologiques stériles tout en conservant la pastille cellulaire.
    3. Ajouter 1 mL de milieu de croissance complet (RPMI 1640 + 10 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline/streptomycine) dans le tube de cryoconservation. Effectuez une trituration douce à travers 10 cycles de pipetage séquentiels (volume de 1 ml) pour assurer une remise en suspension complète. Transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm et ajoutez 7 ml de milieu complet pour obtenir un volume final de 8 ml.
    4. Agitez doucement le récipient de culture avec cinq mouvements horizontaux et cinq mouvements de rotation. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié à 37,0 °C ± 0,2 °C avec 5 % de CO2 et 95 % d’humidité. Incuber pendant 24 h avant le traitement expérimental.
  2. Évaluation de la viabilité cellulaire
    1. Sélectionnez des cellules 32D mutantes FLT3-ITD dans la phase de croissance logarithmique avec un bon état cellulaire pour l’expérience.
      REMARQUE : Les cellules en phase de croissance logarithmique ont généralement un cycle de division court et une fréquence élevée de division cellulaire.
      1. Observez la morphologie et l’état de croissance des cellules 32D mutées FLT3-ITD à l’aide d’un microscope électronique. Assurez-vous que les critères de seuils de prolifération cellulaire sont respectés : recherchez des cellules qui se présentent sous la forme d’un seul globule avec des bords lisses, une dispersion uniforme, peu d’agrégats, une taille cellulaire uniforme, une intégrité intacte de la membrane plasmique et des débris cellulaires < 5 %.
    2. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer la concentration de la suspension cellulaire.
      REMARQUE : Mélanger les suspensions cellulaires (10 cycles de pipetage séquentiels à l’aide d’embouts stériles de 1 mL à une vitesse maximale de 50 %).
    3. Standardiser la suspension cellulaire à 2,0 × 105 cellules/mL dans un milieu de croissance complet en utilisant une dilution itérative. À l’aide d’une pipette, verser des aliquotes de 50 μL dans les puits centraux (B2-G7) d’une plaque à fond plat de 96 puits. Remplissez les puits périphériques (A1-H12) avec 100 μL de PBS stérile pour maintenir l’humidité et minimiser les effets d’évaporation des bords.
    4. Préparation d’un milieu contenant un inhibiteur de FLT3 : Sélectionnez neuf puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits et étiquetez-les selon l’échelle de concentration de l’inhibiteur de FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 et 1000 nM). Ajouter 400 μL de milieu complet dans les puits étiquetés 10,0 μM et 200 μL de milieu complet dans les puits restants.
      1. Dilution du giltéritinib : Ajouter 4 μL de réactif de giltéritinib à 100 μM (giltéritinib dans le sulfoxyde de diméthyle) dans chacun des puits marqués à 1000 nM à l’aide d’un pistolet à pipette et bien mélanger la solution. Pipeter 200 μL de giltéritinib 1000 nM dans les puits étiquetés 500 nM et mélanger ; puis pipeter 200 μL de giltéritinib 500 nM dans les puits étiquetés 250 nM et mélanger. À chaque fois, prélever 200 μL de la dilution précédente dans le puits suivant et mélanger pour obtenir la concentration désirée.
      2. Dilution de l’AC220 : Ajouter 4 μL de réactif AC220 100 μM (AC220 dans le sulfoxyde de diméthyle) dans chacun des puits marqués 1000 nM à l’aide d’un pistolet à pipette. Suivez l’étape 1.2.4.1 pour les autres puits.
        REMARQUE : Assurez-vous que la solution mère de l’inhibiteur de FLT3 dans la pipette est complètement transférée dans les puits pour éviter la solution résiduelle. Assurez-vous que la solution est bien mélangée avant de procéder à la dilution.
    5. Incubation : Distribuer un milieu contenant un inhibiteur de FLT3 dans des puits désignés (50 μL/puits) à l’aide d’une pipette. Maintenir la plaque à 96 puits dans des conditions de culture physiologiques (37,0 °C ± 0,2 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité) pendant précisément 72 h ± 15 min.
    6. Aliquote 10 μL de réactif CCK-8 dans tous les puits expérimentaux et de contrôle à blanc à l’aide d’une pipette. Protégez la plaque de la lumière et incuberez-la dans des conditions normoxiques (37 °C, 5 % CO2) pendant 2,0 H ± 10 min.
      REMARQUE : Distribuez le réactif à faible vitesse de pipette avec une profondeur d’immersion de la pointe de 2 mm pour minimiser la formation de bulles. Évitez les bulles d’air lors de l’ajout d’échantillons pour éviter d’interférer avec les lectures de diamètre extérieur.
    7. Retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur et mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Enregistrez les résultats.
    8. Calculez le % d’inhibition selon la formule de calcul IC50 :
      Inhibition ( %) = figure-protocol-1 × 100 %
      Le puits expérimental du médicament désigne les puits cellulaires traités avec le médicament. Le puits de contrôle cellulaire désigne les puits cellulaires qui n’ont pas été traités avec le médicament. Les puits de contrôle vides indiquent uniquement le milieu sans cellules.
    9. Analysez les données dose-réponse normalisées par régression non linéaire, à l’aide d’un modèle logistique à quatre paramètres. Cliquez sur le bouton Ajuster la courbe pour l’ajustement de la courbe. Dérivez la concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) à partir de la convergence du modèle (R2 > 0,98, somme résiduelle des carrés < 0,15) et calculez les intervalles de confiance à 95 % par rééchantillonnage bootstrap de 1000 itérations.
  3. Expérience d’endommagement de l’ADN de cellules 32D avec mutation FLT3-ITD induite par un inhibiteur de FLT3
    1. Sélectionnez des cellules 32D mutantes FLT3-ITD présentant une poussée de croissance (temps de doublement de la population < 24 h) pour l’évaluation des dommages à l’ADN.
    2. Comptez les cellules (voir l’étape 1.2.2 pour plus de détails).
    3. Ensemencement cellulaire : Ajuster la densité de la suspension cellulaire à 1 × 106 cellules par boîte, à l’aide d’une boîte de 6 cm de diamètre et de 4 mL de suspension cellulaire par boîte.
    4. Préparez trois répétitions pour chaque concentration d’inhibiteur : 55 nM giltéritinib : 4 ml de milieu + 2,2 μL de 100 μM de stock, 0,15 nM AC220 : 4 mL de milieu + 6 μL de 100 nM de stock. Mélangez les solutions au vortex et équilibrez-les à 37 °C pendant 15 min ; Secouez doucement les tubes pour assurer un mélange adéquat. Aspirer le milieu d’origine et le remplacer par 4 mL/boîte de milieu contenant un inhibiteur fraîchement préparé à l’aide de pipettes sérologiques stériles.
    5. Incuber les cellules traitées dans des conditions physiologiques (37 °C, 5 % CO2, 95 % d’humidité) pendant des intervalles définis (0, 2, 4, 6 H). Traitez immédiatement les contrôles à temps zéro pour l’évaluation de base des dommages à l’ADN.
    6. Essai d’exclusion au bleu de trypan
      1. Centrifuger les cellules collectées à 150 × g pendant 1 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 1 mL de milieu de culture.
      2. Pipeter 100 μL de cellules remises en suspension dans un tube à centrifuger en plastique, ajouter 100 μL de colorant bleu trypan (2x), mélanger doucement et colorer pendant 3 min.
      3. Comptez les cellules (voir l’étape 1.2.2 pour plus de détails).
      4. Calculez la viabilité cellulaire comme suit :
        % de survie cellulaire = figure-protocol-2 × 100 %
        REMARQUE : Seuls les échantillons présentant une viabilité ≥90 % ont été traités pour le test des comètes.

2. Préparation des réactifs et préparation des échantillons cellulaires

  1. Équilibrez la solution de lyse (contenant 2,5 M de NaCl, 100 mM d’EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1 % de Triton X-100, 10 % de DMSO) à 4 °C ± 0,5 °C pendant 30 min à l’aide d’un réfrigérateur.
  2. Faites fondre l’agarose à bas point de fusion (LMA) à 95 °C pendant 15 min, puis conservez-la dans un bain-marie à 37 °C pour éviter la solidification.
  3. Préparez le tampon d’électrophorèse alcaline (300 mM de NaOH, 1 mM d’EDTA, pH >13) en pesant 12 g de NaOH à l’aide d’une balance électronique, en pipetant 2 mL de solution d’EDTA à 500 mM, puis en ajoutant du ddH2Opour obtenir jusqu’à 1 L de tampon.
  4. Prélèvement cellulaire
    1. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants à l’aide de la filtration sous vide.
      1. Remettez doucement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet à l’aide d’embouts de pipette de 1 mL à large calibre, suivis de 10 inversions verticales.
      2. Comptez les cellules comme à l’étape 1.2.
      3. Centrifuger la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL à 150 × g pendant 5 min pour éliminer le milieu complet. Remettre en suspension les cellules lavées dans du PBS sans calcium à ~5,0 × 105 cellules/mL.

3. Procédure d’analyse des comètes

  1. Préparez à l’avance les lames de dosage des comètes et les échantillons de cellules. Préparez un mélange 10:1 (v/v) d’agarose LMA et de suspension cellulaire (5 × 105 cellules/mL) dans des tubes de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et mélangez délicatement. Distribuer 55 μL d’aliquotes du mélange d’agarose et de cellules sur des lames de comètes à l’aide d’une pipette tenue à un angle de 45°, en maintenant une distance de 2 mm de la surface de la lame. Placez les lames enrobées du mélange à 4 °C pendant 30 min pour éviter la lumière.
    REMARQUE : Lors de l’ajout du mélange LMA et cellulaire aux lames de test de comète, distribuez la suspension lentement et uniformément pour éviter la formation de bulles et assurer une distribution homogène du gel.
  2. Immergez les lames solidifiées dans une solution de lyse prérefroidie (contenant 2,5 M de NaCl, 100 mM d’EDTA, 10 mM de Tris, pH 10, 1 % de Triton X-100, 10 % de DMSO) et effectuez la lyse pendant ≥1 H à 4 °C dans des conditions de protection contre la lumière.
  3. Après la lyse, retirez la lame du lysat et utilisez un pistolet à pipette pour aspirer autant de liquide que possible autour de la palette. Placez ensuite la lame dans un tampon d’électrophorèse alcaline (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) et pré-équilibrez pendant 1 h à 4 °C en prenant soin d’éviter la lumière.
  4. Électrophorèse : Placez les lames dans une chambre d’électrophorèse et ajoutez suffisamment de solution d’électrophorèse alcaline pour immerger les lames. Effectuez une électrophorèse à 24 V (équivalent à 0,74 V/cm) avec un courant constant (300 mA) pendant 30 min à l’aide d’un tampon pré-équilibré (4 °C) pour minimiser les dommages à l’ADN.
  5. Neutralisation : Après l’électrophorèse, à l’aide d’un pistolet pipette, aspirer la solution d’électrophorèse alcaline de la lame, immerger les lames pendant 2 x 5 min dans du dH2O, puis les immerger dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 min. Faites sécher les lames dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min.
  6. Coloration : Appliquer une aliquote de 100 μL de 1x colorant d’acide nucléique YeaRed par puits et incuber pendant 30 min à température ambiante dans des conditions protégées de la lumière. Enlevez l’excès de tache par un rinçage aqueux doux suivi d’un séchage thermique à 37 °C.
  7. Imagerie : Effectuez la visualisation de la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif 4x, avec acquisition d’images numériques réalisée dans des conditions d’exposition standardisées.

4. Traitement des données

  1. Effectuez une analyse quantitative d’images pour déterminer les paramètres standard de la comète, notamment l’ADN de la queue ( %), le moment de la queue d’olive et la longueur de la queue (μm).
    1. Ouvrez l’interface du logiciel (Figure 5).
    2. Importez une image dans le logiciel, cliquez sur Fichier, puis sur Sélectionner un fichier pour importer l’image que vous souhaitez analyser dans le logiciel. Ensuite, maintenez le bouton de la souris enfoncé et faites-le glisser jusqu’à ce qu’une boîte bleue apparaisse. Faites glisser la boîte bleue pour vous assurer que la cellule que vous souhaitez analyser est enfermée dans la zone. L’option Ajuster de la figure permet d’ajuster la position du cadre afin d’inclure la cellule entière (Figure 5).
    3. Avant de commencer l’analyse, cliquez sur Démarrer, puis sur Analyser. Les résultats de l’analyse de cellule unique seront affichés sur le côté droit sous « Profils ». Après avoir analysé chaque cellule, cliquez sur Enregistrer. Les paramètres qui peuvent être détectés sont affichés sur le côté droit de « Profils », et les valeurs numériques des différents paramètres sont affichées en bas. Enfin, cliquez sur Fichier | Exporter les résultats. Les résultats obtenus incluent HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA %, TailDNA %, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment et OliveTailMoment.

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Résultats

Le test des comètes a été systématiquement utilisé pour quantifier les profils différentiels de dommages à l’ADN induits par le giltéritinib et l’AC220 dans les lignées cellulaires mutantes FLT3. Les analyses ont montré que la différence dans les dommages à l’ADN entre les populations cellulaires non traitées par le giltéritinib et l’AC220 n’était pas statistiquement significative (P > 0,05). Les augmentations dose-dépendantes des valeurs de l’ADN de la queue ( %) et de la queue du moment olive (OMT) ont atteint une s...

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Discussion

Le test des comètes représente une avancée significative dans les méthodologies d’évaluation de la génotoxicité. Cette technique offre des avantages distincts par rapport aux approches conventionnelles grâce à son accessibilité technique, sa résolution à l’échelle d’une seule cellule et sa visualisation directe des modèles de dommages via des profils de migration électrophorétique. Dans le développement thérapeutique de la LMA, le test des comètes permet d’évaluer systématiquement les pr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’équipe de recherche innovante pour la science et la technologie de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu (2021), le programme du centre de recherche en technologie de l’ingénierie du collège professionnel du Jiangsu (2023), le programme provincial des sciences et technologies médicales et de la santé du Zhejiang (2025KY1861), la Fondation clé des sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu de Chine (subvention n° 24KJA310008), les programmes du Collège de santé professionnelle de Suzhou (subvention n°. SZWZYTD202201, szwzy202406) et le projet du Laboratoire clé d’État de médecine et de protection contre les radiations de l’Université Soochow (GZK12023013).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTABeyotimeST066
1x colorant d’acide nucléique YeaRedOui10202ES
CELLULE 32DCobioerCBP60995
AC220TargetMolRéf. T2066
Kit de comptage cellulaire-8DojindoCK04
Plaque de comptage cellulaireQiuJingXB-K-25
Incubateur CO2Thermo51032872
Projet de logiciel d’analyse des comètes (CASP)
Kit d’analyse des comètes  ;TrévigenRéférence 4250-050-K
Cytation 5BioTek16280004
FBSPANRéférence ST30-3302
Le giltéritinibTargetMolRéf. T4409
GraphPad Prism 9.0
Centrifugeuse à grande vitesseThermo  ; 9AQ2861
L-1000XLS+ PipettesRainin17014382
L-20XLS+ PipettesRainin17014392
réservoir d’azote liquideMvecryogeYDS-175-216
Photomètre sur microplaques Multiskan FCThermo1410101
Na2OHDAMAO1588
PBSSolarbioRéf. P1020
Solution de pénicilline-streptomycine, 100xBeyotimeRéf. C0222
RPMI 1640 moyenGibcoC22400500BT
Microscope trinoculaire à cellules vivantesMotique1.1001E+12
Congélateur à ultra-basse températureHaireV118574

Références

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
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