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Article de méthode

Étude des effets de la thérapie infrarouge sur les os après un entraînement intensif sur tapis roulant

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DOI :

10.3791/68502

22 août 2025

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’entraînement prolongé sur tapis roulant de haute intensité inhibe la formation osseuse et favorise la résorption osseuse chez la souris, ce qui entraîne une diminution de la masse osseuse. Ici, nous présentons un protocole pour examiner les effets de la thérapie infrarouge sur les altérations du métabolisme osseux induites par l’exercice de haute intensité. D’autres études mécanistes sont nécessaires pour élucider les voies moléculaires sous-jacentes.

Résumé

Le tissu osseux est un organe porteur important du corps humain. L’exercice modéré augmente la masse osseuse grâce à une charge mécanique, tandis que l’exercice de haute intensité peut la supprimer. La thérapie infrarouge améliore la circulation, réduit la douleur/l’inflammation et aide à la réparation des tissus. Cet article présente un protocole pour élucider les effets modulateurs de la thérapie infrarouge sur les troubles métaboliques squelettiques induits par l’exercice de haute intensité et leurs mécanismes moléculaires. Dans cette étude, 24 souris âgées de 6 semaines ont été divisées au hasard en groupes témoins (CTR, N = 8), entraînement sur tapis roulant à haute intensité (HIT, N = 8) et thérapie infrarouge après un exercice sur tapis roulant à haute intensité (IRT, N = 8). Les deux derniers groupes ont été entraînés pendant 8 semaines. Au cours de la première semaine, les souris ont subi un entraînement d’acclimatation sur tapis roulant. Au cours de la deuxième semaine, les souris se sont exercées à la vitesse de 24 m/min pendant 50 min, qui a augmenté à la vitesse de 1 m/min et 10 min chaque semaine jusqu’à ce qu’elle atteigne 28 m/min pendant 80 min, avec une pente de 5° pendant 6 jours. À la cinquième semaine, les souris du groupe HIT ont été soumises à une intervention de thérapie infrarouge du corps entier, avec une température contrôlée entre 42 °C et 45 °C. L’ensemble du processus de traitement a duré ~40 min, 3 fois par semaine. Les résultats ont montré que dans le groupe HIT par rapport à ceux du groupe CTR, le volume osseux/volume total et le nombre trabéculaire étaient significativement diminués, la séparation trabéculaire était significativement augmentée, les gènes liés à l’ostéogénie d’Atf4, Runx2 et Ocn étaient régulés à la baisse, et les gènes liés aux ostéoclastes de Ctsk et Mmp9 ont été réglementés à la hausse. Les résultats de la micro-tomodensitométrie des souris du groupe IRT n’ont montré aucune différence significative, mais les gènes liés à l’ostéogenèse Alp, Atf4, Runx2, Ocn et Osx ont été régulés à la hausse dans le fémur. De plus, le gène Ctsk , apparenté à l’ostéoclaste, a été régulé à la baisse. L’exercice à long terme sur tapis roulant de haute intensité peut réduire la masse osseuse. Bien que la thérapie infrarouge n’affecte pas la densité minérale osseuse, elle peut améliorer le métabolisme osseux.

Introduction

L’ostéoporose (OP) est l’une des maladies osseuses métaboliques systémiques les plus courantes, particulièrement répandue chez les personnes âgées, et représente un problème majeur de santé mondiale1. L’OP se caractérise principalement par une diminution de la densité minérale osseuse (DMO), de la qualité des os et de la solidité des os, ce qui augmente le risque de fractures osseuses2. La prévention et le traitement de la PO sont cruciaux pour améliorer la qualité de vie humaine, englobant des approches telles que la thérapie pharmacologique, un apport adéquat en calcium et en vitamine D, la réduction du tabagisme et de la consommation d’alcool et l’exercice physique précoce pour augmenter et maintenir le niveau maximal de masse osseuse 3,4.

L’os, en tant que structure structurelle du corps, fournit une forme fondamentale et protège les organes internes. Sous la régulation du système nerveux, l’os facilite divers mouvements lors des contractions musculaires. Tout au long de la vie, l’os subit une formation, une résorption et un remodelage continus. Les ostéoclastes résorbent continuellement les vieux os, tandis que les ostéoblastes forment et minéralisent de nouveaux os. Ces processus sont étroitement couplés et mutuellement régulés, ce qui maintient un équilibre dynamique dans le renouvellement osseux5. De nombreuses études ont montré qu’un exercice physique approprié (comme l’exercice aérobique et l’entraînement en résistance) peut prévenir et traiter efficacement l’OP6. L’exercice influence le métabolisme osseux en modulant le stress mécanique sur le squelette (tel que l’impact au sol, le choc et la tension du site d’attache musculaire) et les facteurs biochimiques de la circulation sanguine (tels que les hormones et les cytokines), favorisant ainsi la santé des os7. Cependant, un exercice prolongé de haute intensité peut affecter négativement la santé des os, entraînant une perte osseuse. Par exemple, après 8 semaines de course sur tapis roulant à des intensités élevées, modérées et faibles (à une vitesse de 15 m/min) dans un modèle murin de blessure à la coiffe des rotateurs, le volume osseux/volume total (BV/TV), le nombre trabéculaire (Tb.N) et l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th) étaient les plus faibles dans le groupe de haute intensité par rapport à ceux des groupes témoins et d’intensité modérée/faible, tandis que la séparation trabéculaire (Tb.Sp) était la plus élevée. Cette découverte suggère que l’entraînement à haute intensité a des effets néfastes sur la récupération de la coiffe des rotateurs et la masse osseuse8.

La thérapie infrarouge (IRT) est l’un des principes les plus largement utilisés dans les appareils de physiothérapie de réadaptation en Chine. Il favorise la circulation sanguine locale, accélère l’absorption des substances inflammatoires et améliore l’apport de nutriments 9,10. En tant que thérapie physique non invasive, l’IRT a suscité une grande attention dans les domaines de la médecine sportive, des sciences de la réadaptation et de la recherche sur le métabolisme osseux ces dernières années. L’IRT est plus couramment utilisée en milieu clinique que d’autres interventions. Des études ont montré que la cicatrisation du tissu osseux est un processus complexe, comprenant la résolution de l’inflammation et la régénération cellulaire, qui peuvent être divisées en trois étapes : l’inflammation, la prolifération et le remodelage. La phase inflammatoire est principalement caractérisée par l’angiogenèse ; la phase proliférative implique la prolifération des ostéoblastes et la formation de nouveaux os ; Et la phase de remodelage est marquée par l’augmentation progressive des trabécules nouvellement formées dans le cal, le cal du pont traversant l’espace de fracture subissant complètement une ossification11. Après une fracture, le sang qui circule des vaisseaux vers les tissus doit être rapidement absorbé, ce qui stimule la prolifération des ostéoblastes et la formation osseuse. Ces processus vitaux nécessitent un environnement interne favorable et suffisamment de nutriments pour le soutien. Un certain degré de thermothérapie peut faciliter efficacement ces fonctions12. Dans la pratique clinique, la thérapie infrarouge peut être utilisée comme moyen auxiliaire pour traiter l’ostéoporose et aider à soulager les symptômes associés, mais ses recherches sur la masse osseuse sont relativement limitées. Cet article présente un protocole pour élucider les effets modulateurs de la thérapie infrarouge sur les troubles métaboliques squelettiques induits par l’exercice de haute intensité et leurs mécanismes moléculaires. Par conséquent, ce travail, qui s’appuie sur des recherches antérieures13, construit un modèle d’exercice sur tapis roulant à haute intensité chez la souris pour observer les changements dans la masse osseuse et étudier plus en détail si la thermothérapie peut atténuer la perte osseuse induite par l’exercice sur tapis roulant à haute intensité. L’objectif est de fournir une référence pour la prévention et le traitement de la PO par l’exercice.

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Protocole

Cette étude a reçu l’approbation éthique du Comité d’éthique des animaux de laboratoire de l’Université du sport de Shanghai (n° 102772023DW016) et s’est conformée aux réglementations nationales/institutionnelles en matière de recherche sur les animaux. Vingt-quatre souris C57BL/6 mâles âgées de 5 semaines ont été hébergées dans une animalerie de qualité SPF à l’Université des sports de Shanghai. Les souris ont été logées à 22 ± 2 °C, à 40-70 % d’humidité avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures et ont reçu de la nourriture et de l’eau à volonté . Toutes les matières biologiques, y compris les os, le sang et les échantillons traités par réactif d’extraction d’ARN, doivent être recueillies dans des sacs autoclaves de niveau de risque biologique II, stérilisées à 121 °C pendant 60 minutes avant d’être éliminées, avec la documentation appropriée dans les registres des déchets de laboratoire.

1. Animaux

  1. Après 1 semaine d’acclimatation, stratifiez les souris en fonction de leur poids corporel et répartissez-les au hasard en trois groupes : les groupes témoin (groupe CTR, N = 8), l’entraînement sur tapis roulant à haute intensité (HIT, N = 8) et la thérapie infrarouge après un exercice sur tapis roulant à haute intensité (IRT, N = 8).

2. Entraînement d’exercice sur tapis roulant de haute intensité et protocole d’intervention de thermothérapie

  1. Alimentez le groupe CTR dans des conditions statiques sans intervention.
  2. Après 1 semaine d’acclimatation, soumettez les souris des groupes HIT et IRT à 8 semaines d’entraînement sur tapis roulant de haute intensité. La première semaine est considérée comme la phase d’adaptation : faites courir les souris du groupe sur tapis roulant à des vitesses de 12, 15 et 18 m/min pendant 20, 30 et 40 min, respectivement, avec une inclinaison de 0°. Au cours de la deuxième semaine, faites faire faire de l’exercice aux souris à raison de 24 m/min pendant 50 min, puis augmentez leur exercice à raison de 1 m/min et 10 min chaque semaine jusqu’à ce qu’il atteigne 28 m/min pendant 80 min, avec une pente de 5°. Effectuez ce programme d’exercice 6 jours par semaine, avec repos le dimanche (tableau 1).
  3. Pour le groupe IRT, après 4 semaines d’exercice sur tapis roulant, introduisez la thérapie infrarouge (IRT) au cours de la cinquième semaine.
    REMARQUE : Pendant l’irradiation infrarouge, maintenez strictement la température du corps de la souris entre 42 °C et 45 °C.
    1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale pour induire une perte de conscience.
    2. Irradiez tout le corps des souris à l’aide de l’appareil thérapeutique infrarouge, en veillant à ce que la température des souris soit maintenue entre 42 °C et 45 °C (détectée par un détecteur de température). Effectuez l’ensemble du processus de traitement pendant ~40 min, 3 fois par semaine (lundi, mercredi et samedi), pendant 4 semaines jusqu’à ce que les échantillons soient prélevés.

3. Prélèvement de tissus

REMARQUE : Les échantillons d’os de souris disséqués doivent être immédiatement conservés dans de l’azote liquide ou à -80 °C pour maintenir l’intégrité de l’ARN.

  1. Prélèvement et conservation d’échantillons de sérum
    1. Pesez toutes les souris à l’aide d’une balance électronique.
    2. Anesthésier les souris via une injection intrapéritonéale de tribromoéthanol.
      REMARQUE : Lors de la manipulation du tribromoéthanol, préparez toujours des solutions fraîches sous une hotte chimique tout en portant des gants en nitrile et des lunettes de protection, conservez-les à 4 °C dans des flacons ambrés protégés de la lumière et éliminez les portions non utilisées dans des canaux de déchets chimiques approuvés.
    3. Prélever des échantillons de sang de manière aseptique par ponction cardiaque pour obtenir 0,5 à 0,6 mL de sang. Tout d’abord, rasez les poils de la poitrine de la souris et désinfectez-les avec de l’iodophore. Par la suite, palpez le point de pulsation cardiaque maximale et insérez une aiguille de 4 à 5 G attachée à une seringue dans la cavité thoracique gauche entre le troisième et le quatrième espace intercostal. Enfin, lorsque le sang s’écoule spontanément dans la seringue, appliquez une aspiration douce pour terminer la procédure de prélèvement sanguin.
    4. Laissez les échantillons de sang coaguler pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifugez à 1 000 × g pendant 15 min. Aliquote et conserver le surnageant (sérum) à -80 °C.
  2. Prélèvement et conservation d’échantillons d’os
    1. Utilisez des micro-ciseaux stériles et une pince à épiler pour disséquer les fémurs et les tibias. Décollez doucement les muscles et les tendons de la surface de l’os le long de l’axe longitudinal, sans gratter le périoste, et portez une attention particulière à la protection de la plaque de croissance.
    2. Rincez tous les échantillons avec 1x PBS (pH 7,4). Fixez le fémur gauche dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 24 h. Utilisez le fémur gauche pour mesurer la densité minérale osseuse avant une analyse plus approfondie.
    3. Placez le fémur droit dans des tubes de microcentrifugation pré-étiquetés de 1,5 ml et conservez-le à -80 °C.
    4. Utilisez le fémur droit et les deux tibias pour les tests de métabolisme osseux.

4. Mesure des paramètres

  1. Mesure de la glycémie
    1. Avant le prélèvement de tissus, prélevez des échantillons de sang dans la veine de la queue des souris. Mesurez la glycémie à l’aide d’un analyseur de glucose portable.
  2. Mesure du taux de lactate dans le sang
    1. Immédiatement après la dernière séance d’exercice sur tapis roulant, prélevez des échantillons de sang dans la veine de la queue. Déterminez les taux de lactate dans le sang à l’aide d’un analyseur de lactate portable.
  3. Test du Rotarod
    REMARQUE : Une fois toutes les interventions terminées, nous avons effectué des tests de rotation sur des souris de chaque groupe. Lors de la réalisation de tests de rotation, nous choisissons différents groupes de souris à tester simultanément pour garantir un temps de repos constant, plutôt que de tester d’abord un groupe de souris, afin d’exclure les différences causées par le temps de repos.
    1. Placez les souris sur un appareil rotatif avec la tête orientée dans le sens opposé de la rotation, ce qui permet un essai d’adaptation.
    2. Réglez la vitesse de rotation à 30 tr/min ; Après le démarrage, l’appareil accélère uniformément jusqu’à la vitesse définie.
    3. Enregistrez le temps jusqu’à ce que la souris tombe pour la première fois. Utilisez cette mesure pour évaluer la capacité de coordination motrice des souris.
  4. Mesure de la masse osseuse trabéculaire fémorale
    1. Retirez les muscles et le tissu conjonctif attachés aux os à l’aide de micro-ciseaux stériles et de pinces et lavez-les avec du PBS.
    2. Effectuez une micro-tomodensitométrie pour évaluer les paramètres de l’os trabéculaire dans le fémur gauche à l’aide des paramètres de numérisation suivants : La micro-tomodensitométrie a été réalisée à 55 kVp/145 μA (8 W) en mode de rotation continue avec des voxels isotropes de 9 μm, un champ de vision de 31,0 mm, une exposition de 250 ms, une résolution native (388 couches/segment) et un étalonnage BH de 1 200 mgHA/cc.
    3. Mesurez les résultats suivants de la microarchitecture trabéculaire et corticale.
      1. Importez les images reconstruites dans CT-vox pour un rendu et une visualisation tridimensionnels (3D).
      2. À l’aide de vues multiplanaires (plans coronal, sagittal et transverse), séparez et extrayez l’os cortical et trabéculaire en régions tissulaires distinctes pour permettre une analyse indépendante de leurs caractéristiques morphométriques.
      3. Quantifiez les principaux paramètres microstructurels, notamment le volume osseux/volume total (BV/TV), le nombre trabéculaire (Tb.N) et l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), afin d’évaluer le développement osseux et l’état de minéralisation.
  5. Coupe en paraffine et coloration histologique
    1. Lavez trois fémurs gauches de chaque groupe avec du PBS et détartrez-les dans de l’EDTA à 10 % (pH 7,15) jusqu’à ce qu’une décalcification complète se produise.
    2. Déshydrater les échantillons à l’aide de concentrations graduées d’éthanol (70 %, 90 %, 95 % et 100 %), les éliminer avec du xylène, les infiltrer avec de la paraffine et les intégrer (voir le tableau 2).
    3. Découpez des sections en série de 5,0 μm d’épaisseur.
    4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)
      1. Soumettez d’abord les tranches au déparaffinage au xylène, à la réhydratation à l’éthanol par gradient, puis faites-les tremper dans de l’hématoxyline pendant 5 min.
      2. Laver pour enlever l’excès de tache, différencier avec de l’alcool à l’acide chlorhydrique à 1 % pendant 3 s, colorer avec de l’éosine pendant 3 min, déshydrater à l’éthanol gradué, effacer avec du xylène et monter avec de la gomme neutre (voir tableau 3).
      3. Capturez des images microscopiques pour observer la structure du tissu osseux ainsi que la morphologie et la distribution des cellules dans la cavité de la moelle osseuse.
    5. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)
      1. Daffinez les tranches avec du xylène et réhydratez-les avec de l’éthanol dégradé.
      2. Incuber les tranches avec le réactif TRAP dans un four à 37 °C pendant 1 h, les déshydrater et les rendre transparentes (voir tableau 4).
      3. Appliquez une goutte de résine neutre sur la lame de verre, puis abaissez soigneusement la lamelle à un angle de 45° par rapport à un bord pour minimiser la formation de bulles. Laissez la lame montée sécher complètement dans une hotte avant de procéder à l’observation microscopique et à l’imagerie.
  6. Analyse de l’expression génique dans le tissu osseux tibial
    1. Isolement de la moelle osseuse
      1. Disséquez les tibias de souris et retirez l’excès de muscle/fascia à l’aide d’outils stériles.
      2. Placez les tibias nettoyés dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
      3. Ouvrez les deux extrémités de l’os avec des ciseaux stériles.
      4. Rincez la moelle osseuse dans un tube de broyage contenant des billes de broyage stériles à l’aide de 1x PBS.
        REMARQUE : Rincer la cavité de la moelle osseuse avec du PBS jusqu’à ce que la cavité apparaisse pâle et que tout le tissu de la moelle visible soit enlevé.
    2. Extraction de l’ARN
      REMARQUE : Les déchets de chloroforme/isopropanol doivent être séparés dans des contenants de solvants halogénés désignés et ne jamais être mélangés à de l’eau de Javel en raison de la formation de gaz toxiques.
      1. Ajouter 1 mL de réactif d’extraction d’ARN par tube. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse (impulsions de 30 s, 4 °C). Incuber les lysats à température ambiante pendant 5 min.
      2. Ajouter 200 μL de chloroforme, agiter pendant 15 s et incuber à 4 °C pendant 30 min.
      3. Centrifugeuse à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
      4. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ajouter 500 μL d’isopropanol, retourner 10 fois pour mélanger et incuber à 4 °C pendant 20 min.
      5. Centrifugeuse à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Jetez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille d’ARN.
      6. Lavez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 75 % (préparé avec de l’eau traitée au DEPC). Agiter brièvement et centrifuger à 7 500 × g pendant 5 min à 4 °C.
      7. Faites sécher le granulé à l’air libre pendant 5 à 10 minutes dans une hotte (évitez de trop sécher).
      8. Dissoudre l’ARN dans 20 à 50 μL d’eau traitée au DEPC.
      9. Mesurez la concentration et la pureté (rapport A260/A280 ≥ 1,8) à l’aide d’un spectrophotomètre.
    3. Synthèse de l’ADNc
      1. Synthétisez l’ADNc à l’aide de 1 μg d’ARN total et d’un kit de transcription inverse.
      2. Conservez l’ADNc à −20 °C pour l’analyse par qPCR.
    4. Analyse qPCR
      1. Analyser l’expression génique des marqueurs ostéogéniques : Alp, Atf4, Runx2, Ocn, Osx ; marqueurs ostéoclastes : Nfatc1, Mmp9, Ctsk ; cytokines : Tnf-α, Il-1β, Il-10 (voir tableau 5).
      2. Utilisez les séquences d’amorces énumérées dans le tableau 6 (y compris les températures de recuit).

5. Analyse statistique

  1. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (moyenne ± SEM).
  2. Utilisez Bonferroni et Tamhani pour les tests post-hoc.
  3. Effectuer une analyse unidirectionnelle de la variance pour évaluer les différences entre les groupes.
  4. Considérons que P < 0,05 est statistiquement significatif.

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Résultats

Fatigue due à un entraînement prolongé sur tapis roulant de haute intensité
Nous avons établi un modèle d’exercice de course à haute intensité à long terme pour étudier les changements squelettiques sous l’exercice et les effets de la thérapie infrarouge sur les os (Figure 1A). À la fin de l’intervention, des souris ont été observées pour des changements de poids corporel. Par rapport au poids corporel des souris du groupe CTR, aucun changement significatif n’a été déterm...

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Discussion

De toutes les maladies osseuses métaboliques, l’OP est la plus courante et un problème majeur de santé publique mondiale11. L’OP survient lorsque les fonctions ostéoblastiques et ostéoclastiques sont dysfonctionnelles et que sa prévalence est élevée18. L’exercice a été de plus en plus mis en avant par les médecins et les chercheurs comme une stratégie potentielle pour la prévention et le traitement de la PO, compte tenu de son faible coût e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.

Remerciements

Les travaux ont été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82172475, 82222046, 82272608) ; Laboratoire clé de Shanghai pour le développement et le maintien des compétences sportives humaines (Université du sport de Shanghai) (n° 11DZ2261100).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Instrument de thérapie par infrarouge lointain  ; Technologie médicale CofoeLe rayonnement infrarouge a ensuite été appliqué comme source de chaleur pour réchauffer le sang dans le réseau capillaire sous-cutané. La température de traitement a été contrôlée entre 42 et 42 °C. C et 45 ° ; C, et l’ensemble du traitement a duré environ 40 min, 3 fois par semaine
Micro-CTSCANCO Medical AGVIVACT80Une micro-tomodensitométrie a été réalisée pour évaluer les paramètres de l’os trabéculaire dans le fémur gauche, y compris BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp et l’épaisseur corticale (Ct.Th).
Tapis roulant sourisAnhui Zhenghua Biological Apparatus Facilities Co., LtdTapis roulant à haute intensité fonctionnant chez la souris
Machine d’enrobage de paraffineLeicaLa machine d’enrobage de paraffine peut incruster des tissus
Trancheuse à paraffineLeicaLe microtome de paraffine peut trancher les tissus
Kit de réactifs PrimeScript RT  ;
SPSS  ;
TribromoéthanolAvertin
TRIzol  ;Biologie préciseAG21101/AG21102

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

M tabolisme osseuxexercice de haute intensitentra nement sur tapis roulantmasse osseusetroubles m taboliques squelettiquesg nes ost og niquesg nes des ost oclastesanalyse par micro CTr paration tissulaire