Article de méthode

In vivo Biotinylation de proximité pour les études d’interaction protéique chez Paramecium tetraurelia

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DOI :

10.3791/68504

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12 septembre 2025

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1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Dans cet article

Résumé

Le protocole présente une méthode de fixation covalente in vivo de la biotine à des protéines basée sur leur proximité avec une biotine ligase fusionnée à une protéine d’intérêt. Cette modification permet un enrichissement sélectif des protéines à l’aide de billes de streptavidine selon les besoins des études d’interaction protéique.

Résumé

La paramécie est un organisme modèle majeur pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans les réarrangements génomiques programmés et l’élimination des transposons au cours de la reproduction méiotique. De nombreux détails de ce processus restent énigmatiques en raison de la complexité de la machinerie moléculaire impliquée et des interactions transitoires protéine-protéine. Ici, nous présentons une méthode de marquage en temps résolu des protéines avec de la biotine située à proximité d’une protéine cible d’intérêt. La méthode peut facilement être adaptée à différentes cibles, car la biotinylation est réalisée par l’injection d’un ADN codant pour une protéine cible fusionnée à une biotine ligase modifiée. La construction de fusion est exprimée à partir du promoteur du gène endogène, ce qui permet d’obtenir un profil d’expression spécifique à l’étape similaire à celui de la protéine native. Notamment, la fraction biotine attachée de manière covalente permet l’enrichissement sélectif des protéines marquées à l’aide de billes enrobées de streptavidine. De plus, avec la coloration par immunofluorescence, nous montrons qu’un marquage efficace nécessite une supplémentation de la culture en biotine. Le vecteur d’expression conçu prêt à l’emploi, combiné à la procédure d’injection efficace démontrée ici, permet la génération rapide de lignées de paramécie exprimant une protéine modifiée. La procédure de biotinylation démontrée ici peut être suivie d’une spectrométrie de masse pour l’identification des protéines enrichies qui contiennent les partenaires d’interaction de la protéine cible. La biotinylation de proximité a le potentiel de simplifier et d’accélérer la découverte des interactions protéine-protéine dans la paramécie et d’intensifier les efforts pour comprendre sa machinerie d’édition du génome.

Introduction

L’organisme unicellulaire cilié Paramecium tetraurelia abrite deux types distincts de noyaux : un noyau germinal pour le stockage à long terme de l’information génétique et un noyau somatique pour les fonctions physiologiques de la cellule1. La reproduction sexuée chez cet organisme nécessite la formation d’un nouveau génome somatique. Ce processus comprend l’excision irréversible de plus de 45 000 fragments d’ADN du génome somatique2 qui comprennent des éléments transposables3 et d’autres répétitions. Ce qui est particulièrement frappant, c’est que les événements d’excision sont exécutés avec une précision allant jusqu’à la paire de bases simples1. Cette précision est biologiquement nécessaire, car les fragments d’ADN excisés perturbent les régionscodant pour les protéines 4 et toute excision défectueuse pourrait évoquer des mutations par décalage de cadre, des codons d’arrêt prématurés ou modifier la séquence codante de la protéine. Un mécanisme complexe de comparaison d’ARN permet à la cellule de différencier les séquences nécessaires dans le nouveau génome somatique. Il est initié par la transcription de l’ensemble du génome germinal5, suivie d’un découpage à une taille de 25 pb6, d’un transport vers l’ancien génome somatique7, où tous les ARN complémentaires sont éliminés8. Les ARNs restants qui n’ont pas de séquences complémentaires dans l’ancien génome somatique sont ensuite transportés vers le nouveau génome somatique en développement, où ils s’alignent sur toutes les séquences limitées par la lignée germinale et dirigent leur excision9. Ce processus complexe en plusieurs étapes nécessite une interaction précise et opportune de nombreux composants cellulaires, et notamment, des interactions faibles transitoires lorsque les petits ARN transitent entre les différents noyaux10,11. Auparavant, des tentatives de compréhension de la mécanique moléculaire du processus étaient faites à l’aide d’expériences d’inactivation pour déterminer si les composants présumés sont essentiels au processus, suivies d’approches d’immunoprécipitation pour découvrir les interactions des protéines essentielles 12,13,14. Bien que cette méthode soit utile pour la détection de liaisons fortes et continues qui supportent également les conditions non physiologiques pendant le pulldown, la détection d’interactions faibles et transitoires peut nécessiter une optimisation fastidieuse. En raison de la nature potentiellement transitoire de nombreuses interactions impliquées dans le processus d’édition du génome, les méthodes in vivo pourraient améliorer la détection de ces interactions. De plus, certaines protéines ne peuvent pas être solubilisées efficacement dans des conditions extracellulaires15, ce qui représente un problème qui peut être résolu par des modifications protéiques basées sur l’interaction in vivo, telles que le marquage de proximité avec la biotine.

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode qui permet une biotinylation in vivo spécifique de protéines localisées à proximité de la protéine cible souhaitée. La modification covalente de la biotine peut être utilisée pour un enrichissement efficace en utilisant des approches de réduction basées sur la streptavidine. Le développement de cette méthode a été réalisé en utilisant la biotine ligase TurboID16 pour effectuer les études d’interaction protéique chez Paramecium tetraurelia. Notre approche peut être facilement appliquée à n’importe quelle protéine cible en suivant les étapes décrites dans le protocole. Par conséquent, cet article fournit une stratégie efficace et évolutive de biotinylation de proximité qui peut être utilisée pour des études protéomiques à haut débit dans un organisme modèle protozoaire de premier plan.

Protocole

1. Méthodes générales

  1. Procurez-vous des tampons, des réactifs et d’autres matériaux comme indiqué dans le tableau 1.
  2. Cultiver des lignées monoclonales de Paramecium comme décrit précédemment17. En bref, transférez une cellule dans un nouveau puits de dépression contenant un milieu léger bactérisé (0,8 μg/mL de β-sitostérol) afin que la densité cellulaire reste inférieure à 500 cellules/mL, afin d’éviter l’initiation prématurée du cycle méiotique. À 50 divisions cellulaires, transférez les cellules dans une culture de milieu riche en bactéries (avec 0,8 μg/mL de β-sitostérol) et laissez jusqu’à ce que toutes les bactéries soient consommées, induisant ainsi la reproduction sexuée (autogamie)18.
    REMARQUE : À la fin du cycle de reproduction sexuée, les cellules resteront dans un état post-autogame non divisé, jusqu’à ce qu’une nouvelle source de nutriments soit fournie.
  3. Construisez des protéines de fusion des gènes cibles à l’aide d’un vecteur contenant une séquence turboID 3x HA optimisée pour les codons avec des sites de coupe d’enzymes de restriction en amont.
    1. Effectuez une amplification PCR du gène cible et de sa région promotrice à partir de l’ADN génomique, à l’aide d’amorces conçues avec des surplombs qui codent pour des sites de restriction appropriés.
    2. Insérez le produit en utilisant la digestion de restriction standard dans les sites de coupe compatibles avec le cadre19 en amont des régions de codage turboID.
  4. Séquençage, vérification et amplification de l’ADN plasmidique construit dans E . coli DH5α. Isolez le plasmide à l’aide d’un kit de midiprep plasmidique et linéarisez 100 μg d’ADN plasmidique par digestion par restriction.
  5. Purifier par extraction au phénol-chloroforme, puis filtrer à travers un filtre centrifuge12. Effectuer une précipitation de l’éthanol et dissoudre la pastille d’ADN dans l’eau pour obtenir une concentration de 5 mg/mL.
    REMARQUE : L’ADN peut être introduit dans les noyaux somatiques des cellules de paramécie en utilisant la procédure de micro-injection suivante.

2. Microinjection dans le noyau somatique (MAC)

  1. Transférez une cellule de la culture post-autogame obtenue à l’étape 1.2 dans une lame de dépression fraîche avec un milieu léger bactérisé contenant 0,8 μg/mL de β-sitostérol. Incuber à 27 °C pendant deux jours avant l’injection pour récupérer les cellules.
  2. À l’aide d’un stéréomicroscope, transférez les cellules de la culture récupérée dans une lame de dépression fraîchement préparée et remplie de milieu de lavage.
  3. Pendant que les cellules sont dans le produit de lavage, ajoutez 20 μL de ddH2O sur une lame de verre et recouvrez d’un verre de protection.
  4. Ajoutez 200 μL d’huile minérale sur le verre de protection.
  5. Après cela, transférez les cellules lavées individuelles sous forme de gouttelettes sous l’huile minérale en utilisant le moins de volume de liquide possible. Placez jusqu’à 20 bulles contenant une seule cellule par lame, puis positionnez la lame préparée sur le piédestal du microscope à injection.
  6. Fixez l’aiguille d’aspiration et mettez-la en position, puis démarrez le bras robotique et la machine d’injection.
  7. À l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur, ajoutez 2 à 3 μL de la solution d’ADN préparée à l’étape 1.5 dans l’aiguille d’injection. Fixez l’aiguille au bras robotique et mettez-la en position, puis connectez-la à la soupape de pression de la machine d’injection.
  8. À l’aide du bras robotisé, positionnez l’aiguille d’injection dans une gouttelette d’eau vide sur la lame. Appuyez ensuite sur Clean pour purger tout air restant dans l’aiguille d’injection jusqu’à ce que le flux d’ADN soit observé.
  9. Passez à une gouttelette qui contient une cellule, puis abaissez l’aiguille d’aspiration. Retirez doucement le liquide (eau) de cette gouttelette jusqu’à ce que la cellule soit immobilisée.
  10. Soulevez l’aiguille d’aspiration et abaissez l’aiguille d’injection, puis passez à un grossissement plus élevé.
  11. S’assurer que le noyau somatique (CMA) est maintenant visible comme une région plus foncée dépourvue de vacuoles alimentaires (voir Figure 1c) dans laquelle l’aiguille d’injection doit être insérée.
  12. Essayez de pénétrer complètement le MAC avec l’aiguille d’injection et rétractez lentement l’aiguille pendant plusieurs secondes.
    REMARQUE : Lorsque l’aiguille est située à l’intérieur du MAC, l’ADN s’écoule dans le MAC en raison de la pression d’air constante appliquée par la machine d’injection. Une vacuole diffuse constituée de l’ADN injecté pourrait devenir visible à l’intérieur des limites de la MAC.
    REMARQUE : Il est possible d’injecter plusieurs fois la même cellule pour assurer la réussite de l’injection.
  13. Une fois l’injection de cellules terminée, abaissez l’aiguille d’aspiration contenant l’eau aspirée à l’étape 2.9. Inversez le flux pour renvoyer suffisamment d’eau à la gouttelette jusqu’à ce que la cellule recommence à bouger.
  14. Continuez jusqu’à ce que toutes les gouttelettes contenant une cellule aient été traitées.
  15. Récupérez chaque cellule injectée en recueillant les gouttelettes de la lame et en transférant chacune d’elles dans un puits séparé rempli d’un milieu léger bactérisé, avec 0,8 μg/mL de β-sitostérol.
  16. Incuber à 27 °C pendant la nuit, transférer une seule cellule de chaque puits dans un nouveau puits et maintenir le puits d’origine à 18 °C en guise de sauvegarde.
  17. Cultivez les cellules transférées pendant la nuit à 27 °C pendant 1 jour, puis transférez 5 cellules de chaque puits monoclonal dans un tube PCR. Utilisez des amorces spécifiques à la construction pour l’amplification afin de vérifier la présence de l’ADN injecté dans les cellules.

3. Coloration par immunofluorescence pour la vérification de la localisation correcte des protéines et de la fonction de la biotine ligase

  1. Cultivez les clones sélectionnés positifs à la PCR dans 20 mL de milieu bactérisé avec 0,8 μg/mL de β-sitostérol.
  2. Une fois que le milieu devient moins trouble, prélevez un échantillon de 50 μL de la culture. Ajouter 1 μL de solution de DAPI (0,1 mg/mL) et 1 μL d’EDTA (0,5 mM) pour la coloration de l’ADN afin de vérifier l’initiation de l’autogamie.
    REMARQUE : L’autogamie commence généralement à une densité cellulaire de 2 000 cellules/ml.
  3. Si la biotinylation est souhaitée, compléter le milieu de culture avec de la biotine jusqu’à une concentration finale de 500 μM pendant au moins 1 h avant de récolter les cellules.
  4. Prélever les cellules au stade de développement approprié à l’aide d’une centrifugeuse de mesure d’huile équipée de tubes en forme de poire à 280 x g pendant 2 min. Jetez le milieu de culture et ajoutez du PBS dans les tubes, puis centrifugez-le à nouveau et retirez le PBS.
  5. Remettez la pastille de cellule en suspension dans du PBS et transférez-la dans un tube de microcentrifugation transparent de 1,5 ml.
  6. Préparez une dilution de 3,7 % de PFA dans du PBS à partir de la solution mère à 37 %.
  7. Remettre la pastille en suspension dans 0,5 mL de PFA à 3,7 % et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur de tube.
  8. Centrifuger à 600 x g pendant 1 min jusqu’à ce qu’une pastille visible se forme. Jetez la solution de PFA dans le conteneur de déchets spéciaux désigné.
  9. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de 50 mM de glycine dans du PBS. Incuber pendant 5 à 10 min sur un rotateur de tube.
  10. Centrifugeuse à 600 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant et ajouter 0,8 mL de 1x PBS. En option, lavez une fois de plus avec du PBS.
    REMARQUE : À ce stade, les cellules peuvent être stockées à 4 °C, si nécessaire.
  11. Centrifuger à 600 x g pendant 1 min, retirer le PBS et ajouter 500 μL de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS. Incuber pendant 20 min sur un rotateur de tube.
  12. Centrifugez jusqu’à ce que la pastille devienne visible (1 000 x g pendant 2 min), retirez la solution Triton X-100 et remettez les cellules en suspension dans le PBS.
  13. Préparez une solution de BSA à 5 % dans du PBS en fonction du volume d’anticorps requis.
  14. Retirez le lavage PBS des cellules et ajoutez 100 μL de l’anticorps primaire dilué dans 5 % BSA dans PBS aux cellules. Ajustez le temps d’incubation en fonction de l’anticorps utilisé.
    REMARQUE : L’incubation pendant 2 h à température ambiante est suffisante pour la plupart des anticorps.
  15. Centrifugez à 600 x g, retirez la dilution primaire de l’anticorps et lavez les cellules avec 500 μL de PBS.
  16. Ajouter 100 μL de l’anticorps secondaire dilué dans 5 % de BSA dans du PBS. Ajustez le temps d’incubation ; Généralement, 1 h à température ambiante suffit. Couvrez le tube d’une feuille d’aluminium pour protéger le fluorophore de la lumière.
  17. Ajouter 1 μL de solution de DAPI (0,1 mg/mL) pendant les 10 dernières minutes d’incubation avec l’anticorps secondaire.
  18. Centrifugez à 600 x g pendant 1 min, retirez la solution de coloration et lavez deux fois avec du PBS. Laissez 20 μL du deuxième lavage dans le tube et remettez les cellules en suspension.
  19. Monter 10 μL sur une lame pour l’inspection au microscope.

4. Enrichissement sélectif des protéines biotinylées

  1. Récoltez 1 x 106 cellules au bon stade de développement, comme décrit au point 3.4.
  2. Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de tampon de lyse.
  3. Transférez dans un homogénéisateur et lysez les cellules avec 100 coups de pilon.
  4. Transférez le lysat dans deux tubes de microcentrifugation et centrifugez à 21 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Équilibrer les billes magnétiques enrobées de streptavidine en mélangeant 20 μL (par échantillon) de boue de billes en suspension à vortex pulsé avec 1 mL de tampon de lyse dans un tube de microcentrifugation et en incubant pendant 2 min.
  6. Retirez le tampon de lyse des billes à l’aide d’un support magnétique et remettez-le en suspension dans le tampon de lyse.
  7. Répétez l’étape 4.6.
  8. Retirez le tampon de lyse et mélangez les billes équilibrées avec le surnageant (lysat clarifié) de l’étape 4.4.
    REMARQUE : Les concentrations optimales de sel et le pourcentage de détergents pour la liaison aux billes peuvent différer et doivent être validés expérimentalement. De plus, il est possible d’incuber la pastille de 4,4 dans 50 μL de SDS à 2 % pendant 10 min à 60 °C pour extraire les protéines de la fraction insoluble, suivie d’une centrifugation à 21 000 x g pendant 10 min. Ajoutez cet extrait au lysat clarifié et aux billes.
  9. Incuber pendant 1 à 2 h à température ambiante sur un rotateur de tube.
  10. Centrifugez brièvement (<1s) le tube pour récupérer tout le liquide au fond du tube, collectez les billes sur un support magnétique, puis remplacez le surnageant (flowthrough) par un tampon de lavage 1.
  11. Incuber pendant 5 min sur un rotateur de tube puis répéter comme à l’étape 4.10 pour un deuxième lavage.
  12. Remplacez le tampon de lavage 1 par le tampon de lavage 2 pour deux lavages supplémentaires (lavage 3 et 4).
  13. Remplacez le tampon de lavage 2 par le tampon de lavage 3 pour deux derniers lavages (lavage 5 et 6).
  14. Après avoir retiré le lavage final, stockez les billes à -20 °C avant le traitement en aval.
    REMARQUE : Les billes peuvent être éluées à l’aide d’un tampon Laemmli pour l’analyse par transfert western et soumises à des services de spectrométrie de masse pour une préparation peptidique sur les billes pour l’identification des protéines.

Résultats

Notre protocole décrit une méthode simplifiée pour l’introduction d’une modification covalente de la biotine dans les protéines au voisinage d’une protéine cible dans Paramecium (Graphique 1A). Ces protéines biotinylées peuvent ensuite être enrichies à l’aide d’un pulldown de streptavidine et identifiées à l’aide de la spectrométrie de masse20. Pour démontrer un cas d’utilisation pratique de la méthode, nous avons appliqué le protocole à la protéine Nowa1. Cette protéine est essentielle au processus de réarrangement génomique et présente des altérations dynamiques dans sa localisation12. Dans les premiers stades, il reste dans l’ancien noyau somatique et se fragmente, mais plus tard, il est localisé dans le nouveau noyau en développement. Notamment, nos tentatives précédentes d’enrichissement médié par marquage des protéines interagissant avec Nowa1 ont échoué (résultats non publiés). Cela était probablement dû aux répétitions complexes présentant une similitude avec la protéine prion PrP27 qui pouvaient provoquer une auto-agrégation dans des conditions non optimales pendant la procédure de pulldown21. Nous avons amplifié par PCR la région codante de Nowa1 avec sa région non codante en amont contenant le promoteur. Le produit a ensuite été inséré dans le cadre à l’aide d’une séquence d’encodage turboID optimisée pour les codons (Graphique 1B). Pour éviter le silençage induit par le transgène causé par l’injection d’ADN circulaire dans Paramecium, le vecteur a été linéarisé avant l’injection. L’ADN linéarisé et purifié a ensuite été micro-injecté dans le noyau somatique (MAC) comme décrit dans ce protocole. Une gouttelette dispersée confinée dans la région la plus foncée du noyau somatique est devenue visible dans certaines des injections réussies (Graphique 1C). Le succès de l’injection et l’amplification de l’ADN par les cellules lors de la division cellulaire ont ensuite été vérifiés par PCR. Comme prévu, 40 à 50 % des cellules étaient positives pour l’ADN injecté de la construction Nowa1 (taille de produit attendue de 685 pb) (Graphique 2). L’étape suivante consistait à vérifier la présence de la protéine codée par l’ADN injecté. Étant donné que le vecteur récepteur contient la séquence turboID flanquée d’un triple marqueur HA, nous avons utilisé la coloration par immunofluorescence pour détecter le marqueur. Cela nous a permis de vérifier si les cellules injectées expriment la protéine de fusion et si elle était correctement localisée. Nous avons utilisé des cellules à un stade avancé qui ont montré la localisation de la protéine de fusion dans les deux nouveaux noyaux en développement, comme précédemment observé pour la protéine Nowa1 de type sauvage12. Les lignées cellulaires individuelles injectées ont montré différents niveaux de la protéine de fusion (Graphique 3). Un niveau d’expression plus faible peut être bénéfique pour les applications où un bruit de fond réduit est souhaitable, mais dans ce cas, nous avons opté pour un signal maximal et avons procédé avec le clone 2, qui a montré l’expression la plus élevée. Nous avons ensuite collecté des échantillons à différents stades de développement pour suivre la localisation de la protéine de fusion. La protéine a d’abord été localisée dans les écheveaux formés à partir de l’ancien noyau somatique et dans les fragments nucléaires séparés au cours des premiers stades de l’autogamie. Lors de l’apparition de l’anlagen nucléaire, la protéine de fusion a évolué vers ces nouveaux noyaux en développement (Graphique 4). Pour favoriser la biotinylation du protéome proximal aux différents stades, nous avons complété la culture avec de la biotine 500 μM pendant 2 h avant de prélever les cellules pour la FI. Nous avons visualisé les protéines marquées à la biotine via une coloration IF à l’aide d’une streptavidine marquée par fluorescence. Le signal observé correspondait à la localisation de la protéine de fusion marquée HA. Il est important de noter qu’il a été possible d’obtenir une localisation de la biotinylation spécifique aux différents stades de développement nucléaire, car même une courte incubation avec de la biotine est suffisante pour obtenir une biotinylation significative (Graphique 4). De plus, sans l’ajout de biotine supplémentaire, seule une biotinylation négligeable était détectable dans les cellules injectées. Dans les cellules de type sauvage, l’ajout d’un supplément de biotine n’a provoqué aucune biotinylation détectable (Graphique 5A). Notamment, la biotine ne s’accumulait pas simplement dans le noyau en développement, car même dans des conditions de dénaturation, elle reste attachée aux protéines. (Graphique 5B). À l’aide de billes magnétiques enrobées de streptavidine, il a été possible d’enrichir sélectivement les protéines biotinylées (Graphique 6). Les protéines enrichies peuvent être identifiées à l’aide de la spectrométrie de masse. Dans ces expériences ultérieures d’identification de protéines, la culture non supplémentée, ainsi que les cellules exprimant une protéine turboID non fusionnée, peuvent être utilisées comme groupes de contrôle de fond.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure de biotinylation de proximité chez P. tetraurelia. (A) Aperçu général du protocole. (B) Principe de clonage pour le vecteur récepteur turboID plug-and-play et la construction résultante pour la protéine de fusion Nowa1. La région 3'UTR utilisée dans ce plasmide est dérivée de CenH3a. (C) Gouttelette diffuse visible contenue dans la zone plus sombre correspondant au noyau somatique (MAC) lors d’une injection réussie d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Test PCR pour une injection réussie. Analyse sur gel d’agarose de la réaction PCR d’un produit avec une amorce directe spécifique pour la région amont codant pour la résistance à l’ampicilline (amp start) et une amorce inverse complémentaire à Nowa1. La pointe de la flèche indique la taille attendue du produit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Coloration par immunofluorescence pour valider la localisation correcte de la protéine de fusion turboID. Coloration par immunofluorescence à l’aide d’un anticorps primaire anti-HA de lapin (1:100) et d’un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 568 (1:1000) de lignées monoclonales de paramécie avec un signal PCR positif pour l’ADN codant pour une protéine de fusion Nowa1-HA-turboID. Echelle 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Biotinylation spécifique de Nowa1 à différents stades de développement. Coloration par immunofluorescence de la ligne monoclonale 2 à des stades progressifs lors de la formation du nouveau noyau somatique. Le milieu de culture a été complété par 500 μM de biotine pour une activité turboID optimale. L’HA-tag a été détecté comme sur la figure 3, et la biotine a été détectée à l’aide de la streptavidine-FITC (1:200). Echelle 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Un marquage de proximité efficace par turboID nécessite un supplément de biotine dans la culture. (A) Coloration par immunofluorescence des cellules wt et injectées au stade avancé du développement montrant l’expression de Nowa1-HA-turboID et la biotinylation observée avec 500 μM de biotine supplémentaire. Le HA-tag et la biotine ont été détectés comme à la figure 4. Echelle 20 μm. (B) Analyse par transfert Western pour la biotine à l’aide de la HRP-streptavidine de cellules wt cultivées avec de la biotine 500 μM et de cellules injectées de turboID avec et sans biotine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Enrichissement de protéines biotinylées avec des billes magnétiques de streptavidine. Analyse par transfert Western pour la biotine d’échantillons provenant d’une expérience de pulldown utilisant des billes magnétiques enrobées de streptavidine. Les échantillons sont : le lysat cellulaire Nowa1-HA-turboID (entrée), la fraction non liée (flowthrough), les étapes de lavage (wash 1-6) et les protéines liées aux billes (sortie). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une technique permettant de fixer un groupement biotine aux protéines à proximité de la protéine d’intérêt. Basé sur la forte affinité de la streptavidine pour la biotine, cela permet un enrichissement rapide et efficace des protéines modifiées. Combinée à l’adaptabilité rapide pour différentes protéines d’intérêt, la méthode présentée peut faciliter l’étude des interactions multiprotéiques chez Paramecium. Cet organisme modèle est bien établi pour la recherche sur les interactions transposon-hôte au cours de la reproduction méiotique3. De plus, il pourrait offrir de nouveaux outils moléculaires pour une édition précise du génome, car il excise plus de 45 000 séquences lors de ses réarrangements génomiques programmés. Le processus est orchestré par une machinerie complexe à plusieurs composants qui permet une excision précise de ces fragments d’ADN dirigée par l’ARN avec un site de clivage reproductible à chaque génération. La méthode présentée ici offre deux avantages majeurs pour l’étude de ce processus. Il simplifie la découverte d’interactions transitoires protéine-protéine. De plus, le vecteur récepteur plug-and-play permet la création rapide de nombreuses protéines de fusion fonctionnelles. Étant donné que de multiples facteurs sont probablement impliqués dans le processus à différentes étapes, l’adaptabilité permet de découvrir les interactomes de nombreuses protéines qui pourraient faire partie de la machinerie d’excision. Il est important de noter que les constructions de fusion sont exprimées à partir du promoteur du gène endogène et, par conséquent, correspondent étroitement à l’évolution temporelle de l’expression native. De plus, l’utilisation démontrée de la micro-injection pour l’administration de matériel génétique exogène à cet organisme modèle permet de générer des populations monoclonales homogènes. De telles populations permettent une initiation plus synchrone du processus d’autogamie, au cours duquel le développement d’un nouveau noyau somatique a lieu.

Bien que la procédure démontrée pour l’introduction des constructions de fusion turboID soit robuste, une optimisation spécifique pourrait être nécessaire dans les protocoles d’enrichissement en protéines en aval, en raison du mécanisme de biotinylation. Étant donné que l’enzyme turboID fusionnée génère des fractions réactives biotine-AMP qui se diffusent loin de l’enzyme, celles-ci peuvent potentiellement réagir avec n’importe quelle fraction nucléophile à proximité. Ainsi, une étape essentielle de cette méthodologie est l’identification des véritables partenaires d’interaction à partir des coups de fond et des protéines localisées au voisinage général de la protéine de fusion turboID, qui ne sont pas les partenaires d’interaction réels. Pour ce faire, une variation de paramètres peut être ajustée, comme la durée d’incubation avec de la biotine16. De plus, une configuration expérimentale qui comprend un groupe témoin sans biotine supplémentaire dans le milieu pourrait indiquer la liaison de fond. Comme démontré, un tel groupe témoin sera génétiquement identique à l’expérience réelle, mais la biotinylation par turboID est fortement réduite en raison de la faible abondance de biotine. D’autres groupes témoins importants pourraient inclure une protéine turboID non fusionnée, ainsi qu’un groupe de type sauvage, tous deux cultivés dans le milieu complété par de la biotine. De plus, même si la forte affinité de la streptavidine pour la biotine est un avantage significatif par rapport aux pulldowns basés sur les anticorps, différentes concentrations de sel et de détergent sont susceptibles d’avoir une influence sur la pureté et l’efficacité de l’enrichissement.

Des approches protéomiques supérieures pourraient améliorer notre compréhension des machineries moléculaires uniques de Paramecium, et potentiellement, d’autres ciliés. Les composants moléculaires dotés de nouvelles fonctions promettent d’être réutilisés en tant qu’outils en biologie synthétique et pourraient ainsi favoriser les développements biotechnologiques22,23. Les protéines synthétiques modifiées consistent souvent en des combinaisons de domaines fonctionnels avec de nouvelles propriétés qui permettent des applications thérapeutiques auparavant impraticables. Les protéines modifiées peuvent également être utilisées dans les processus de production pharmaceutique24. Le système d’excision du génome dirigé par l’ARN de Paramecium est particulièrement intéressant pour de tels développements. Ce système réalise l’excision dépendante de l’ARN de milliers de fragments d’ADN, avec une précision allant jusqu’au nucléotideunique 25. De tels paramètres rendent intéressant l’amélioration de la précision de l’édition du génome dans les cellules humaines. La méthode de biotinylation de proximité présentée peut être utilisée pour accélérer et favoriser la découverte de nouveaux composants protéiques et de leurs interactions au sein de machines moléculaires multiprotéiques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été financé par une bourse DigiK de l’Université de Berne et une subvention du Fonds national suisse 229074 accordée à B.-A.S. et la bourse du Fonds national suisse 214853 attribuée à M.N.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope Axiovert 40 CFL (objectifs 10x, 40x)ZeissNa
B-sitostérolSigma Aldrich567152
albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichN° A9647
Huile CellTramEpendorfNa
Séquence d’ADN 3xHA-turboID optimisée pour les codonsTwist bioscienceNaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
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TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA< br/> TATCTTCAAGATAGAAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
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GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGTTACTCT
/ TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
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CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAA
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TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAc
AAGGAGCTCTTTTTATTAGAACAAgatg
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGTT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
Pointes du microchargeur epT.I.P.S.Ependorf5242956003
ÉthanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfNa
Femtotip IICalibre Scientifique5242957000
Solution de formaldéhydeSigma AldrichRéf. F8775
GlycineAppliChem10021259
Anticorps IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
HA-tag (C29F4) lapin mABsystèmes cellulaires3724
InjectMan NI 2EpendorfNa
Léger moyenNaNa0,2x solution en poudre d’herbe de blé dans 2,5 mM de Na2HPO4
Huile minéraleSigma AldrichRéférence M8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Phénol-chloroforme-isoamylalkoholSigma Aldrich77617
solution saline tamponnée au phosphore  ;Fischer Scientific10722497
Kit Plasmid plus midiprepQiagene12945
Milieu richeNaNa1x solution de poudre d’herbe de blé dans 2,5 mM de Na2HPO4
Streptavidine-FITCThermo Fisher Scientific11-4317-87
Filtre centrifuge Ultrafree-MC GV  ;EMD MiliporeUFC30GV00
solution de lavageNaNa0,1 % BSA dans l’eau de Volvic  ;
solution de poudre d’herbe de bléPines internationalNaPréparez comme un stock 20x à partir de la poudre comme décrit précédemment (0,5 g / 10 ml)
Streptavidine-HRPABCAMAB7403
Perles magnatiques enrobées de streptavidineSigma AldrichLSKMAGT02
Tampon de lyse pour l’extractionNaNa50 mM Tris pH 8 ; 150 mM de NaCl ; 0,5 % de désoxycholate de sodium ; 1 % Triton X-100 ; 5 mM MgCl2 ; 2x inhibiteur de protéase cOmplete (Roche) ;   ;
Tampon de lavage 1 pour tirageNaNa50 mM Tris pH 8 ; 150 mM de NaCl ; 0,5 % de désoxycholate de sodium ; 1 % Triton X-100 ; 5 mM MgCl2 ;
Tampon de lavage 2 pour tirageNaNa10 mM Tris pH 7,4 ; 150 mM de NaCl ; 0,01 % NP40 ; 1 mM de MgCl2
Tampon de lavage 3 pour tirageNaNa10 mM Tris pH 7,4 ; 150 mM de NaCl ;

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Marquage la biotineligase TurboIDmicroinjection d ADNmarquage par immunofluorescencebilles de streptavidineWestern Blotenrichissement prot ique
In vivo Biotinylation de proximité pour les études d’interaction protéique chez Paramecium tetraurelia
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