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Un cadre d’imagerie multimodale pour faire progresser le phénotypage de cellules cancéreuses du sein vivantes sans marquage

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DOI :

10.3791/68498

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22 août 2025

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1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une approche multimodale combinant la spectroscopie Raman et la microscopie de phase tomographique pour le phénotypage non invasif et sans marquage de cellules cancéreuses du sein humaines vivantes. Il comprend un pipeline d’analyse convivial et sans biais humain pour une analyse morphochimique quantitative rapide, fournissant des informations moléculaires et structurelles détaillées avec des applications dans la recherche sur le cancer et la biologie cellulaire.

Résumé

Nous présentons la micro-spectroscopie Raman confocale multimodale (RS) et la microscopie de phase tomographique (TPM) pour le phénotypage morphochimique rapide des cellules cancéreuses du sein humain (MDA-MB-231). En tirant parti de la nature non perturbative de ces techniques de microscopie avancées, nous avons capturé des données morphomoléculaires détaillées à partir de cellules vivantes sans marquage dans leur environnement physiologique natif. Des pipelines de traitement de données sans biais humains ont été développés pour analyser des images Raman hyperspectrales (couvrant des modes Raman de 600 cm-1 à 1800 cm-1, qui caractérisent de manière unique une large gamme de liaisons moléculaires et de structures subcellulaires), ainsi que des données morphologiques provenant de tomogrammes tridimensionnels à indice de réfraction (fournissant des mesures du volume, de la surface, de l’empreinte et de la sphéricité des cellules à une résolution nanométrique, ainsi que la masse sèche et la densité). En décomposant systématiquement les riches détails unicellulaires fournis par la RS et la TPM, nous démontrons, de manière quantitative, l’avantage d’une telle méthode de microscopie multimodale pour le phénotypage des cellules tumorales du cancer du sein. Nos outils fournissent également des informations subcellulaires supplémentaires sans utiliser d’étiquettes. Enfin, nous étudions et discutons toute information unique ou corrélée que présentent les ensembles de données dérivés de RS et de TPM. Nous pensons que nos outils et nos pipelines d’analyse de données quantitatives peuvent révolutionner les tâches de phénotypage dans la recherche biomédicale lorsqu’il s’agit d’une méthode rapide et non perturbative sur des cellules vivantes en culture, avec un potentiel d’application future dans des applications cliniques et diagnostiques.

Introduction

La caractérisation cellulaire et le phénotypage sont des aspects essentiels de la recherche biomédicale1. Être capable de caractériser les cellules aux niveaux morphologique et moléculaire est primordial pour comprendre la fonction, la différenciation et la pathologie cellulaires 1,2,3. Il est particulièrement intéressant dans le domaine de l’oncologie, où un profilage cellulaire précis est nécessaire pour le diagnostic des tumeurs, la détermination du stade de la maladie et, en fin de compte, l’identification de cibles thérapeutiques2. Les méthodes traditionnelles de caractérisation cellulaire ne peuvent pas fournir de dynamique temporelle et sont généralement basées sur des techniques invasives, telles que la coloration ou le marquage, qui peuvent interférer avec l’état natif des cellules et introduire des biais potentiels dans les données4. Par conséquent, les stratégies non invasives visant à fournir un phénotypage précis et approfondi des cellules vivantes, dans leur état natif et non perturbé, sont de plus en plus demandées.

Dans ce contexte, les méthodes d’imagerie multimodale sans marquage ont révolutionné la recherche en biologie cellulaire en combinant des modalités complémentaires pour capturer à la fois des informations morphologiques et moléculaires 2,5. Ces approches permettent la caractérisation intégrée et non invasive des cellules que les techniques traditionnelles individuelles ne sont pas toujours en mesure de fournir 2,5,6. Par exemple, bien que les techniques de microscopie telles que la microscopie à fluorescence aient été largement utilisées dans l’imagerie cellulaire morphologique et fonctionnelle, elles possèdent des limites inhérentes. Les méthodes de fluorescence souffrent souvent de photoblanchiment, de phototoxicité et de faibles quantités de molécules cibleables, ce qui limite le potentiel analytique4. De plus, ces approches nécessitent souvent l’utilisation de marqueurs ou de colorants exogènes, ce qui peut perturber l’état cellulaire natif ou conduire à des artefacts7.

Les plates-formes d’imagerie multimodales, qui combinent les forces de plusieurs modalités d’imagerie, dépassent ces limites en permettant l’acquisition de différents types de données à partir de cellules vivantes sans avoir besoin de marquage. L’intégration de la spectroscopie Raman (RS) avec d’autres modalités d’imagerie comme la microscopie à contraste de phase ou la microscopie de phase tomographique (TPM) a été une stratégie prometteuse pour surmonter les limites des techniques uniques. En effet, l’imagerie multimodale permet une compréhension plus approfondie des phénotypes cellulaires, en particulier dans des conditions biologiques complexes et des pathologies comme le cancer, où les propriétés moléculaires et structurelles sont cruciales pour une caractérisation précise 2,5.

Le RS sans marquage est bien adapté à l’imagerie chimique des cellules8. En détectant les modes vibratoires moléculaires, la RS fournit des empreintes biochimiques qui peuvent révéler des informations approfondies sur la composition moléculaire des cellules 9,10,11. Les spectres Raman acquis à partir d’échantillons biologiques contiennent des informations sur une variété de biomolécules telles que les lipides, les protéines, les acides nucléiques et les métabolites, qui jouent un rôle essentiel dans la compréhension de la nature moléculaire des cellules 9,12. L’une des principales forces de la RS est qu’elle est non invasive, ce qui permet de caractériser les cellules vivantes dans leur état naturel sans altérer leur état physiologique.

Malgré ses nombreux avantages, la RS présente également certaines limites. En effet, bien que la RS fournisse des informations moléculaires détaillées, elle ne permet pas d’obtenir des informations quantitatives sur la morphologie ou la structure des cellules2. C’est là que les techniques d’imagerie complémentaires comme la TPM jouent un rôle crucial.

La MPT est une forme d’imagerie de phase quantitative (QPI)13,14, qui permet de visualiser des informations quantitatives à haute résolution et sans marquage sur la morphologie cellulaire15,16. La TPM diffère des techniques de microscopie traditionnelles en ce qu’elle ne nécessite pas d’agents de contraste ; au lieu de cela, il fonctionne en mesurant les déphasages résultant des variations de l’indice de réfraction (IR) de l’échantillon17. Les déphasages fournissent des informations sur les propriétés structurelles de la cellule, notamment son volume, sa surface, sa forme et sa structure interne 2,18. La MPT peut atteindre une haute résolution spatiale, au niveau nanométrique, et constitue donc une technique idéale pour enregistrer les détails morphologiques à haute résolution des cellules vivantes. De plus, la possibilité de reconstruire des tomogrammes IR 3D permet de visualiser les structures subcellulaires dans leur environnement vivo18, fournissant des informations plus précises par rapport aux projections 2D. Cependant, l’une des principales limites de la TPM est son manque de spécificité chimique, car elle fournit principalement des informations sur la morphologie et la distribution de phase de la cellule, sans être capable de différencier les composants chimiques distincts ou d’identifier les caractéristiques biochimiques.

La combinaison de la RS et de la TPM dans une technique multimodale offre des avantages dans le phénotypage cellulaire. Alors que la spectrométrie de fréquence permet d’obtenir des informations moléculaires riches, la MPT ajoute un aspect structurel, permettant d’analyser la morphologie cellulaire de manière très détaillée. Récemment, la combinaison de la RS avec la TPM a été démontrée avec succès dans plusieurs études axées sur la recherche sur le cancer 2,19,20. Par exemple, des travaux antérieurs ont montré que le co-enregistrement de la spectroscopie Raman avec des données de microscopie de phase holographique peut fournir des informations moléculaires et morphologiques complémentaires, permettant de distinguer les différents types de cellules et les stades de développement tumoral2. Ces recherches ont mis en évidence la puissance de l’imagerie multimodale pour améliorer la précision du phénotypage cellulaire, en particulier dans le contexte du cancer, où les caractéristiques moléculaires et structurelles des cellules sont étroitement liées à leur malignité et à leur comportement 2,20.

Malgré les progrès récents de l’imagerie multimodale, des défis restent à relever, notamment dans le traitement et l’analyse des données21. Les grandes quantités de données produites par les techniques d’imagerie multimodale peuvent être lourdes à analyser, et des procédures simples doivent être utilisées pour extraire des informations significatives. Pour relever ce défi, des pipelines de traitement des données conviviaux doivent être mis en place pour gérer la complexité des données et minimiser les biais humains dans l’analyse. De tels pipelines sont essentiels pour atteindre l’exactitude et la reproductibilité des résultats et pour la traduction éventuelle de ces approches en applications cliniques et diagnostiques.

L’objectif de ce travail est d’illustrer le potentiel de la fusion de la RS avec la TPM pour le phénotypage sans marquage, à grande vitesse et non perturbatif de cellules cancéreuses uniques vivantes. En fusionnant ces deux approches d’imagerie robustes, nous fournissons une caractérisation complète et quantitative des propriétés moléculaires et morphologiques des cellules cancéreuses du sein humain (MDA-MB-231). Les travaux soulignent également l’importance d’établir des pipelines de traitement des données exempts de biais humains pour s’assurer que les informations extraites des ensembles de données multimodaux sont correctes et fiables. Ici, nous cherchons à établir une plate-forme robuste pour le phénotypage des cellules cancéreuses qui peut être généralisée à d’autres types de cellules. La polyvalence et la sensibilité de cette approche en font un candidat potentiel pour un large éventail d’applications biomédicales, des études fondamentales de biologie cellulaire au diagnostic.

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Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. Ensemencez les cellules MDA-MB-231 dans des boîtes de Pétri en quartz.
    1. Plaquez les cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 sur des boîtes de Pétri à fond en verre de quartz de 3,5 cm.
    2. Incuber les cellules à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles soient complètement fixées à la surface (au moins 12 h après l’ensemencement).
  2. Lavez les cellules et préparez-les pour la mesure.
    1. Retirez le milieu de culture des cellules une fois qu’elles ont adhéré à la boîte de Pétri.
    2. Lavez doucement les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu résiduel.
    3. Ajoutez un milieu de culture cellulaire frais et gardez les cellules recouvertes du milieu tout au long de la procédure de mesure pour assurer leur viabilité.
      REMARQUE : Comme milieu de culture, cette étude a utilisé du DMEM/F-12 sans rouge de phénol complété par 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de pénicilline (100 UI/mL)-streptomycine (100 μg/mL).

2. Système de microscope Raman à haut débit

REMARQUE : Les détails techniques du microscope Raman de fabrication artisanale utilisé pour les travaux actuels concernant l’imagerie de cellules vivantes de cellules MDA-MB-231 ont été décrits précédemment22. En bref, le système de microscope Raman à haut débit construit sur mesure est doté d’un laser Ti-Sapphire de 785 nm pompé par un laser de 532 nm (Figure 1A). Le laser d’excitation Raman de 785 nm est couplé à un corps de microscope à fluorescence IX83 inversé, l’excitation étant dirigée vers l’échantillon à travers un objectif d’immersion dans l’eau de UPLSAPO60× 1,2 NA à l’aide d’un miroir dichroïque de 749 nm. Un polariseur ajuste la puissance laser moyenne au niveau de l’orifice arrière du microscope. L’imagerie en fond clair est rendue possible par le couplage de la lumière blanche de la même manière. Le système bascule entre les modes Raman et fond clair en changeant automatiquement les filtres dichroïques. Le système combine un balayage galvo-miroir et un balayage par étapes pour l’imagerie à haut débit. Un script MATLAB personnalisé interagit avec un logiciel de contrôle de microscope open source, une carte d’acquisition de données (DAQ) et des systèmes de détection de signaux pour automatiser le processus d’acquisition de données. La lumière Raman rétrodiffusée est collectée par le même objectif, tandis que la lumière visible est filtrée par un miroir dichroïque de 785 nm et dirigée vers un spectrographe proche et un détecteur CCD. Cette configuration permet l’imagerie multidimensionnelle, capturant les signaux en fond clair, en fluorescence et Raman sur différentes positions et piles z 2,22.

  1. Procédure d’imagerie Raman
    1. Préparation de l’échantillon et conservation des conditions physiologiques
      1. Installez l’échantillon dans l’incubateur sur scène pour maintenir les conditions physiologiques. Assurez-vous que l’incubateur est réglé à 37 °C, avec une régulation en retour d’information en temps réel pour le contrôle de la température.
      2. Maintenez le taux d’humidité à l’intérieur de la chambre à >95 % à l’aide de l’unité de bain périphérique interne remplie d’eau distillée. Configurez le régulateur de gaz CO2 pour qu’il mélange 5 % de CO2 avec 95 % d’air et l’alimente dans la chambre d’incubation.
    2. Gestion automatisée de l’immersion dans l’eau
      1. Allumez l’alimentateur automatique à immersion dans l’eau fait maison pour fournir de l’eau à la lentille de l’objectif à un débit de 2 μL/min à l’aide de pousse-seringues et d’aiguilles de seringue collées à l’extrémité de l’objectif.
      2. Vérifiez régulièrement les niveaux d’eau pour éviter l’évaporation et assurer des conditions d’imagerie constantes tout au long des mesures.
    3. Acquisition des données de spectroscopie Raman
      1. Allumez le laser de la pompe et ajustez sa puissance pour atteindre une puissance laser de 75 mW au niveau du plan d’échantillonnage.
      2. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope open source Micro-manager. Dans les paramètres de configuration, sélectionnez BF et cliquez sur En direct sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel afin de visualiser l’image en fond clair. Sélectionnez la cellule unique à partir de laquelle le spectre Raman sera acquis. Cliquez ensuite sur Arrêter pour mettre fin à la visualisation en fond clair.
      3. Définissez la coordonnée Z du plan d’imagerie Raman en maximisant le nombre de signaux sur la caméra CCD.
      4. Pour ce faire, ouvrez le logiciel de contrôle de la caméra CCD (LightField) ; dans le réglage de l’expérience, réglez le temps d’exposition sur 1,5 s. Ensuite, cliquez sur Exécuter dans la barre d’outils Expérience et activez le faisceau laser.
      5. Ensuite, ajustez la position Z pour maximiser le nombre de signaux dans la région des empreintes digitales de 600 cm-1 à 1800 cm-1 afin d’optimiser la visualisation des pics Raman associés aux signatures biologiques. Éteignez ensuite le laser et cliquez sur Arrêter dans la barre d’expérience du logiciel de la caméra CCD, puis quittez le logiciel.
        REMARQUE : Il a été observé que le nombre maximal de signaux Raman sur la caméra CCD correspondait à la position le long de l’axe Z, coïncidant avec +8 μm par rapport au plan d’imagerie, ne montrant aucune trace de pics Raman liés à la cellule, en raison d’une tache focale tombant assez à l’intérieur du quartz. Cette valeur peut varier en fonction du type de cellule et de son état.
    4. Démarrez le processus d’acquisition de données à l’aide du script MATLAB, qui gérera automatiquement les canaux Raman dans les mesures multidimensionnelles et sauvegardera les données Raman hyperspectrales.
    5. Réglez le champ de vision sur 50 × 50 μm2, 40 × 40 pixels, chaque zone de pixel correspondant à 1,25 × 1,25 μm2. Réglez le temps d’exposition pour chaque spectre Raman sur 1,5 s.
      REMARQUE : Effectuez régulièrement l’étalonnage du nombre d’onde à l’aide d’échantillons d’acétamidophénol pour annoter les pics Raman connus. Calibrez l’axe de décalage Raman par interpolation quadratique.
      ATTENTION : Manipulez les lasers avec précaution. Utilisez toujours des lunettes de protection appropriées adaptées à la longueur d’onde du laser lors de la configuration et du fonctionnement.

3. Analyse des données RS

  1. Post-traitement des cartes hyperspectrales Raman via l’outil Web RamApp (https://ramapp.io/) :
    1. Connectez-vous à l’outil Web.
    2. Importez les données hyperspectrales. Dans l’onglet Mes analyses , cliquez sur Nouveau et téléchargez le fichier .mat, contenant la variable de données spatiales et spectrales et la variable de l’axe des x (c’est-à-dire les valeurs de décalage Raman).
    3. Pour tronquer le spectre à la ou aux régions spécifiées dans le décalage Raman, dans le menu déroulant Recadrer et pivoter , cliquez sur Recadrage spectral et définissez la bordure inférieure et la bordure supérieure de la région de décalage Raman égales à 600 cm-1 et 1800 cm-1, respectivement.
      REMARQUE : En effectuant cette troncature spectrale, le pic large et de haute amplitude lié au matériau quartzifère de la boîte de Pétri est exclu de l’analyse.
    4. Pour corriger les spectres Raman pour les rayons cosmiques, dans les options de bruitage, cliquez sur Despike, sélectionnez Z-score comme méthode et réglez le seuil égal à 8.
      REMARQUE : La fonction de prétraitement Despike permet de résoudre le problème des pixels contenant des pics dans leur signal, qui résultent de rayons cosmiques.
    5. Cochez l’option Utiliser la première différence pour trouver les valeurs aberrantes à l’aide de la première différence discrète d’intensités le long du spectre, et cochez l’option Corriger les pointes. Le spectre de chaque pixel défectueux sera remplacé par le spectre médian de ses pixels voisins.
    6. Cliquez sur Exécuter pour corriger les pics.
    7. Pour supprimer le bruit des cartes correspondant à chaque numéro d’onde, dans les options de bruitage , cliquez sur Carte lisse, sélectionnez le filtre Médiane et définissez la taille du côté du carré qui est prise en compte lors de l’application du filtre sur chaque pixel de la carte égale à 3 pixels. Cliquez ensuite sur Exécuter.
    8. Pour appliquer un filtre afin de lisser le spectre de chaque pixel, cliquez sur Lisser le spectre dans les sélections de bruitage . Sélectionnez le filtre Savitzky-Golay comme méthode et définissez la longueur de la fenêtre de filtre égale à 7 et l’ordre polynomial du filtre égal à 2. Cliquez ensuite sur Exécuter.
      REMARQUE : Un filtre Savitzky-Golay nécessite de spécifier la longueur de la fenêtre de filtre (un entier impair positif) et l’ordre du polynôme.
    9. Pour supprimer le signal d’arrière-plan moyen du premier plan, ouvrez le panneau Retrait du substrat optique et cliquez sur Identifier le substrat. Définissez les k-moyennes comme méthode et le nombre de clusters égal à 2.
      REMARQUE : Cette fonction segmente les cellules (le « premier plan ») et leur substrat à l’aide d’une approche de regroupement. Vous pourrez alors supprimer le signal d’arrière-plan moyen du premier plan ou restreindre certaines étapes pour ne travailler que sur les pixels de premier plan. Le nombre de grappes à sélectionner peut varier en fonction de l’échantillon spécifique.
    10. Dans les options avancées, cochez la case Nettoyage morphologique pour supprimer certaines petites taches du premier plan (par exemple, des parties de cellules parasites, etc.). Cliquez ensuite sur Exécuter.
    11. Dans le panneau Retrait du substrat optique , pour soustraire le signal de fond moyen, cliquez sur Supprimer le substrat, puis sélectionnez Moyenne globale (moyenne des 95 % des valeurs centrales) et cliquez sur Exécuter.
      REMARQUE : Les moyennes K sont généralement plus rapides, bien que non déterministes (cependant, puisque la graine aléatoire est fixe, le même résultat sera obtenu à chaque exécution, toutes choses étant égales par ailleurs). Le nombre de clusters peut être augmenté au-delà de 2 si certaines parties du premier plan sont toujours reconnues comme arrière-plan. Le cluster avec le signal moyen le plus bas est défini comme l’arrière-plan.
    12. Pour corriger la fluorescence de base, ouvrez le panneau Ligne de base et cliquez sur Corriger la ligne de base. Sélectionnez asPLS (Adaptive Smoothness PLS) et réglez λ égal à 5000000. Cliquez ensuite sur Exécuter.
      REMARQUE : Il existe 7 méthodes disponibles qui peuvent être sélectionnées, dont 5 sont basées sur les moindres carrés pénalisés (PLS). Dans ces méthodes PLS, un paramètre de lissage (λ) est nécessaire. Une valeur plus élevée de λ se traduira par des lignes de base plus lisses.
    13. Pour normaliser chaque carte hyperspectrale Raman en la divisant par sa norme Frobenius, cliquez sur Divers et sélectionnez l’option Normaliser . Ensuite, sélectionnez Frobenius comme méthode, puis cliquez sur Exécuter.
      REMARQUE : La norme Frobenius est utilisée pour normaliser l’ensemble de la matrice de données.
    14. Pour obtenir une image en fausses couleurs illustrant la distribution spatiale d’un composant subcellulaire, dans le panneau Images sur le côté droit, sur l’image d’intensité, cliquez sur le symbole du menu Ouvrir . Cliquez ensuite sur l’option Modifier l’image pour ouvrir le panneau d’édition.
    15. Dans le panneau d’édition, sélectionnez Bande unique, puis définissez la plage spectrale (par exemple, 715−725 cm-1 pour le cytoplasme). Sélectionnez Couleur double dans la palette de couleurs, définissez la couleur, le seuil d’intensité et l’opacité, puis cliquez sur Confirmer.
    16. Pour télécharger un spectre ponctuel, cliquez sur le pixel d’intérêt sur l’image pour le sélectionner. Ensuite, dans le panneau Légende spectrale , dans la section Curseur , cliquez sur Télécharger le spectre. Répétez la même procédure pour différents composants subcellulaires.
    17. Pour exporter les spectres Raman de premier plan et de substrat, dans le panneau Légende spectrale , dans la section Identification du substrat , cliquez sur Télécharger le spectre pour les sections Premier plan et Substrat .
      REMARQUE : Dans le protocole précédemment décrit pour l’analyse des données RS, des étapes de prétraitement et une analyse univariée ont été décrites pour générer des images en fausses couleurs illustrant la distribution spatiale des composants subcellulaires clés, les spectres d’intensité Raman à la fois de l’avant-plan et du substrat, et les spectres ponctuels des structures subcellulaires. Alors que l’analyse en aval est souvent adaptée à la question biologique spécifique, cette étude met maintenant en évidence des méthodes multivariées et de classification représentatives accessibles via la section d’analyse cartographique de l’outil Web utilisé. Il s’agit notamment de l’analyse de clusters, de l’analyse en composantes principales (PCA), de la résolution de courbe multivariée (MCR), DU N-FINDR et de l’ajustement spectral. L’ajustement spectral permet de quantifier et de comparer les caractéristiques spectrales à l’aide d’approches basées sur la distance, telles que le coefficient de corrélation de Pearson ou le mappeur d’angle spectral. L’analyse de cluster peut être effectuée à l’aide d’algorithmes tels que les k-moyennes, les k-moyennes mini-batch ou le clustering agglomératif hiérarchique, facilitant la segmentation des données hyperspectrales en fonction de la similarité spectrale. L’ACP peut être appliquée pour réduire la dimensionnalité des données et mettre en évidence les modèles de variance, tandis que la MCR permet la décomposition de signaux mixtes en spectres de composants purs. L’algorithme N-FINDR aide à extraire les spectres des membres finaux en appliquant d’abord l’ACP pour réduire la dimensionnalité, ce qui le rend particulièrement adapté aux ensembles de données hyperspectrales. Ces outils fournissent un cadre solide pour l’exploration en aval des modèles biologiques codés dans les données spectrales Raman.

4. Protocole de mesure TPM

  1. Préparez la configuration du microscope.
    1. Placez une goutte d’eau distillée sur la lentille de l’objectif du microscope. Positionnez l’échantillon sur la platine de translation du microscope. Ajustez la position de l’échantillon pour l’aligner sur l’objectif de l’objectif.
  2. Alignez les lentilles de l’objectif et du condenseur.
    1. Allumez le microscope et lancez le logiciel d’imagerie TomoStudio. Cliquez sur l’icône du microscope dans la barre d’outils. Après l’initialisation, cliquez sur Configuration. Sélectionnez LiveCell dans le panneau Job et PBS comme support.
      REMARQUE : La valeur IR dans le panneau Medium est automatiquement définie sur 1,337 lorsque PBS est sélectionné comme medium.
    2. Accédez à l’onglet Étalonnage dans le panneau de configuration du logiciel d’imagerie. Réglez les positions axiales de l’objectif et du condenseur en sélectionnant Focus et Surface, respectivement.
    3. Cliquez sur Mode de balayage pour régler manuellement les objectifs, en vous assurant que les motifs d’éclairage sont concentrés au centre du champ de vision et apparaissent presque immobiles.
  3. Localisez l’échantillon.
    1. Cliquez sur Mode normal et ajustez l’étape de traduction pour positionner la cellule dans le champ de vision. Faites la mise au point sur l’échantillon en ajustant la position axiale de la lentille de l’objectif jusqu’à ce que la limite de l’échantillon devienne presque invisible à l’écran.
    2. Ajustez l’étape de translation pour localiser une région sans cellules, garantissant ainsi une vue dégagée.
  4. Calibrez le système.
    1. Sélectionnez Calibrer dans le logiciel d’imagerie pour capturer plusieurs hologrammes 2D à différents angles d’éclairage.
  5. Acquérir le tomogramme 3D RI.
    1. Ajustez l’étape de translation pour centrer la cellule dans le champ de vision. Accédez à l’onglet Acquisition et sélectionnez Instantané 3D pour capturer le tomogramme de la cellule.
      REMARQUE : Le temps d’acquisition d’un tomogramme 3D RI d’une seule cellule est significativement plus court (de l’ordre de quelques secondes), par rapport au temps d’acquisition requis par les données RS ; par conséquent, l’adoption d’un incubateur sur scène pour la TPM n’est généralement pas nécessaire. Cependant, si des mesures doivent être effectuées sur un grand nombre de cellules, ou dans des conditions spécifiques, des chambres d’incubation commerciales dédiées fournissant des conditions physiologiques sont disponibles et peuvent être intégrées dans le système TPM.

5. Analyse des données TPM

  1. Post-traitement des cartes TPM à l’aide du logiciel TomoStudio.
    1. Pour visualiser les tomogrammes holographiques, sélectionnez les données dans le panneau de navigation des données , cliquez avec le bouton droit sur les données, puis cliquez sur Ouvrir. L’onglet Recherche s’ouvrira automatiquement pour une analyse plus approfondie. Dans le panneau Data Manager , cliquez sur Tomogramme RI.
    2. Dans le panneau Visualisation du volume , sélectionnez RI et dessinez quatre zones de couleur rectangulaires dans le canevas RI.
      REMARQUE : Chaque boîte de couleur permet d’associer, sur le tomogramme affiché sur le panneau d’affichage , une couleur spécifique aux composants de cellule caractérisés par la plage RI identifiée par la boîte dans le canevas RI. Après avoir dessiné chaque zone de couleur, les informations associées apparaissent automatiquement dans le tableau sous le canevas de l’instance réservée.
    3. Dans le panneau situé sous le canevas de l’IR, définissez les valeurs minimale et maximale de la plage d’IR pour chaque zone de couleur (c’est-à-dire, première zone de couleur : MinRI = 1,3450 et MaxRI = 1,3499, deuxième zone de couleur : MinRI = 1,3506 et MaxRI = 1,3571, troisième zone de couleur : MinRI = 1,3586 et MaxRI = 1,3650, quatrième zone de couleur : MinRI = 1,3688 et MaxRI = 1,3866). Associez une valeur d’opacité et une couleur (en double-cliquant sur chaque case et en sélectionnant une couleur) à chaque case. Cela permet de visualiser les tomogrammes selon les distributions 3D RI.
    4. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les plages d’instances réservées et les zones de couleur définies.
      REMARQUE : Les plages d’IR doivent être ajustées en fonction des échantillons spécifiques.
    5. Pour obtenir des descripteurs quantitatifs de la morphologie cellulaire (c’est-à-dire le volume [V], la surface [S], la surface projetée [A], l’AR moyen, la densité [D], la masse sèche [DM] et la sphéricité [Φ]), utilisez l’interface d’analyse .
      REMARQUE : Vous trouverez des détails sur le calcul théorique des paramètres quantitatifs ici 2,23.
      1. Dans la barre d’outils, cliquez sur Analyse. Dans le panneau Analyse à droite, sélectionnez Manuel dans le panneau Segmentation et définissez 1,3450 comme seuil d’IR. Cliquez ensuite sur Appliquer.
        REMARQUE : Assurez-vous que les valeurs de l’IR (fl/pg) et de l’IR de référence sont respectivement de 0,19 (l’augmentation de la réfraction, qui a été largement établie par les enquêtes précédentes24) et de 1,3370 (IR du PBS utilisé pour l’étalonnage de l’IR du bruit de fond PBS). Le logiciel d’imagerie effectue une segmentation volumétrique de la cellule cible en fonction du seuil RI défini et calcule les indices morphologiques (V, S, A, RI MOYEN, D, DM et Φ) et les rapporte dans un tableau de sortie dans le panneau Mesure .
      2. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les indices morphologiques calculés.
        REMARQUE : En plus du logiciel utilisé, plusieurs outils open source peuvent être utilisés pour quantifier les traits morphologiques à partir des données TPM. CellProfiler (https://cellprofiler.org/) fournit des outils d’analyse d’images, y compris la segmentation et l’extraction de caractéristiques, qui sont compatibles avec les images à contraste de phase. Fiji (https://fiji.sc/) est un logiciel open-source avec des plugins pour la segmentation et le calcul de paramètres morphologiques25. Napari (https://napari.org/) est une visionneuse d’images multidimensionnelle prenant en charge l’intégration de modèles d’apprentissage automatique pour la segmentation et l’analyse. Ilastik (https://www.ilastik.org/) propose des outils de segmentation basés sur l’apprentissage automatique, et DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) intègre des modèles d’apprentissage profond à ImageJ/Fiji pour une analyse avancée. Par ailleurs, MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) fournit des outils pour les opérations morphologiques 2D et 3D aux Fidji. Cellpose326 est un autre outil basé sur l’apprentissage profond pour la segmentation cellulaire qui peut être appliqué à l’imagerie par contraste de phase.

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Résultats

Nous avons décrit un flux de travail pour la caractérisation morphochimique sans marquage de cellules vivantes basée sur la RS confocale et la TPM. Nous avons testé la capacité du flux de travail proposé à atteindre la composition moléculaire et les paramètres morphologiques de la lignée cellulaire du cancer du sein humain MDA-MB-231 (Figure 1).

Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées sur des boîtes de Pétri à fond de verre de quartz. Un microscope Raman confo...

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Discussion

Nous avons présenté une approche multimodale et un pipeline d’analyse simple intégrant deux techniques d’imagerie avancées sans étiquette : RS et TPM. Le flux de travail décrit a permis un phénotypage morphochimique rapide et non invasif de cellules uniques vivantes de cancer du sein humain (MDA-MB-231) sans qu’il soit nécessaire de procéder à un marquage externe.

La RS est une technique non destructive qui permet de caractériser la composition biochimique d’é...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Progetto Rocca de la fondation MIT-Italie, des subventions NIH (P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon (Séoul, Corée du Sud) et le National Cancer Center, Corée (NCC-24H1170). Leonardo Bianchi a reçu une bourse postdoctorale Progetto Rocca pour mener des recherches collaboratives au Massachusetts Institute of Technology et au Politecnico di Milano.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Caméra CCDPrinceton InstrumentsPIXIS 100BR eXcelonDétecteur de signal de diffusion Raman.
Logiciel de contrôle de caméra CCDPrinceton InstrumentsChamp de lumière
Laser Ti-Sapphire à ondes continues (longueur d’onde : 785 nm)Spectra-Physique3900 SIl est utilisé pour l’excitation par microscopie Raman.
Miroir dichroïqueThorLabsDMSP750BMiroir dichroïque de 749 nm, dévie l’excitation Raman de 785 nm vers l’échantillon, filtre les signaux de fluorescence et de fond clair.
Sérum fœtal bovinThermo Fisher ScientificA5256701
Corps du microscope à fluorescenceOlympeIX83
Laser (longueur d’onde : 532 nm)Spectra-PhysiqueMillénaires eVLaser à pompe pour système laser Ti-Sapphire de 785 nm.
Logiciel MATLABMathWorks2023a
Lignée cellulaire MDA-MB-231ATCCHTB-26
Spectrographe NIRAndrorHolospec HS-HSG-785-LFIl est utilisé pour l’analyse spectrale de la lumière rétrodiffusée.
Lentille d’objectif (60× ; 1,2 NA immersion dans l’eau)OlympeUPLSAPO60&Times ;
Chambre d’incubation sur scèneTokai Hitstxg-welsx-set
Logiciel de contrôle de microscope open sourceet micro ; GérantMicro-Manager-2.0
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Sans phénol DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21041025
Solution saline tamponnée au phosphateGibco10-010-023
Boîtes de Pétri à fond en verre de quartzWaken B TechSF-S-D12
Logiciel d’analyse de données RamanRamAppOutil Web pour le traitement des données hyperspectrales Raman.
Caméra sCMOSPhotonique HamamatsuOrca Flash 4.0 v2
Pousse-seringueChemyxFusion 720
Microscope de phase tomographiqueTomocube, Inc.HT-2HSystème commercial d’obtention d’images de phase quantitatives.
Logiciel d’analyse de données TPMTomocube, Inc.TomoStudioLogiciel utilisé pour l’analyse des données de microscopie de phase tomographique (TPM).

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