Sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’ADN comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence

Résumé

Ce protocole décrit la conception de sondes d’hybridation fractionnée utilisant l’aptamère lumineux fluorescent DAP-10-42 comme rapporteur de signal et leur application pour la détection des acides nucléiques et la différenciation entre les cibles avec des substitutions de nucléotides uniques.

Résumé

Les aptamères fluorescents lumineux (FLAP) à base d’ADN sont prometteurs pour les tests bioanalytiques car ils fournissent une lecture de signal fluorescent à faible coût sans qu’il soit nécessaire de marquer les rapporteurs de signaux d’acide nucléique avec des fluorophores et/ou des trempeurs, contrairement aux sondes d’hybridation conventionnelles utilisées pour la détection instantanée des acides nucléiques. Au lieu de cela, les FLAP se lient de manière non covalente aux ligands de colorants, qui présentent une fluorescence intrinsèquement faible dans les solutions aqueuses, mais deviennent fortement émetteurs lors de la liaison de FLAP. Ce protocole décrit un algorithme permettant de concevoir des capteurs d’aptamères lumineux divisés (SLAS) à l’aide du DAP-10-42, le FLAP d’ADN le plus efficace signalé à ce jour. Lorsqu’il est équipé de séquences d’acides nucléiques complémentaires à une cible d’acide nucléique d’intérêt, le SLAS est un outil prometteur pour l’analyse des acides nucléiques permettant la détection spécifique à la séquence de cibles d’acides nucléiques avec une sélectivité allant jusqu’à un nucléotide pour permettre l’analyse des substitutions de nucléotides uniques (SNS). Les SLAS offrent l’avantage d’une lecture de signal basée sur la fluorescence sans marquage, qui peut être mesurée avec un spectrophotomètre fluorescent conventionnel à cuvette, un fluorimètre portable ou observée visuellement lors de l’excitation avec une source lumineuse portable. L’approche SLAS est bénéfique pour les applications de biodétection dans le diagnostic des maladies, la surveillance de l’environnement et la recherche biomoléculaire.

Introduction

L’analyse des acides nucléiques à l’aide de sondes d’hybridation est régulièrement effectuée pour détecter et quantifier des séquences spécifiques d’ADN/ARN¹. L’une des sondes d’hybridation les plus réussies est la sonde Molecular Beacon (MB), qui est un ADN en forme d’épingle à cheveux
oligonucléotide marqué à l’aide d’un fluorophore et d’un quencher aux extrémités opposées ^2,3. Il détecte instantanément (sans qu’il soit nécessaire de laver le complexe sonde-cible de l’excès de la sonde) la présence d’une séquence d’acide nucléique complémentaire au fragment de boucle de la sonde et est couramment utilisé en PCR quantitative (qPCR). La nécessité de fixer de manière covalente deux colorants - le fluorophore et le quencher - à la séquence oligonucléotidique de la sonde augmente le coût, en particulier lorsqu’une nouvelle sonde MB ciblant une nouvelle séquence d’acide nucléique est nécessaire. Alternativement, la sonde MB peut être utilisée comme rapporteur de signal dans un format de sonde d’hybridation multicomposant (divisée), dans lequel deux oligonucléotides non marqués interagissent à la fois avec la cible et le rapporteur de sonde MB⁴. L’approche de la sonde multicomposant améliore la sélectivité pour la reconnaissance des acides nucléiques et améliore la liaison de la sonde aux cibles structurées ^5,6,7, Cette approche n’élimine néanmoins pas la nécessité d’un marquage covalent du rapporteur avec un fluorophore⁸.

Les aptamères fluorescents lumineux (FLAPs⁾⁹ sont des aptamères qui ont une affinité pour les colorants sensibles à l’environnement faiblement fluorescents (fluorogènes), où la liaison par FLAP améliore la fluorescence du collecteur de fluorogènes. Contrairement aux sondes et aux rapporteurs de signaux marqués par fluorescence, les FLAP n’exigent pas que les éléments de détection soient marqués de manière covalente avec un ou plusieurs colorants et offrent ainsi l’avantage d’une détection par fluorescence sans marquage¹⁰. Ceci est particulièrement important lors de l’étape d’optimisation lorsque des dizaines de constructions d’acides nucléiques doivent être testées pour obtenir des performances de dosage satisfaisantes. De plus, les tests FLAP peuvent être optimisés en ajustant la concentration d’un capteur fluorogène et/ou FLAP plutôt qu’en modifiant la conception du capteur. Ces avantages peuvent être significatifs pour les laboratoires de recherche et d’enseignement à petit budget. Les FLAP d’ADN sont particulièrement prometteurs en tant que rapporteurs de signaux de sondes d’hybridation multicomposants appelées capteurs d’aptamères lumineux divisés (SLAS)¹¹. Le FLAP d’ADN le plus efficace signalé à ce jour est le DAP-10-42, qui a été sélectionné à l’origine pour améliorer la fluorescence des colorants dapoxylsulfonyliques¹², avec une capacité de promiscuité à se lier et à améliorer la fluorescence d’une variété de colorants arylméthane (par exemple, auramine O, AO ; violet cristallique, CV)¹³. Le DAP-10-42 a été converti en SLAS pour être utilisé pour l’analyse des acides nucléiques 13,14,15.

L’objectif de la méthode décrite ici est de permettre l’analyse spécifique à la séquence de cibles d’acide nucléique d’intérêt à l’aide de brins SLAS sans marquage et d’un colorant fluorogène comme composant tampon. Ce protocole décrit un algorithme de conception de SLAS basé sur DAP-10-42 et met en évidence les performances des SLAS pour la détection hautement sélective de séquences d’acides nucléiques ne différant que par un seul nucléotide.

Le test de détection des acides nucléiques SLAS nécessite l’utilisation de deux oligonucléotides d’ADN non modifiés synthétisés sur mesure à une concentration finale de 0,5 à 1 μM pour des performances maximales. Le protocole décrit ici utilise un colorant Auramine O (AO) disponible dans le commerce en tant que fluorogène. La concentration finale d’AO dans le test varie de 1 à 10 μM pour assurer une augmentation élevée de la fluorescence en présence d’une cible d’acide nucléique spécifique sur le blanc (absence de la cible ; Figure supplémentaire 1). Les composants nécessaires du tampon de dosage sont les ions potassium et magnésium (figure supplémentaire 2). Les ions potassium (1,25-40 mM) stabilisent le domaine G-quadruplex proposé du FLAP utilisé comme rapporteur de signal. Les ions magnésium (2,5-50 mM) réduisent la répulsion des groupes phosphate chargés négativement lors des interactions SLAS-cible. La température du test SLAS utilisant les séquences rapportées pour le domaine de rapport du signal ne doit pas dépasser 28 °C pour éviter la perte de performance¹⁶.

SLAS est compatible avec les cibles d’acides nucléiques monocaténaires, telles que les amplicons d’ADN de PCR asymétrique ou une réaction d’amplification isotherme de l’ADN (par exemple, l’amplification par polymérase recombinase, RPA¹⁷), les produits d’ARN issus de l’amplification médiée par transcription (TMA) ou de l’amplification basée sur la séquence d’acides nucléiques (NASBA)¹⁸, et les molécules d’ARN natives telles que le miARN, l’ARNr ou l’ARNnc). Les variations de la séquence nucléotidique de la cible jusqu’à un seul nucléotide peuvent être détectées à l’aide de l’approche SLAS^13,14.

Protocole

1. Conception du capteur Split-Up Aptamer Sensor (SLAS) avec DAP-10-42 comme rapporteur de signal

1. Concevoir les séquences de deux brins d’oligonucléotides d’ADN non modifiés constituant les SLAS. Utilisez un fragment contenant les nucléotides (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tableau 1, Figure 1A).
2. Convertissez la séquence de la tige 1 (nts 1-8 et 36-42) en tige 1' en retirant un résidu de thymine bombé à la position nt 5, en raccourcissant la tige à 4 pb (nts 4, 6-8 et 36-39) et en ajoutant une bp terminale C-G (Figure 1A, étape 1). De plus, l’un des brins SLAS contient les nts 9 à 29 de la séquence centrale DAP-10-42, tandis qu’un autre brin SLAS contient les nt 30 à 35 de la séquence.
3. Étendre la séquence 3'-terminale du fragment contenant nts 9-29 avec d(GGTCAT), et la séquence 5'-terminale du fragment nts 30-35 avec d(ATGACC) pour former une tige 2 de 6-bp (Figure 1A, étape 2).
   REMARQUE : Les paires de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 et G8-C36 de la tige 1 dans DAP-10-42 sont nécessaires pour la fonction d’éclairage de l’aptamère. La séquence de la tige 1' ne peut être modifiée qu’au niveau de la borne bp et peut être une paire de bases G-C, A-T, T-A ou étendue avec 1-2 paires de bases selon les besoins. La séquence de la tige 2 est arbitraire et peut être modifiée. Cependant, il est recommandé de préserver la stabilité thermodynamique de la tige 2 à moins que la température d’essai ne soit supérieure à 28 °C. Le raccourcissement ou la déstabilisation de la tige 2 empêche la liaison prématurée du colorant sans cible si un bruit de fond élevé de l’essai fluorescent basé sur le SLAS est observé. La division de la séquence nucléotidique DAP-10-42 entre les nts 28-29, 27-28 ou 26-27 au lieu des nts 29-30 est également autorisée (Figure 1B).
4. Pour adapter le SLAS conçu à une cible ou à un intérêt d’acide nucléique, étendez la tige 1' avec des séquences d’ADN complémentaires aux fragments de liaison cible-cible (bras) par l’intermédiaire de lieurs d(TT) (Figure 1A, étape 3). Cela donne les séquences de brins SLAS-U et SLAS-S constituant la sonde.
5. Faire en sorte que le bras de liaison à la cible de SLAS-S soit complémentaire à un fragment de 7 à 10 nt de la cible contenant le site SNS, et que le bras de liaison à la cible de SLAS-U soit complémentaire à un fragment de 15 à 25 nt de la cible adjacent au bras de liaison à la cible de SLAS-S (tableau 1).
   REMARQUE : Il est facultatif de connecter le bras de liaison de cible de SLAS-S à nt 4 ou nt 39 de la séquence DAP-10-42 (Figure 1, bras 1 ou bras 2, respectivement).
6. Évaluez la température de fusion (T_m) des duplex entre la cible d’intérêt et les bras de liaison de cible de SLAS-S et SLAS-U à l’aide du serveur Web UNAFold (unafold.org)¹⁹.
   1. Cliquez sur l’onglet DINAMelt en haut de la page Web ; allez à Applications et sélectionnez Hybridation par fusion à deux états (Figure supplémentaire 3A). Sur la page Hybridation par fusion à deux états, entrez l’une des séquences en interaction dans la case de gauche et une autre dans la case de droite (Figure supplémentaire 3B). Assurez-vous que les deux séquences sont dans l’ordre de 5' à 3'. Vous pouvez saisir plusieurs paires de séquences en interaction en les séparant par des points-virgules.
   2. Au bas de la page, indiquez la température d’essai (22 °C), les concentrations en cations monovalents et divalents (20 mM et 25 mM, respectivement) pour correspondre aux conditions d’essai. Indiquez la concentration des séquences en interaction.
   3. Appuyez sur Soumettre (Figure supplémentaire 3B). Observez les résultats qui incluent la variation d’énergie de Gibbs, la variation d’enthalpie et la variation d’entropie de la liaison, ainsi que les valeurs T_m pour les duplex correspondants (figure supplémentaire 3B).
   4. Assurez-vous que les valeurs T_m des duplex entre la cible entièrement appariée (M) et les bras de liaison de cible de SLAS-S et SLAS-U sont supérieures à la température de test, qui est de 22 °C dans le protocole actuel. Ici, les valeurs T_m étaient respectivement de 32,2 °C et 74,4 °C (figure supplémentaire 3C).
   5. Assurez-vous que le duplex entre SLAS-S et une cible non appariée (MM) contenant un SNS a un T_m en dessous de la température de test. Cela garantit une grande sélectivité de la reconnaissance sonde-cible, empêchant le fluorogène AO de signaler la présence de l’analyte d’acide nucléique ciblé s’il contient un SNS dans le fragment de liaison SLAS (Figure 2). Ici, le T_m était de 21,3 °C (figure supplémentaire 3C), ce qui était suffisant pour distinguer le décalage du complexe apparié.
   6. Ajuster les séquences des bras de liaison de la cible en raccourcissant ou en allongeant les fragments complémentaires de la cible, si nécessaire, pour répondre aux exigences de stabilité indiquées.
7. Procurez-vous les brins conçus SLAS-S et SLAS-U auprès de tout fournisseur commercial fournissant des oligonucléotides d’ADN sur mesure ou synthétisez les brins d’ADN en interne à l’aide d’un synthétiseur d’oligonucléotides automatisé.

Figure 1 : Conversion d’un aptamère lumineux fluorescent (FLAP) DAP-10-42 en un capteur d’aptamère lumineux divisé (SLAS). (A)La structure secondaire de DAP-10-42¹² est prédite par une application de repliement de l’ADN du serveur Web UNAFold¹⁹ à 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺. L’aptamère présente une structure secondaire en épingle à cheveux avec un noyau qui se replie probablement en un motif G-quadruplex stabilisé par la tige 1. Pour que le DAP-10-42 soit converti en SLAS, (1) la tige 1 de l’aptamère est raccourcie à 4 pb et flanquée d’une tige G-C bp supplémentaire pour faire la tige 1' ; (2) la séquence centrale est divisée entre les NT 29 et 30, les côtés 3' et 5' du site divisé étant prolongés par des séquences complémentaires d(GGTCAT) et d(ATGACC), respectivement, pour former la tige 2 ; (3) la tige 1' est prolongée avec les séquences complémentaires aux fragments adjacents d’une cible d’intérêt - bras de liaison de cible, avec un liant d(TT) entre les bras de liaison de cible et le domaine de rapport de signal de la sonde. (B) Le noyau peut également être divisé entre les nts 28-29, 27-28 ou 26-27 sans perte significative du signal et/ou augmentation du pli de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Mécanisme de génération de signal SLAS. SLAS est composé de deux brins - SLAS-U et SLAS-S - et d’un colorant fluorogène (p. ex., Auramine O ; AO). En l’absence d’une cible d’acide nucléique d’intérêt, les deux brins sont à l’état dissocié et incapables de lier le colorant ; Aucun signal n’est observé (centre). En présence d’une cible M entièrement appariée, SLAS-U et SLAS-S s’hybrident avec le fragment voisin de M pour rapprocher les fragments de cœur. Cela permet la formation du site de liaison du colorant. La liaison de l’AO améliore sa fluorescence, qui est mesurée sous la forme d’une lecture de signal fluorescent (à gauche). En présence d’un MM cible non apparié contenant une substitution mononucléotidique (SNS) dans un fragment interagissant avec SLAS-S, seul SLAS-U peut s’hybrider avec la cible MM, tandis que SLAS-S est à l’état dissocié. Cela empêche la formation du site de liaison du colorant, et aucun signal n’est observé (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Amplification de la séquence ciblée

1. Amplifiez un fragment du gène à analyser avec le test SLAS. Pour l’amplification par PCR ou RPA, utilisez des conditions asymétriques (par exemple, avec l’amorce directe ajoutée à 10 fois l’excès par rapport à l’amorce inverse) pour générer un amplicon simple brin. Pour amplifier un fragment de 126 nt du gène NANOGP8 à l’aide de la PCR²⁰ linéaire après l’exponentielle (LATE), utilisez les séquences d’amorces répertoriées dans le tableau 2. Ici, une matrice d’ADN simple brin (matrice NANOGP8 ou matrice G1423C, tableau 2) correspondant au fragment de 126 nt du gène a été utilisée. Le modèle a été synthétisé sur mesure par Integrated DNA Technologies, Inc.
   1. Préparez une réaction PCR de 100 μL en mélangeant 10 μL de tampon de réaction Taq standard 10x, 2 μL de mélange dNTP de 10 mM (pour avoir une concentration finale de 0,2 mM), 10 μL d’amorce directe de 10 μM et 10 μL d’amorce inverse de 1 μM (pour une concentration finale de 1 μM et 0,1 μM, respectivement), 0,5 μL d’ADN polymérase 5U/μL Taq, de matrice d’ADN et d’eau sans nucléases. Pour un contrôle sans modèle, ajoutez de l’eau à la place du modèle.
   2. Utiliser les conditions de thermocyclage suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min ; 45 cycles de (1) dénaturation à 95 °C pendant 15 s, (2) recuit d’apprêt à 60 °C pendant 30 s, (3) extension d’apprêt à 68 °C pendant 30 s ; et extension finale à 68 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : Les techniques d’amplification basées sur la transcription telles que NASBA¹⁸ peuvent être utilisées à la place de la PCR ou de la RPA, surtout si une matrice d’ARN est disponible pour l’amplification. NASBA génère un amplicon d’ARN simple brin à une concentration de produit final de l’ordre des micromolaires, ce qui est suffisamment élevé pour être utilisé dans le test SLAS en aval sans concentration de produit.
2. Précipiter les échantillons amplifiés avec de l’éthanol en ajoutant 0,1 fois le volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,5) et 3 fois le volume d’éthanol. Incuber à -20 °C pendant 1 h, centrifuger à 12 000-18 000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
3. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, centrifugez-la à nouveau et jetez à nouveau le surnageant. Faites sécher la pastille à l’air libre et dissolvez-la dans 10 μL d’eau exempte de nucléases à utiliser dans le test SLAS.

3. Test de fluorescence à l’aide de SLAS

1. Préparer des solutions mères d’AO (0,1 mM dans le DMSO, 10x), de SLAS-S (10 μM dans de l’eau sans nucléases, 10x), de SLAS-U (10 μM dans de l’eau sans nucléases, 10x) et de 4x tampon de dosage (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl).
   REMARQUE : Les ions potassium sont nécessaires pour stabiliser le motif présumé G-quadruplex de l’aptamère, qui fait partie du site de liaison du colorant. Aussi peu que 1 mM de KCl (à 25 mM MgCl₂) dans un tampon de test 1x est suffisant pour assurer une augmentation de la fluorescence de ~14 fois en présence de la cible spécifique M sur le blanc (échantillon sans cible ; Figure supplémentaire 2B). Les ions magnésium stabilisent les interactions des brins d’acide nucléique (entre SLAS-S, SLAS-U et la cible). La concentration de Mg²⁺ dans le tampon de dosage 1x doit être d’au moins 5 mM (à 20 mM KCl ; Figure supplémentaire 2C,D). La solution mère d’AO (~1 mM) est préparée dans du DMSO. Les concentrations de stock de SLAS-S et de SLAS-U sont arbitraires et peuvent être ajustées si nécessaire tant que les concentrations finales des brins sont maintenues (voir la justification du choix de la concentration finale de SLAS dans la discussion).
   ATTENTION : L’AO est nocif en cas d’ingestion, toxique au contact de la peau et suspecté de provoquer le cancer. Portez toujours des gants lorsque vous travaillez avec des solutions AO. La pesée de l’AO et la préparation de ses solutions mères doivent se faire sous le capot chimique.
2. Préparez le mélange maître contenant tous les composants du test sauf la cible. Calculez le volume de mixage maître (_mélange V) en multipliant le volume d’échantillon (60 μL) par le nombre d’échantillons plus un (n+1) :
   
   Le nombre d’échantillons n doit inclure les témoins négatifs et positifs nécessaires.
3. Combinez 0,25x V_mix μL de 4x tampon de dosage, 0,1x V_mix μL de 0,1 mM AO, 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S et 0,1x V_mix μL de 10 μM SLAS-S. Ajouter de l’eau exempte de nucléases au volume final de manière à ce qu’elle puisse accueillir le volume cible ajouté à l’étape 3.4. Vortex et centrifugez brièvement le mélange principal. Aliquote 50 μL du mélange maître dans n tubes d’échantillon.
   REMARQUE : Le volume de l’échantillon peut être ajusté en fonction des caractéristiques de l’instrument utilisé pour détecter le signal fluorescent. Le volume du mélange maître qui est aliquote dans les tubes d’échantillonnage peut être ajusté en fonction du volume cible ajouté à l’étape 3.4. Le volume d’eau sans nucléases ajouté pour faire le mélange maître doit être ajusté en conséquence. Par exemple, si l’échantillon contenant la cible est ajouté à 10 % (V/V) du volume final de l’échantillon, de l’eau doit être ajoutée au mélange maître jusqu’à 0,9 fois le_mélange V.
4. Utilisez un échantillon comme témoin sans cible (blanc) et un échantillon comme témoin positif. Ajoutez 10 μL de l’échantillon contenant la cible au mélange maître (50 μL) pour obtenir le volume final de l’échantillon de 60 μL contenant une cible de 10 à 1000 nM. Pour le blanc, utilisez de l’eau sans nucléase (10 μL) au lieu de la cible. Pour le contrôle positif, utilisez un oligonucléotide d’ADN synthétique contenant la séquence ciblée (p. ex., cible M, tableau 1). Ajouter 10 μL de témoin 0,6-3 μM pour obtenir une concentration finale de 0,1-0,5 μM.
   REMARQUE : La fluorescence élevée de ce contrôle positif garantit que le test fonctionne comme prévu, même si un signal négatif est observé pour les échantillons inconnus testés.
5. Mélangez les échantillons et faites-les tourner à l’aide d’une microcentrifugeuse. Incuber les échantillons à 22 °C pendant 10 à 60 min. Le signal n’augmente que de <15 % entre 40 min et 60 min (Figure 3).
6. Mesurer la fluorescence des échantillons à 540 nm lors de l’excitation à 475 nm à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent.
   REMARQUE : Il est possible d’utiliser un fluorimètre portable qui mesure la fluorescence dans des tubes PCR à paroi mince. Le fluorimètre doit être équipé de filtres d’excitation et d’émission adaptés à la détection de la fluorescence AO. Un exemple de filtre d’excitation approprié est un filtre passe-bas de 495 nm. Un exemple de filtre antipollution approprié est 510-580 nm. Alternativement, le signal peut être observé visuellement lors de l’excitation de la fluorescence AO dans l’échantillon avec une source de lumière UV ou bleue.
   ATTENTION : Si une lampe UV est utilisée, portez des lunettes de protection UV.

Figure 3 : Dépendance temporelle de la génération du signal pour SLAS-29U/30S. Un échantillon contenant AO, SLAS-29U et SLAS-30S a été analysé à l’aide du mode cinétique d’un spectrophotomètre fluorescent (excitation à 475 nm, émission à 540 nm, fentes d’excitation/émission à 5 nm) pendant 60 min. À un moment de 5 minutes (indiqué par une flèche), la cible M a été ajoutée à l’échantillon. La moyenne des données provient de deux essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

La performance de SLAS utilisant le noyau DAP-10-42 comme rapporteur de signal a été démontrée à l’aide d’une sonde conçue pour interroger un fragment du gène NANOGP8 important pour la progression du glioblastome multiforme (GBM), une forme agressive de cancer du cerveau²¹. Il a été rapporté que ce fragment contenait des SNS dans la cargaison d’ADN d’exosomes dérivés de cellules cancéreuses²². Par conséquent, le SLAS a été adapté au site SNS du gène. Des cibles d’A...

Discussion

Dans le protocole rapporté, les étapes critiques comprennent i) la conception du SLAS ; (ii) la température d’essai ; (iii) présence de cations métalliques mono- et divalents (K⁺ et Mg²⁺) ; iv) les concentrations de brins SLAS.

Conception SLAS
Lors de la conception des brins SLAS, il est important de prendre en compte la stabilité thermodynamique des complexes formés par les brins SLAS-S et SLAS-U en l’absence de cible...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Auramine O	MP Biomedicals  ;	195064	Colorant fluorogène utilisé pour la transmission de signaux
Fluorimètre Cary Eclipse	Agilent Technologies	G9800A	pour mesurer le signal fluorescent des échantillons
Dimethy Sulfoxyde	MP Biomedicals  ;	196055	solvant pour préparer des solutions mères d’Auramine O
Oligonucléotides d’ADN (amorces, brins SLAS, matrice synthétique pour PCR)	IDT	N/A	Fabriqué sur mesure et dessalé par le vendeur, utilisé sans autre purification
Mélange dNTP, 10 mM	ThermoFisher Scientific	Réf. R0191	pour la réaction PCR TARDIVE
Chlorure de magnésium	Invitrogen	AM9530G	composant tampon ; nécessaire à l’association correcte des brins de la sonde avec la cible analysée
Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)	Fisherbrand	02-681-320	Plastique pour la préparation des échantillons
Micropipette (0,1-2,5 & micro ; L)	Eppendorph	K56877G	utilisé pour la préparation des échantillons
Micropipette (100-1000 & micro ; L)	Eppendorph	K13160F	utilisé pour la préparation des échantillons
Micropipette (20-200 & micro ; L)	Eppendorph	J05253M	utilisé pour la préparation des échantillons
Micropipette (2-20 µ ; L)	Eppendorph	G24675G	utilisé pour la préparation des échantillons
Mini centrifugeuse	Corning  ;	6770	utilisé pour faire tourner les échantillons  ;
Eau sans nucléases (non traitée au DEPC)	ThermoFisher Scientific	Référence AM9932	Utilisation pour les échantillons dans les tests PCR et SLAS
Tubes PCR (0,5 ml)	Invitrogen	Référence AM9932	pour mesurer la fluorescence à l’aide du fluorimètre Quantus
pointes Pipett (20-200 & micro ; L)	VWR	76322-150	Plastique pour la préparation des échantillons
Pointes de pipette (1-10 uL)	VWR	76322-528	Plastique pour la préparation des échantillons
Chlorure de potassium	Invitrogen	AM9640G	composant tampon ; nécessaire au pliage correct du domaine de l’aptamère lumineux fluorescent de la sonde
Fluorimètre Quantus	Promega	E6150	Fluorimètre portable à faible coût qui peut être utilisé pour les mesures de fluorescence
Cuvette en quartz	Starna	16.50F-Q-10/Z15	à utiliser pour la mesure de fluorescence à l’aide du fluorimètre Cary Eclipse
ADN polymérase Taq avec tampon Taq standard	BioLabs de la Nouvelle-Angleterre	M0273S	pour l’amplification d’un fragment de gène à analyser avec le test SLAS  ;
Tampon Tris-HCl (pH 7,4)	Boston Bioproducts	Le R-314	composant tampon
Lampe UV	UVP	95-0016-14	pour exciter l’AO pour l’observation visuelle du signal
Mélangeur Vortex	VWR	10153-838	utilisé pour le mixage des échantillons