Method Article

Le clonage de navette basé sur CRISPR : une méthode de clonage à haut débit

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons un protocole pour une méthode de clonage à haut débit, le clonage de navette basé sur CRISPR (clonage CRISPRshuttle), qui permet le transfert de fragments d’ADN d’intérêt entre vecteurs sans avoir besoin d’amplification PCR des fragments d’ADN.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de banques de plasmides à l’échelle du génome à l’aide de dépôts génomiques existants est une condition préalable essentielle à la caractérisation fonctionnelle systématique des gènes dans divers processus biologiques. Cependant, les méthodologies actuelles à haut débit pour le transfert de fragments d’ADN entre vecteurs nécessitent l’amplification par PCR des séquences cibles avant le clonage, ce qui rend la génération de collections de plasmides à l’échelle du génome techniquement exigeante et chronophage. En utilisant une cassette CRISPRshuttle, nous avons développé une nouvelle méthode de clonage à haut débit, le clonage de navette basé sur CRISPR (clonage CRISPRshuttle), qui facilite le transfert de nombreux fragments d’ADN de plasmides de donneurs partageant des séquences de squelette identiques vers un vecteur compatible avec CRISPRshuttle sans amplification PCR des fragments d’ADN. Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRshuttle. Ce protocole implique deux réactions séquentielles en éprouvette avant la transformation bactérienne. Tout d’abord, les fragments d’ADN cibles sont excisés des plasmides donneurs par le clivage médié par Cas9 de leur séquence de squelette vectoriel partagée. Deuxièmement, les fragments d’ADN excisés sont insérés dans des vecteurs linéarisés compatibles avec CRISPRshuttle par assemblage Gibson. Nos résultats démontrent que l’efficacité de CRISPRshuttle dépasse 94 % et que deux chercheurs peuvent générer environ 300 plasmides en 7 jours en utilisant CRISPRshuttle. CRISPRshuttle facilite le transfert efficace, adaptable et rentable de fragments d’ADN entre vecteurs, rationalisant considérablement la génération de bibliothèques de plasmides à l’échelle du génome.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La construction de bibliothèques de plasmides à l’échelle du génome à partir des ressources disponibles est la base et la condition préalable à l’utilisation de la génomique fonctionnelle pour disséquer les processus biologiques. Les méthodes de clonage à haut débit actuelles, y compris les systèmes de clonage Gateway, In-Fusion, Creator et Univector, nécessitent une amplification par PCR des fragments d’ADN cibles 1,2,3,4,5. Cette condition préalable implique des flux de travail de traitement spécifiques aux fragments englobant plusieurs opérations standardisées, y compris, mais sans s’y limiter, la conception d’amorces d’oligonucléotides, la purification de gel et la validation de séquences par séquençage. Par conséquent, la construction de banques de plasmides à l’échelle du génome (par exemple, les bibliothèques de surexpression d’ADNc/ORF) est devenue laborieuse et chronophage, ce qui entrave l’avancement de la génomique fonctionnelle.

Auparavant, nous avons développé CRISPRmass, une méthode de clonage à haut débit conçue pour intégrer des fragments d’ADN spécifiques (par exemple, le module UAS) dans plusieurs plasmides partageant des squelettes vectoriels identiques6. À l’aide de CRISPRmass, nous avons construit plus de 5 500 plasmides UAS-ADNc/ORF basés sur GAL4/UAS à partir d’une banque d’ADNc/ORF de la drosophile , la Drosophila Genomics Resource center (DGRC) Gold Collection6. Cependant, CRISPRmass n’a pas la capacité de transférer des fragments d’ADN entre vecteurs, ce qui limite son application dans le clonage à haut débit.

Pour remédier à ces limitations, nous avons développé le clonage de navette basé sur CRISPR (CRISPRshuttle), une nouvelle méthode à haut débit qui facilite le transfert de plusieurs fragments d’ADN cibles vers des vecteurs de destination à partir de plasmides donneurs7. Ce processus ne nécessite que deux réactions séquentielles en éprouvette, contournant ainsi la nécessité de manipuler des cibles d’ADN discrètes spécifiques à des fragments7.

Le protocole CRISPRshuttle implique deux réactions séquentielles en éprouvette (Figure 1). Tout d’abord, les séquences de squelette vectorielle partagées des plasmides donneurs sont clivées par Cas9/sgRNA pour libérer des fragments d’ADN cibles. Ces fragments sont ensuite transférés sur la cassette CRISPRshuttle d’un vecteur compatible avec CRISPRshuttle via un assemblage Gibson pour générer les plasmides finaux. Une cassette CRISPRshuttle comprend une séquence de squelette vectorielle de ~20-40 pb qui flanque les extrémités 5' et 3' des fragments d’ADN provenant de plasmides donneurs, et un ou deux sites de reconnaissance d’enzymes de restriction uniques situés entre ces séquences flanquantes. Un vecteur compatible avec CRISPRshuttle est construit en insérant une cassette CRISPRshuttle dans un vecteur de destination, qui est ensuite linéarisé en digérant les sites de restriction à l’intérieur de la cassette. Le vecteur de destination doit être porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques distinct de ceux des plasmides donneurs ; S’il est identique, le gène de résistance doit être remplacé par un gène distinct avant d’être utilisé.

Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisant CRISPRshuttle pour construire une banque de plasmides UAS-cDNA/ORF. Ce processus implique le transfert d’ORF humains de la bibliothèque d’expression lentivirale CCSB-Broad dans le vecteur de transgenèse de la drosophile pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle rationalise la construction de banques de plasmides à l’échelle du génome, facilitant ainsi les études de génomique fonctionnelle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Détermination des sites de clivage optimaux Cas9/ARNsg flanquant l’ADNc/ORF

  1. Préparation de plasmides ADNc/ORF
    1. Obtenez des clones d’ADNc/ORF à partir de dépôts publics.
      REMARQUE : Ce protocole utilise les clones ORF à base de vecteurs pLX304 de la bibliothèque d’expression lentivirale8 humaine à l’échelle du CCSB.
    2. Isolez le plasmide à l’aide d’un kit miniprep plasmidique et mesurez sa concentration avec un spectrophotomètre.
  2. Conception de l’ARNsg
    1. Accéder au site web de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Collez la région de 20 à 100 pb du squelette vectoriel pLX304 flanquant l’extrémité ORF 3' dans le champ cible.
    2. Sélectionnez Drosophila melanogaster comme espèce et cliquez sur Trouver des sites cibles. Sélectionnez des candidats à ARNsg dont l’efficacité est estimée supérieure à 80 %.
  3. préparation de l’ARNsg
    1. Synthétisez une amorce avant (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′) où (N)20 représente la séquence cible de l’ARNsg, et une amorce inverse sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      REMARQUE : Les apprêts purifiés PAGE sont recommandés.
    2. Générez une matrice d’ADN pour la transcription in vitro (IVT) de l’ARNg via PCR. Préparez une réaction de 100 μL contenant 5 μL chacun de la matrice pX330 (plasmide Addgene 42230 ; 0,1 ng/μL), de l’amorce directe (10 μM) et de l’amorce sgRNA-REV (10 μM) ; 50 μL de 2x master mix PCR haute fidélité ; et 35 μL d’eau ultrapure traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC).
    3. Amplifier dans un thermocycleur PCR à l’aide du programme suivant : 98 °C pendant 30 s ; 5 cycles de 98 °C pendant 8 s, 52 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 5 s ; 30 cycles de 98 °C pendant 8 s, 72 °C pendant 20 s ; 72 °C pendant 2 min.
    4. Résoudre les produits PCR sur un gel d’agarose à 0,8 %. Exciser la bande de ~120 pb et purifier à l’aide d’un kit d’extraction de gel.
    5. Préparez une réaction IVT de 10 μL contenant 300 ng de fragment d’ADN purifié, 3,33 μL de mélange tampon NTP, 0,67 μL de mélange d’ARN polymérase T7 et de l’eau ultrapure traitée au DEPC. Incuber à 37 °C pendant 4 h.
    6. Quantifier l’ARNsg non purifié par spectrophotométrie, diluer à 20 ng/μL avec de l’eau ultrapure traitée au DEPC et congeler à -80 °C dans de petites aliquotes.
      REMARQUE : Le traitement à la DNase n’est pas nécessaire, car l’ADN résiduel n’interfère pas avec les réactions en aval.
  4. Évaluation de l’ARNsg
    1. Digérer un plasmide ADNc/ORF contenant le squelette du vecteur pLX304 à l’aide d’une enzyme de restriction. Résolvez les fragments d’ADN résultants à l’aide d’un gel d’agarose à 0,8 %. Purifier le substrat d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel.
    2. Préparez un mélange de réaction de clivage Cas9 de 5 μL contenant 0,2 μL de S. pyogenes Cas9 de 1,22 μM, 0,5 μL de 20 ng/μL d’ARNsg, 0,015 pmol de substrat d’ADN, 0,5 μL de tampon 10x Cas9 et de l’eau ultrapure traitée au DEPC. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h.
    3. Résoudre les produits de décolletage à l’aide d’un gel d’agarose à 0,8 %. Inclure le substrat d’ADN non lavé comme témoin négatif.
    4. Visualisez les motifs de clivage à l’aide d’un système d’imagerie numérique et sélectionnez l’ARNsg avec un substrat résiduel minimal pour les expériences ultérieures (Figure 2).

2. Échange du gène de résistance aux antibiotiques du vecteur de destination

REMARQUE : Dans ce protocole, nous utilisons l’exemple de l’échange du gène de résistance à l’ampicilline du vecteur de destination pBID-UASC avec le gène de résistance au chloramphénicol, générant ainsi le vecteur de destination contenant du chloramphénicol pBIDC-UASC.

  1. Supprimer le gène de résistance à l’ampicilline de pBID-UASC.
    REMARQUE : Le gène de résistance à l’ampicilline de pBID-UASC a été éliminé par digestion Cas9 en conjonction avec deux ARNsg, f1Ori5-G4 (séquence cible : 5'-GTCACGACGTTGTAAACGA-3') et Amp3-G2 (séquence cible : 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'), ce qui a donné un squelette vectoriel linéaire pBID-UASC de 7 687 pb. Ces deux ARNsg ciblent respectivement les 5' en amont et 3' en aval du gène de résistance à l’ampicilline.
    1. Préparez une réaction de clivage de 10 μL contenant 0,03 pmol de pBID-UASC, 0,25 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 20 ng de f1Ori5-G4, 20 ng d’Amp3-G2, 1 μL de tampon Cas9 10x et de l’eau ultrapure traitée au DEPC. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Le plasmide clivé Cas9, sans purification, est directement soumis à l’assemblage Gibson.
  2. Amplifier par PCR le gène de résistance au chloramphénicol.
    REMARQUE : Un gène de résistance au chloramphénicol de 840 pb a été amplifié à partir du plasmide pMartini-Cam6 par PCR à l’aide du f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    gtcgcgtatgtatgatacataaggtt-3') et Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') amorces.
    1. Préparer le gène de résistance au chloramphénicol par PCR en amplifiant le gène de résistance au chloramphénicol de 840 pb. Mettre en place une réaction PCR de 20 μL contenant 2 μL de pMartini-Cam (0,1 ng/μL), 1 μL de f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL d’Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL de tampon 5x, 0,4 μL de dNTPs (10 mM), 0,4 μL d’ADN polymérase haute fidélité (2,5 unités/μL), 11,2 μL d’eau ultrapure.
    2. Effectuez la PCR en utilisant les conditions de thermocyclage suivantes : 1 cycle à 95 °C pendant 1 min ; 5 cycles de 95 °C pendant 15 s, 46 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 20 s ; 30 cycles de 95 °C pendant 15 s, 61 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 20 s ; 1 cycle à 72 °C pendant 2 min. Effectuez la réaction dans un thermocycleur.
    3. Résoudre les produits de clivage avec du gel d’agarose à 0,8 % et purifier un fragment d’ADN de 840 pb à l’aide d’un kit d’extraction de gel.
  3. Insérer le gène de résistance au chloramphénicol dans le squelette vecteur pBID-UASC linéarisé, ce qui donne l’équation pBIDC-UASC.
    1. Effectuez une réaction d’assemblage Gibson de 2 μL : 0,008 pmol de gène de résistance au chloramphénicol de 840 pb, 0,002 pmol du pBID-UASC linéarisé (étape 2.1.1), 1,0 μL de 2 mélanges maîtres d’assemblage Gibson. Effectuez la réaction à 50 °C pendant 1 h.
    2. Transformer 10 μL de cellules compétentes pour E. coli avec 1 μL de produit de réaction de ligature. Sélectionner les transformants sur une plaque LB complétée par 15 μg/mL de chloramphénicol.
    3. Choisissez une seule colonie et soumettez-la à une culture bactérienne ultérieure et à un mini-prépa plasmidique. Vérifier le vecteur de destination contenant du chloramphénicol pBIDC-UASC par analyse de restriction et séquençage de l’ADN.

3. Construction du vecteur de destination compatible avec CRISPRshuttle

REMARQUE : Une cassette CRISPRshuttle comprend environ 20 à 40 séquences de squelette vectoriel qui flanquent les extrémités 5' et 3' des fragments d’ADN cibles, avec un ou deux sites de restriction uniques situés entre eux.

  1. Oligonucléotides de recuit à l’aide d’un thermocycleur avec le programme suivant : 94 °C pendant 2 min ; 70 cycles de 52 s à (95-N) °C, où N représente le numéro de cycle.
    REMARQUE : La cassette CRISPRshuttle recuite contient des porte-à-faux de 5' complémentaires à EcoRI et XbaI.
  2. Comparez la cassette CRISPRshuttle recuite dans le vecteur de destination pBIDC-UASC digéré par EcoRI/XbaI pour générer le vecteur de destination compatible avec CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    REMARQUE : Cette ligature élimine les sites EcoRI et XbaI originaux dans les multiples sites de clonage, rendant les sites EcoRI et XhoI au milieu de la cassette CRISPRshuttle uniques dans le vecteur final. Les sites de restriction uniques de la cassette CRISPRshuttle permettent la linéarisation du vecteur de destination compatible avec CRISPRshuttle.
    1. Préparez une réaction de ligature de 5 μL contenant 14 ng de pBIDC-UASC digéré par EcoRI/XbaI de 8 451 pb, 0,02 pmol de la cassette CRISPRshuttle recuite, 0,5 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 0,3 μL d’ADN ligase T4. Incuber la réaction pendant la nuit à 16 °C.
    2. Transformer 10 μL de cellules compétentes pour E. coli avec 1 μL du produit de réaction de ligature. Sélectionner les transformants sur une plaque LB complétée par 15 μg/mL de chloramphénicol et incuber toute la nuit à 37 °C.
    3. Choisissez une seule colonie et soumettez-la à une culture bactérienne ultérieure et à un mini-prépa plasmidique. Vérifiez le vecteur de destination compatible CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect par analyse de restriction et séquençage de l’ADN.

4. Génération de plasmides UAS-cDNA/ORF à l’aide de CRISPRshuttle

REMARQUE : Le protocole CRISPRshuttle implique que des réactions en éprouvette en deux étapes soient effectuées en parallèle avant la transformation bactérienne (Figure 1).

  1. Réaction en tube à essai étape 1
    1. Excise les ORF des plasmides pLX304-ORF par clivage du squelette vectoriel à l’aide de Cas9 en conjonction avec deux ARNsg, pLX304-CMV-G16 (séquence cible : 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', localisée dans le squelette vectoriel pLX304 flanquant l’extrémité ORF 5') et pLX304-3'-G1 (séquence cible : 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', localisée dans le squelette vectoriel pLX304 flanquant l’extrémité ORF 3').
      1. Préparez un mélange maître pour un nombre donné (N) de réactions de digestion comme suit : (N+1) x 0,4 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μL de 80 ng/μL de pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μL de 80 ng/μL de pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μL de 10 x tampon Cas9 et (N+1) x 1,45 μL d’eau ultrapure traitée au DEPC.
      2. Mélangez soigneusement et faites tourner le mélange principal. Aliquote 3,75 μL du mélange maître dans chaque tube. Ajouter 0,75 μL de plasmide pLX304-ORF 0,03 μM dans chaque tube. Bien mélanger et incuber les réactions à 37 °C pendant 1 h.
        REMARQUE : Diluer chaque plasmide pLX304-ORF à une concentration de 0,03 μM avec de l’eau ultrapure traitée au DEPC. Si la concentration est inférieure à 0,03 μM, ajoutez de l’ADN plasmidique directement à la réaction. Les plasmides clivés par Cas9 n’ont pas besoin d’être purifiés après les réactions de clivage et peuvent être directement utilisés pour l’assemblage ultérieur de Gibson.
  2. Réaction en tube à essai étape 2
    1. Insérez les ORF excisés dans le vecteur de destination compatible CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect via l’assemblage Gibson, ce qui permet d’obtenir des plasmides UAS-cDNA/ORF.
      1. Digest pBIDC-UASC-pLXvect avec EcoRI et XbaI. Séparez le pBIDC-UASC-pLXvect linéarisé par électrophorèse sur gel d’agarose et purifiez-le à l’aide d’un kit d’extraction de gel.
      2. Préparez un mélange maître pour un nombre donné (N) de réactions d’assemblage Gibson comme suit : (N+1) x 0,14 μL de pBIDC-UASC-pLXvect linéarisé de 3,36 μM et (N+1) x 1,8 μL de mélange maître d’assemblage Gibson.
      3. Mélangez soigneusement et faites tourner le mélange principal. Aliquote 1,94 μL du mélange maître dans chaque tube. Ajouter 1,66 μL de plasmide clivé Cas9 dans chaque tube. Bien mélanger et incuber les réactions à 50 °C pendant 1 h.
        REMARQUE : Conservez le mélange maître et les tubes à 50 °C avant l’incubation.
  3. Transformez E. coli avec les produits d’assemblage Gibson.
    REMARQUE : Les produits de l’assemblage Gibson ne nécessitent pas de purification avant la transformation d’E. coli .
    1. Décongeler les cellules bactériennes compétentes sur de la glace. Aliquote de 10 μL de cellules dans chaque tube de 1,5 mL prérefroidi.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des cellules bactériennes compétentes avec une efficacité de transformation d’au moins 1 × 108 UFC/μg d’ADN pUC19.
    2. Mélangez délicatement 10 μL de cellules compétentes avec 1 μL de produits d’assemblage Gibson. Placer sur la glace pendant 30 min.
    3. Chauffer à 42 °C pendant 1 min, puis refroidir sur glace pendant 2 min.
    4. Ajouter 100 μL de milieu SOC préchauffé (37 °C) dans chaque tube. Agiter à 250 tr/min pendant 1 h à 37 °C.
    5. Placer les cellules sur des plaques LB contenant 15 μg/mL de chloramphénicol. Incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : La réalisation de ces procédures à grande échelle nécessite généralement plusieurs heures. Sauf indication contraire, conservez les réactifs et les configurations de réaction sur de la glace.
  4. Vérification des plasmides UAS-cDNA/ORF.
    1. Inoculer une seule colonie dans 4,5 mL de milieu LB avec 15 μg/mL de chloramphénicol. Agiter à 250 tr/min pendant la nuit à 37 °C.
    2. Isolez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide.
    3. Préparez une réaction de digestion de restriction de 20 μL pour chaque plasmide contenant 300 à 500 ng d’ADN plasmidique, 0,3 μL de PvuII, 2 μL de tampon 10x et de l’eau ultrapure. Effectuez les réactions à 37 °C pendant 1 h.
    4. Résolution des fragments d’ADN avec 0,8 % de gel d’agarose. Image sous lumière UV (Figure 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons utilisé CRISPRshuttle pour construire une collection de plasmides UAS-cDNA/ORF couvrant 1 397 gènes humains conservés chez la drosophile7. L’analyse de restriction a révélé que CRISPRshuttle atteint une efficacité de 94,5 % pour l’utilisation de vecteurs de destination compatibles avec CRISPRshuttle contenant deux séquences répétitives et de 96,1 % pour l’utilisation de vecteurs de destination sans séquences répétitives7. Nos données ont démontré qu’en g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une étape critique du protocole CRISPRshuttle est la préparation de vecteurs de destination linéarisés compatibles avec CRISPRshuttle. Pour assurer une digestion complète, utilisez un excès d’enzymes de restriction pour digérer les vecteurs, et la purification sur gel des vecteurs digérés est fortement recommandée. Une autre étape cruciale est la digestion des plasmides ADNc/ORF avec Cas9. Si la construction du plasmide échoue, utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose pour vérifier si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32071135) et un fonds de démarrage de l’hôpital affilié Nanhua, école de médecine de Hengyang, Université de Chine du Sud. Nous sommes reconnaissants au professeur Feng Zhang de nous avoir aimablement fourni le plasmide pX330 et au Dr Xiaohui Cai pour son assistance technique.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Poudre d’agarChembaseKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Système automatisé d’analyse d’images numériques sur gelTanonTanon-2500B
ChloramphénicolSangonA100230-0010
Kit d’extraction de gel E.Z.N.A.OmégaRéf. D2500-02
E.Z.N.A. Mini Kit d’ADN plasmidique IOmégaRéf. D6942-02
EcoRI-HFONÉR3101S
Gibson Assembly Master MixONÉE2611S
HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN rapide à haut rendementONÉE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixONÉE2621X
Thermocycleur PCRLongGeneT20
ADN polymérase Platinum SuperFi IIThermo Scientific12361010
PvuII-HFONÉR3151L
Q5 Hot Start Haute-Fidélité 2x Master MixONÉRéférence M0494
S. pyogenes Cas9GenScriptRéférence : Z03386
Incubateur à secoussesLe ZhichuZQLY-180V
SpectrophotomètreShimadzuBioSpec-nano
T4 ADN ligasePromegaRéférence M1801
Cellule chimiquement compétente Trans 10TransGenRéférence CD101-02
TryptoneOxoïdeRéf. LP0042
XbaIONÉR0145S
Extrait de levureOxoïdeLP0021 (en anglais)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles