Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Summary

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Abstract

Les produits naturels représentent une riche source de composés thérapeutiques avec des applications dans de multiples maladies, en particulier le cancer. En utilisant ces biomolécules comme modèles structurels dans la découverte de médicaments, les chercheurs ont obtenu à la fois des délais de développement plus rapides et une efficacité biologique améliorée par rapport aux composés entièrement synthétiques. La voie de synthèse des protéines s’est imposée comme une cible convaincante pour les produits naturels, notamment en raison de son implication dans les cancers difficiles à traiter. Le puissant inhibiteur de synthèse protéique, le cycloheximide, dérivé de Streptomyces griseus, illustre le potentiel des composés naturels dans cet espace. À mesure que ces dérivés naturels sont développés en molécules de type médicament, la confirmation de leur activité inhibitrice de synthèse protéique reste une étape cruciale de validation. L’objectif principal est de fournir un protocole adapté aux étudiants de premier cycle pour une évaluation rapide de l’activité d’inhibition des composés. Le protocole utilise un substrat fluorescent et des techniques avancées de microscopie à fluorescence pour détecter et mesurer systématiquement les capacités inhibitrices de ces produits naturels. L’étude a examiné des composés dérivés de deux espèces végétales : Pinus sylvestris et Psoralea corylifolia. En utilisant la cycloheximide comme inhibiteur de référence, les deux produits naturels ont montré des niveaux variables d’inhibition de la synthèse protéique.

Introduction

La synthèse protéique implique des processus fortement régulés : transcription et traduction. Lors de la transcription, des séquences d’ADN des gènes sont copiées, produisant ainsi de l’ARN messager (ARNm). L’enzyme ARN polymérase agit pour séparer la double hélice de l’ADN et utilise un brin comme guide pour construire une molécule d’ARNm correspondante. Une fois que l’ARNm est complètement formé, il voyage du noyau vers le cytoplasme pour la traduction. La translation se produit dans le ribosome, où l’ARNm sert de modèle pour assembler les acides aminés en une chaîne polypeptidique. Cette chaîne polypeptidique, en quittant le tunnel de sortie du ribosome, est repliée en une protéine fonctionnelle. La transcription est principalement régulée par les facteurs de transcription, les modifications de la chromatine et les ARN régulateurs, tandis que la traduction est régulée par les facteurs d’initiation, les voies de signalisation et les mécanismes de stabilité de l’ARN. Ces systèmes régulateurs permettent aux cellules de maintenir les fonctions cellulaires et de répondre efficacement au stress ou aux dommages¹.

La grande majorité des cancers humains — environ 85 % — se manifestent sous forme de tumeurs^{solides 2}. Bien que ces tumeurs puissent varier considérablement dans leurs caractéristiques et comportements spécifiques, elles ont tendance à partager certains traits physiologiques et schémas communs, comme une synthèse protéique surélevée indépendamment de leur étiologie ou de leur position^anatomique. Les cellules cancéreuses dérégulent la synthèse protéique en détournant les mécanismes de translation pour soutenir leurs besoins énergétiques élevés et leur croissance incontrôlée. Cette reprogrammation résulte d’une dysrégulation de presque toutes les principales voies de signalisation oncogéniques, favorisant la survie cellulaire, la prolifération et la métastase, tout en supprimant les voies de la mort cellulaire⁴. Dans les cellules tumorales, la machinerie de fabrication des ribosomes s’active à la surchauffe, permettant une production accrue de protéines et une division cellulaire rapide. Puisque cette synthèse protéique améliorée est cruciale pour la survie au cancer, les traitements ciblant et bloquant ce processus montrent des potentiels thérapeutiques⁵. Ainsi, des recherches axées sur les facteurs de traduction spécifiques au cancer, les compositions ribosomales uniques ou les voies de signalisation modifiées régulant la synthèse protéique pourraient produire des inhibiteurs plus ciblés avec des fenêtres thérapeutiques améliorées.

Parce que les produits naturels (NP) sont connus pour leur large gamme d’activités biologiques, le développement d’inhibiteurs sélectifs de synthèse protéique pour le traitement du cancer à l’aide de leurs échafaudages est une approche^{prometteuse 6,7}. Les NP peuvent cibler différents composants de la machinerie de synthèse protéique, de la liaison aux ribosomes à l’interférence avec les facteurs d’initiation ou les processus d’élongation, ce qui en fait des points de départ précieux dans le développement de médicaments pour les inhibiteurs de synthèse protéique dans les tumeurs^{solides 6}. La capacité à dépister rapidement les composés pour l’activité désirée constitue un point d’entrée crucial pour les plateformes de découverte de médicaments cherchant à identifier efficacement les résultats NP. En général, le criblage à haut débit des composés utilise des tests de fluorescence pour cibler rapidement les molécules candidates^{au plomb 8}.

Les scientifiques du monde entier s’appuient sur des techniques basées sur la fluorescence comme outils essentiels pour analyser les systèmes biologiques. Ces approches sont largement utilisées pour étudier les processus cellulaires, permettant aux chercheurs de suivre les interactions biomoléculaires en temps^{réel 9}. Combinées à des réactions bio-orthogonales de la chimie du clic, ces méthodes permettent une visualisation précise de la synthèse^{protéique 10}. Le test de synthèse des protéines fluorescentes présenté est une technique non radioactive pour évaluer la synthèse protéique qui utilise l’O-propargyl-puromycine (OPP), un analogue perméable aux cellules contenant de la puromycine alkyne. Après un traitement cellulaire, l’OPP s’incorpore à l’extrémité C des chaînes polypeptidiques allongées, provoquant la terminaison de la traduction. Ces protéines tronquées marquées par alkyne sont ensuite détectées à l’aide d’une chimie à clic catalysée par le cuivre, couplée à l’azide de 5 FAM.

Ce test fluorométrique est un outil de recherche précieux et une méthode de biologie chimique accessible pour former les étudiants de premier cycle. En fournissant un protocole accessible et efficace avec un traitement minimal des données, il offre aux étudiants une expérience pratique des techniques modernes de découverte de médicaments et accélère le processus de découverte. À mesure que la demande pour de nouveaux inhibiteurs de synthèse protéique augmente, cette approche offre aux étudiants de premier cycle des opportunités de recherche significatives tout en contribuant aux avancées en thérapie contre le cancer.

Protocol

1. Préparation des réactifs à partir du kit

REMARQUE : Mélangez correctement, réduisez la centrifugation et gardez tous les réactifs sur la glace jusqu’à utilisation.

1. Organiser et obtenir le kit d’inhibition de la synthèse protéique, le tampon PBS, le milieu de culture cellulaire, les plaques traitées en culture cellulaire, les tubes centrifugeuses stériles conique en polypropylène de 15 mL, les tubes centrifugeuses de 2 mL, les pipettes p10, p20, p200 et p1000, ainsi que les pointes appropriées.
2. Préparez le tampon de lavage.
   1. Décongelez le tampon de lavage 10x à 37 °C en tenant le flacon dans la main. Utilisez la chaleur corporelle des mains pour la dégeler et vérifiez fréquemment si la décongélation est terminée.
   2. Diluez les stocks tampons 10x de lavage 1:10 dans de l’eau déionisée dans un tube centrifugeuse. Mélangez par inversion ou resuspension en pipettant de haut en bas. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
3. Dégel la solution fixative à température ambiante. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
4. Préparez le tampon de perméabilisation.
   1. Décongelez le tampon de perméabilisation 10x à 37 °C en enveloppant le flacon dans la main. Utilisez la chaleur corporelle des mains pour la dégeler et vérifiez fréquemment si la décongélation est terminée.
   2. Diluez la crosse 10x 1:10 dans de l’eau déionisée dans un tube centrifugeuse. Mélangez les composants par inversion ou resuspension en faisant du pipettage vers le haut et le bas. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
5. Dégel 400x marquage protéique, 100x azide fluorescente, 100x cycloheximide, coloration ADN et l’agent réducteur 20x à température ambiante. Gardez sur la glace dans un environnement sombre pendant l’utilisation. Couvrez les colorants de papier aluminium ou conservez-les dans un réfrigérateur à 2 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés.

2. Marquage des témoins et des cellules expérimentales

REMARQUE : Ce protocole a été développé à partir de cellules MDA-MB-231 adhérentes et épithéliales du cancer du sein. Toute lignée cellulaire adhérente peut être utilisée. Toutes les étapes listées ci-dessous utilisent une plaque à 96 puits, et tous les volumes et concentrations sont calculés pour deux composés d’essai et deux témoins d’un volume de travail de 100 μL.

1. Culture des cellules adhérentes de mammifères
   REMARQUE : Les cellules doivent être éliminées avant d’atteindre une confluence de 80-90 % afin de maintenir une croissance saine et exponentielle et d’éviter l’inhibition ou la différenciation par contact.
2. Décongelez un flacon de cellules cryopréservées à température ambiante, puis diluez avec un milieu approprié.
3. Centrifugez la suspension pour pelleter les cellules et aspirez le surnageant. Reposez la pelote dans un milieu frais et transférez-la dans une nouvelle fiole à la densité cellulaire appropriée.
4. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, retirez le milieu et aspirez le milieu ancien du flasque. Ensuite, rincez les cellules avec du PBS stérile pour éliminer le sérum résiduel, qui inhibe la trypsine. Ajoutez la solution de trypsine-EDTA pour recouvrir la couche cellulaire et incubez pendant 3 à 5 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se détachent à 37 °C.
5. Ajoutez un milieu complet contenant un sérum pour inactiver la trypsine, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube, mélangez doucement et comptez les cellules.
6. Les cellules de semence dans les plaques de criblage diluent les cellules au ratio de répartition approprié (par exemple, 1:3 ou 1:5) dans des fioles fraîches avec un nouveau milieu et les incubent (généralement 37 °C, 5 % de CO₂) pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée.
   REMARQUE : Pour l’expérience décrite ici, la lignée cellulaire a été placée à 2 × 10⁴ par puits (plaque de 96 puits) et incubée à 37 °C pendant 12 heures.

3. Ajout de composés

1. Préparez le master mix A.
   1. Étiquetez un tube centrifugeuse comme « A ». Pipettez 598,5 μL de milieu de culture et 1,5 μL de marquage protéique en « A ». Resuspendez le mélange pour assurer l’homogénéité en pipettant de haut en bas.
2. Préparez le master mix B.
   1. Étiquetez un tube centrifugeuse comme « B ». Pipeter 1,5 μL de marquage protéique, 6,6 μL de cycloheximide et 591,9 μL de milieu de culture en « B ». Resuspendez le mélange pour assurer l’homogénéité en pipettant de haut en bas.
3. Traiter les cellules avec les composés désirés (Figure 1), les témoins positifs et négatifs.
   1. Retirez les cellules de l’incubateur et retirez le milieu de croissance par aspiration. Inclinez la plaque et aspirez sur le côté du puits au lieu du centre pour éviter la perturbation des cellules.
   2. Pipeter 1 μL de composé test dans un puits et 1 μL de véhicule composé d’essai (0,1 % de DMSO v/v) dans un puits. Pour les études dupliquées, ajoutez chaque échantillon à un second puits et répétez ce processus. Ajoutez 99 μL de mélange maître A dans ces puits. Pipettez doucement en angle vers le côté du puits pour éviter la perturbation cinétique des cellules.
      REMARQUE : La concentration maximale de DMSO pour le criblage des composés dépend du type cellulaire et du test, mais les recommandations générales sont : 0,1-0,5 % de DMSO – généralement sûr pour la plupart des tests cellulaires avec une toxicité minimale, et 1 % de DMSO – maximum couramment utilisé et acceptable pour de nombreux types cellulaires dans des tests à court terme.
   3. Pipettez 100 μL de mélange maître B dans deux puits. Pipeter en angle vers le côté du puits pour éviter la perturbation des cellules.
   4. Tapotez doucement la plaque pour y parvenir, en incorporant les composants désirés avec les cellules. Incubez les cellules à 37 °C pendant 0,5 à 2 heures.

4. Fin de l’expérience et lavage des cellules

1. Supprimez le support culturel via l’aspiration. Inclinez la plaque et aspirez sur le côté du puits au lieu du centre pour éviter la perturbation des cellules.
2. Ajoutez 100 μL de tampon PBS dans chaque puits et centrifugez la plaque à 900 × g pendant 5 minutes.
3. Retirez le tampon PBS par aspiration.

5. Fixation et perméabilisation

1. Ajoutez 100 μL de solution fixative à chaque puits. Incubez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes dans un environnement sombre.
2. Retirez la solution fixative par aspiration. Inclinez la plaque et aspirez sur le côté du puits au lieu du centre.
3. Lavez les cellules avec 100 μL de tampon de lavage et retirez le tampon par aspiration. Répétez cette étape deux fois.
4. Ajoutez 100 μL de tampon de perméabilisation à chaque puits et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.
5. Retirez le tampon de perméabilisation par aspiration. Inclinez la plaque et aspirez sur le côté du puits au lieu du centre.

6. Réaction protéique et coloration

1. Préparez le cocktail master mix de réaction.
   1. Ajoutez 651 μL de tampon PBS, 7,0 μL de réactif cuivre 100x, 7 μL d’azide fluorescente, et enfin 35 μL d’agent réducteur dans un tube centrifugeuse. Résuspendez ce mélange pour assurer l’homogénéité.
      REMARQUE : Suivez exactement cet ordre lors de l’ajout des réactifs. À utiliser dans les 15 minutes suivant la préparation.
2. Ajoutez 100 μL du cocktail de réaction à chaque puits. Incubez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante dans un environnement sombre pour éviter le photoblanchiment.
3. Centrifugez les cellules à 900 × g pendant 5 minutes. Équilibrez la centrifugeuse en ajoutant des plaques vides pour répartir le poids uniformément. Retirez le mélange par aspiration.
4. Lavez les cellules avec 100 μL de tampon de lavage et retirez le tampon par aspiration. Répétez cette étape deux fois.

7. Coloration ADN

1. Préparez une dilution 1x de coloration ADN totale et ajoutez 100 μL à chaque puits. Incubez les cellules à température ambiante pendant 20 minutes dans un environnement sombre pour éviter le photoblanchiment.
2. Centrifugez la plaque à 900 × g pendant 5 minutes. Équilibrez la centrifugeuse en ajoutant des plaques vides pour répartir le poids uniformément. Retirez le mélange par aspiration.
3. Lavez les cellules avec 100 μL de tampon de lavage et retirez le tampon par aspiration. Répétez cette étape deux fois.
4. Resuspendez les cellules avec 100 μL de tampon PBS refroidi pour les préparer à l’imagerie.

8. Imagerie

1. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques.
2. Réglez le grossissement à 20x.
3. Analysez la coloration du noyau avec le canal GFP 469/525 nm. Utilisez l’autobinning et l’autofocus pour améliorer les résultats d’imagerie.
4. Analysez la synthèse protéique active avec le canal Texas Red 586/647nm. Utilisez l’autobinning et l’autofocus pour améliorer les résultats d’imagerie.

Results

Cet essai utilisait la fluorescence pour visualiser et quantifier la capacité des différents produits naturels à inhiber la synthèse des protéines. La cycloheximide (CHX) est un inhibiteur de synthèse protéique connu dont le mode d’action consiste à interférer avec le processus de translocation lors de l’élongation¹¹. Pour cette étude, des cellules vivantes ont été détectées avec un colorant nucléaire vert fluorescent. L’OPP est un dérivé de la puromycine qui se l...

Discussion

Ce protocole propose une méthodologie de dépistage fluorométrique pour tester les produits naturels et les petites molécules afin d’évaluer leur capacité à inhiber la synthèse des protéines. La simplicité de ce protocole permet aux chercheurs de premier cycle de l’appliquer correctement, leur permettant d’apporter des contributions substantielles aux connaissances scientifiques. Le protocole exige une compréhension de base des méthodes et techniques biologiques, avec des étapes nécessita...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lecteur multimode d’imagerie cellulaire Agilent Biotek Cytation 1	Agilent  ;	BTCYT1V
Composé 1 (Déshydroabitétylamine, CAS 1446-61-3)	Énamine	EN300-7409771
Composé 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific & nbsp ;	75004271
Plaque Ibidi GmbH-slide à 96 puits	Ibidi	80826
Lignées cellulaires MDA-MB-231	ATCC	ATCC HTB-26
Solution saline tamponnée phosphate pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Kit de synthèse protéique (vert)	Abcam	Ab239725