Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

Résumé

Ici, nous présentons un protocole permettant le séquençage du génome entier des infections bactériennes sexuellement transmissibles à partir d’échantillons cliniques en utilisant l’enrichissement cible. Cette nouvelle méthode basée sur un panel syndromique permet de surmonter les défis de l’ADN humain abondant et des faibles charges bactériennes, facilitant la surveillance génomique de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum et Mycoplasma genitalium.

Résumé

Il est difficile d’obtenir des génomes complets d’infections sexuellement transmissibles (IST) bactériennes directement à partir d’échantillons cliniques en raison de la présence d’ADN humain, de microbiote et de très faibles charges d’agents pathogènes bactériens. La culture n’est souvent pas une option, car ces espèces sont méticuleuses et la plupart des échantillons sont prélevés dans des milieux de transport qui lysent les micro-organismes, les rendant non viables pour la culture. Pour résoudre ces problèmes, nous avons utilisé un panel de sondes conçu pour quatre espèces afin de générer des séquences du génome entier des IST bactériennes et avons effectué l’enrichissement de la cible, une procédure d’hybridation de deux à trois jours avant le séquençage du génome. Nos premiers résultats ont produit d’excellentes données génomiques en utilisant des échantillons pour lesquels le séquençage direct n’a pas été couronné de succès. L’enrichissement de la cible s’est avéré très efficace pour le séquençage des génomes bactériens des IST, en particulier lorsque la charge pathogène était élevée (Ct < 30). Les échantillons testés contenant Mycoplasma genitalium avaient souvent des valeurs Ct supérieures à 30, ce qui entraînait des taux de réussite de récupération du génome plus faibles ; des améliorations ont été observées après l’optimisation de la température d’hybridation de 65 °C à 62,5 °C. En plus de permettre la surveillance génomique, la disponibilité de génomes complets peut fournir des informations précieuses sur la résistance aux antimicrobiens, comme l’identification des déterminants de la résistance acquise associés à Neisseria gonorrhoeae. Cette méthode a déjà conduit à l’identification d’une nouvelle lignée de lymphogranulomatose vénérienne de Chlamydia trachomatis à Buenos Aires, le génotype L4 ompA, mettant en évidence le potentiel de cette approche pour découvrir une nouvelle diversité génomique et améliorer la surveillance des IST.

Introduction

L’avènement des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) a facilité le séquençage du génome entier bactérien (WGS), permettant le séquençage d’isolats cliniques au sein de nombreuses espèces d’agents pathogènes bactériens humains. La technologie a permis de nombreuses études comparatives grâce à la génération de génomes complets à une échelle sans précédent. Cela a eu un impact important sur la microbiologie clinique et de santé publique, car l’accès aux données génomiques des échantillons cliniques par le biais du WGS permet le typage et la détection des gènes de résistance aux antimicrobiens. De plus, les approches métagénomiques permettent de détecter directement les agents pathogènes associés à la maladie à partir d’échantillons cliniques. Ces informations créent de nouvelles possibilités de stratégies de traitement personnalisées pour les patients. De plus, le WGS est un outil puissant qui fournit des informations sur l’évolution des souches en circulation d’un agent pathogène spécifique, ainsi que sur leurs modes de transmission, ce qui permet aux autorités de santé publique de mieux comprendre les épidémies d’agents pathogènes et d’y répondre ^1,2,3.

Pour obtenir une qualité de séquençage suffisante pour le séquençage séquentiel, l’isolement bactérien par culture est généralement nécessaire pour obtenir les quantités d’ADN microbien requises ^4,5,6. Cela représente un facteur limitant pour les organismes difficiles à cultiver, ceux qui ne peuvent pas être cultivés en raison d’un traitement d’échantillon diagnostique non viable ou ceux qui sont exposés à des antibiotiques pendant le traitement des patients. Parmi les exemples de micro-organismes difficiles à cultiver, citons les bactéries pathogènes sexuellement transmissibles, telles que Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum et Mycoplasma genitalium ^7,8,9. Ces espèces sont difficiles à cultiver en raison de plusieurs facteurs, notamment leur nature intracellulaire, leur fragilité, leurs exigences de croissance fastidieuses et leurs taux de réplication lents. Pour ces raisons, le développement et la mise en œuvre de techniques qui permettent le WGS malgré un faible contenu en ADN - comme c’est souvent le cas dans les échantillons de patients - sont cruciaux pour effectuer des analyses génomiques en milieu clinique.

L’enrichissement de la cible est la méthode la plus prometteuse pour le séquençage du génome lorsque l’ADN microbien est rare¹⁰. Par exemple, dans le contexte d’agents pathogènes provoquant des infections sexuellement transmissibles (IST), seule une petite fraction de l’ADN présent dans un échantillon de patient provient de l’agent pathogène. Dans le cas des infections à C. trachomatis, il a été constaté que l’ADN pathogène représente jusqu’à un maximum de 0,6 % de l’ADN total, mais les valeurs sont généralement beaucoup plus faibles¹¹. La méthode d’enrichissement de la cible consiste à capturer sélectivement l’ADN microbien d’intérêt avant le NGS. Ceci est réalisé à l’aide de sondes d’ARN marquées à la biotine spécialement conçues et complémentaires à l’ADN microbien cible. La ligature de l’adaptateur est effectuée pour générer une banque génomique, avant l’hybridation, au cours de laquelle ces sondes se lient à l’ADN microbien complémentaire. Par la suite, des billes magnétiques enrobées de streptavidine sont utilisées pour capturer les complexes d’acides nucléiques marqués à la biotine, en exploitant la forte interaction biotine-streptavidine. Enfin, une réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifie les fragments d’ADN sélectionnés. Ces étapes conceptuelles clés sont nécessaires pour comprendre la stratégie d’enrichissement de la cible. Cependant, des étapes procédurales supplémentaires, telles que le lavage et le contrôle de la qualité, sont également impliquées dans le protocole complet^10,12.

Avant de lancer le protocole de séquençage, il est important d’évaluer la quantité d’ADN d’entrée et de s’assurer que les conditions tout au long du flux de travail préservent son intégrité. Selon les recommandations du fabricant, le protocole standard exige 10 à 200 ng d’ADN dans un volume de 7 μL, ce qui correspond à une plage de concentration d’environ 1,4 à 28,6 ng/μL. Lorsque la concentration d’ADN est plus faible, il est conseillé d’utiliser une version modifiée du protocole utilisant 17 μL, permettant des concentrations comprises entre 0,6 et 11,8 ng/μL tout en maintenant la quantité d’entrée requise¹². Étant donné les faibles concentrations souvent obtenues à partir d’échantillons cliniques, nous avons systématiquement mis en œuvre la variante du protocole de 17 μL. Les performances d’hybridation et de séquençage sont associées à la qualité de l’ADN, ce qui souligne l’importance de conditions appropriées de stockage et de transport des échantillons pour préserver l’intégrité des acides nucléiques. Par conséquent, des pratiques de manipulation appropriées telles que la stabilisation des milieux de collecte, un traitement rapide, le maintien des conditions de la chaîne du froid et la réduction des cycles de gel-dégel sont des mesures importantes pour optimiser la qualité de l’ADN. En plus des concentrations d’ADN requises, la longueur des fragments d’ADN est un indicateur d’intégrité. Nous recommandons de minimiser la dégradation de l’ADN lors de la manipulation et du stockage des échantillons afin d’obtenir des fragments plus longs et d’optimiser les résultats du séquençage. Ceci est particulièrement pertinent dans les milieux cliniques, où la variabilité des méthodes de prélèvement, du milieu et de la manipulation est courante. Nous avons appliqué avec succès ce protocole à de l’ADN extrait à partir d’un milieu 2-SP et d’un milieu de transport TAAN, avec des longueurs moyennes de fragments allant jusqu’à 1 kb, comme détaillé dans les résultats représentatifs. Enfin, le séquençage réussi a été défini comme l’obtention d’une couverture génomique de plus de 95 % avec une profondeur de lecture moyenne supérieure à 10 x¹⁰.

À ce jour, l’enrichissement ciblé a été appliqué avec succès par divers groupes de recherche à un large éventail de micro-organismes et de virus, y compris des agents pathogènes causant des IST, des norovirus, des virus du bétail et des agents pathogènes des plantes 10,13,14,15,16. Cependant, jusqu’à présent, la conception de la sonde a généralement été limitée à un seul agent pathogène plutôt qu’à un panel ciblant les génomes complets de plusieurs agents pathogènes liés syndromiquement. Les cibles idéales sont les organismes avec de petits génomes conservés, qui comprennent en effet C. trachomatis, T. pallidum et M. genitalium. Bien que N. gonorrhoeae ait un génome plus diversifié et un pan-génome plus grand, les sondes pour le couvrir peuvent toujours être rationalisées dans une conception avec les trois autres bactéries. Il existe une certaine divergence de %G+C entre ces bactéries, et d’autres qui peuvent être liées de manière syndromique, ce qui signifie que les conditions peuvent avoir besoin d’être optimisées.

L’objectif de ce protocole est d’obtenir des génomes complets directement à partir d’échantillons cliniques afin de permettre des analyses phylogénétiques et épidémiologiques. Nous démontrons une stratégie nouvelle et efficace à l’aide d’un panel de sondes adaptées à C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum et M. genitalium pour récupérer des génomes complets à l’aide d’ADN extrait d’échantillons cliniques tels que des écouvillons urogénitaux et anorectals. Cette approche s’est avérée efficace et a été appliquée dans la caractérisation de l’épidémie de lymphogranulomatose vénérienne (LGV) à Buenos Aires, permettant la description d’une nouvelle lignée de C. trachomatis LGV^10,13.

La procédure d’enrichissement de la cible sera décrite, y compris l’utilisation d’une méthode de capture d’ADN disponible dans le commerce avec regroupement post-capture pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) utilisé pour obtenir des génomes complets directement à partir d’échantillons cliniques de patients diagnostiqués avec C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum et/ou M. genitalium Infections. Pour un succès optimal, il est recommandé de sélectionner des échantillons dont la valeur Ct est inférieure à 30, car des valeurs Ct plus élevées reflètent des charges pathogènes plus faibles et sont moins susceptibles de produire des génomes complets. L’extrait d’ADN de la méthode peut être obtenu à partir d’échantillons cliniques de différents types d’échantillons et de milieux de collecte. Les procédures d’extraction d’ADN peuvent être effectuées manuellement ou à l’aide de systèmes automatisés, à l’aide de kits conçus pour l’isolement d’ADN pathogène ou viral à partir d’échantillons d’écouvillons humains (voir la table des matériaux).

L’ensemble de sondes utilisé dans la procédure d’enrichissement de la cible (voir le tableau des matériaux) a été spécialement conçu pour capturer la diversité génomique de C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum et M. genitalium. Des sondes personnalisées ont été générées à l’aide de plusieurs génomes complets pour chaque espèce, optimisant ainsi la couverture de leurs pangénomes connus¹⁰. Les critères de conception comprenaient une homologie de séquence minimale de 90 % avec les séquences de référence et une fréquence de pavage de 1x-2x pour améliorer l’efficacité de la capture de cible. Pour optimiser la rentabilité, l’algorithme utilisé dans la conception des sondes a minimisé le nombre de sondes tout en maintenant une représentation génomique complète. L’ensemble final de sondes comprenait 242 000 sondes pour les modèles multiplex ciblant C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium et T. pallidum. L’ensemble du protocole d’enrichissement de la cible peut être réalisé en 2 ou 3 jours. Des indications claires des points d’arrêt sont fournies pour les options de flux de travail de deux jours et de trois jours.

ÉNONCÉ D’ÉTHIQUE
Cette étude propose des améliorations méthodologiques basées sur les protocoles ^10,13 précédemment publiés. Les procédures décrites ne portent que sur des échantillons anonymisés et n’incluent pas de données sur les patients ; Par conséquent, aucune approbation éthique spécifique n’était requise pour les aspects méthodologiques. Les résultats représentatifs ont été obtenus à partir de deux séries d’échantillons précédemment étudiés : des échantillons argentins collectés dans le cadre du protocole approuvé Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa : prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, n° d’approbation 201723), avec le consentement éclairé écrit obtenu de tous les participants ; et des échantillons finlandais anonymisés, pour lesquels aucune approbation éthique spécifique n’était requise. Avant de soumettre à la base de données de séquençage les données résultantes, les lectures humaines doivent être supprimées.

Protocole

REMARQUE : L’espace de travail doit être divisé en une zone pré-PCR (espace de travail sans amplicon) et une zone post-PCR (espace de travail de manipulation d’amplicons) pour éviter toute contamination. Sauf indication contraire explicite, toutes les étapes doivent être effectuées dans l’un des deux espaces de travail contrôlés. Tous les mélanges maîtres et les mélanges de réaction PCR doivent être préparés dans l’espace de travail exempt d’amplicum, tandis que toutes les étapes ultérieures impliquant de l’ADN amplifié doivent être effectuées dans l’espace de travail de manipulation des amplicons. Toutes les quantités de ce protocole sont calculées pour traiter huit échantillons.

1. Fragmentation de l’ADN

1. Mesurer la concentration d’ADN des extraits d’ADN à partir d’échantillons cliniques contenant de l’ADN pathogène cible (ADN) à l’aide d’une méthode sensible, précise et basée sur la fluorescence (test d’ADN double brin [ADNdb], avec 1 μL d’échantillon, avec une plage de détection allant jusqu’à 120 ng/μL ; voir le tableau des matériaux). Cette méthode de quantification est utilisée de manière cohérente tout au long du protocole chaque fois que la concentration d’ADN est mesurée.
2. Diluer chaque échantillon d’ADN à une concentration de 10 à 200 ng avec de l’eau sans nucléases, en assurant un volume final de 17 μL dans chaque bandelette de tube PCR. Pour obtenir des résultats de séquençage optimaux, utilisez la plus grande quantité possible d’ADN d’entrée dans la plage recommandée.
   REMARQUE : Dans les cas où la concentration totale d’ADN est inférieure au minimum recommandé de 10 ng dans 17 μL, une supplémentation en ADN de fond (p. ex. ADN génomique humain) peut être utilisée pour répondre aux exigences d’entrée, comme suggéré par le fabricant. Cela peut aider à stabiliser la réaction de préparation de la banque et à améliorer les performances de séquençage dans les échantillons cliniques à faible entrée.
3. Décongelez le tampon de fragmentation (5x), vortex et placez-le sur de la glace.
4. Programmez le thermocycleur conformément au tableau 1. Démarrez le programme et mettez-le immédiatement en pause.
   REMARQUE : La durée de l’étape d’incubation à 37 °C peut varier en fonction de la taille initiale du fragment d’ADN et de la longueur de lecture NGS souhaitée. Pour des échantillons d’ADN de haute qualité, un temps d’incubation de 15 min est recommandé pour obtenir des fragments de 150 à 200 pb adaptés à 2 lectures 100x, et 10 min pour obtenir des fragments de 180 à 250 pb pour 2 lectures 150x.
5. Récupérez les flacons requis pour le mélange maître de fragmentation à partir d’un stockage à -20 °C. Préparez le mélange principal en vous basant sur le tableau 2. Scellez le tube et le vortex à grande vitesse pendant 5 à 10 s. Tournez brièvement pour éliminer les bulles et gardez le mélange principal sur de la glace.
6. Ajoutez 3 μL de mélange maître de fragmentation dans chaque puits contenant 17 μL d’ADN d’entrée. Mélangez en pipetant de haut en bas 20x, scellez la bande de tube PCR, faites tourbillonner à grande vitesse pendant 5 à 10 s et tournez brièvement.
7. Placez la bande tubulaire PCR dans le thermocycleur (voir la table des matériaux) et reprenez le programme illustré dans le tableau 1 au début de l’étape 1.
8. Une fois l’étape de maintien de 4 °C atteinte, retirez la bande de tube PCR du thermocycleur et ajoutez 30 μL d’eau sans nucléase. Placez la bandelette du tube PCR sur de la glace.

Tableau 1 : Programme du thermocycleur pour la fragmentation enzymatique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Préparation du Master Mix de fragmentation Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Préparation de la bibliothèque

1. Préparation du master mix de ligature
   REMARQUE : Le mélange maître de ligature doit être préparé à ce stade car il a besoin de 30 à 45 minutes pour s’équilibrer à température ambiante.
   1. Récupérez le tampon de ligature de l’entreposage à -20 °C et décongelez-le sur de la glace. Récupérez l’ADN ligase T4 d’un stockage à -20°C, mélangez en inversant le flacon et conservez-le sur de la glace.
   2. Préparez le mélange maître de ligature conformément au tableau 3. Scellez le tube et le vortex à grande vitesse pendant 10 à 20 s, tournez brièvement et conservez-le à température ambiante pendant 30 à 45 minutes avant utilisation.
2. Réparation d’extrémité et fragments dA-tail
   1. Programmez le thermocycleur conformément au tableau 4.
   2. Récupérez la mémoire tampon de résidus de réparation d’extrémité de l’entreposage à -20 °C et décongelez-la sur de la glace. Une fois décongelé, vortex à grande vitesse, tournez brièvement. Récupérez le mélange d’enzymes de réparation d’extrémité A, mélangez en inversant le flacon et conservez sur de la glace.
   3. Préparez le mélange maître de réparation d’extrémité/dA-tailing conformément au tableau 5 (voir le tableau des matériaux). Mélangez en scellant solidement le tube et le vortex à grande vitesse pendant 10 à 20 s, tournez brièvement et gardez sur la glace.
   4. Pipeter 20 μL de mélange maître de réparation d’extrémité/dA dans chaque puits contenant 50 μL de fragments d’ADN (étapes 1.1 à 1.8). Scellez la bande de tube PCR, mélangez soigneusement par vortex à grande vitesse pendant 5 à 10 s. Essorez brièvement la bande de tube PCR et placez-la dans le thermocycleur. Reprenez le programme du tableau 4.
3. Ligature d’adaptateurs marqués MBC
   1. Une fois que le programme du tableau 4 a terminé sa dernière étape, placez la bande de tube PCR sur de la glace. Configurez le thermocycleur selon les paramètres du tableau 6. Démarrez le programme et mettez-le immédiatement en pause.
   2. Ajouter 25 μL de mélange maître de ligature à température ambiante à chaque échantillon préparé à l’étape 2.1. Scellez la bande de tube PCR, tournez pendant 5 à 10 s et tournez brièvement.
   3. Récupérez l’oligomélange d’adaptateur pour les bibliothèques marquées MBC (voir le tableau des matériaux) à partir d’un stockage à -20 °C et décongelez-le sur de la glace. Une fois décongelé, vortex à grande vitesse pendant 5 à 10 s. Tournez brièvement et restez sur la glace.
   4. Ajoutez 5 μL d’oligo-mélange d’adaptateur pour les bibliothèques marquées MBC à chaque échantillon. Scellez la bande de tube PCR et le vortex à grande vitesse pendant 5 à 10 s, tournez brièvement. Placez immédiatement la bande de tube PCR dans le thermocycleur et poursuivez l’exécution du programme comme spécifié dans le Tableau 6.
4. Nettoyage de la ligature
   1. Effectuez une purification de l’ADN à l’aide de billes magnétiques. Récupérez les billes d’un stockage à 4 °C et laissez-les atteindre la température ambiante avant de les utiliser.
   2. Préparez 4 ml d’éthanol à 70 % en utilisant de l’eau sans nucléases. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé de préparer fraîchement une solution d’éthanol à 70 % pour l’utiliser dans les étapes de nettoyage afin d’assurer un rendement optimal. Pour une préparation à 70 % d’éthanol, utilisez de l’eau sans nucléase immédiatement avant utilisation.
   3. Vortex complètement la suspension de la perle magnétique jusqu’à ce que le mélange soit uniforme et que la couleur apparaisse cohérente.
   4. Lorsque le programme du tableau 6 atteint l’étape de maintien de 4 °C, transférez la bande de tube PCR du thermocycleur à la température ambiante. Ajouter 80 μL de suspension de billes dans chaque puits. Scellez la bande de tube PCR et le vortex pendant 5 à 10 s, tournez brièvement.
   5. Incuber les suspensions de billes pendant 5 min à température ambiante. Transférez la bande de tube PCR sur un support magnétique (voir le tableau des matériaux) et attendez 5 à 10 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire.
   6. Tout en maintenant la bande de tube PCR dans le support magnétique, retirez et jetez soigneusement la solution éliminée de chaque puits, en évitant tout contact avec les billes.
   7. Avec la bande tubulaire PCR dans le support magnétique, effectuez deux lavages avec de l’éthanol à 70 % de la manière suivante : ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % à chaque échantillon. Attendez 1 min et retirez 70 % d’éthanol. Évitez de toucher les billes pendant que vous retirez la solution.
   8. Après le deuxième lavage, scellez la bande de tube PCR et essorez brièvement les échantillons pour recueillir l’éthanol résiduel. Placez la bande de tube PCR dans le support magnétique pendant 30 s.
   9. Retirez l’éthanol collecté en évitant de toucher les billes. Pour éliminer l’éthanol résiduel, retirez la bande de tube PCR du support magnétique et conservez-la descellée (idéalement dans une hotte) jusqu’à 5 min. Assurez-vous que les perles sont complètement sèches mais qu’elles ne sont pas fissurées ; Cela réduirait l’efficacité du processus d’élution.
   10. Elutez l’ADN en ajoutant 35 μL d’eau exempte de nucléases dans chaque puits d’échantillon. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 10x-15x, scellez les tubes et vortex pendant 5-10 s. Confirmez l’absence de touffes visibles. S’il y en a, vortex jusqu’à dissolution.
   11. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min. Placez la bandelette de tube PCR dans un support magnétique et attendez environ 5 min jusqu’à ce que la solution se dissipe.
   12. Retirer avec précaution le surnageant éliminé (~34 μL) de chaque puits et le transférer dans un puits correspondant dans une bandelette de tube PCR fraîche. Conservez les échantillons sur de la glace et jetez les billes.
       REMARQUE : Pour un protocole de 3 jours, cela marque la fin du jour 1. Conservez les échantillons à 4 °C pendant la nuit.
5. Amplification et double indice
   REMARQUE : Sélectionnez la paire d’amorces d’index appropriée pour chaque échantillon afin d’assurer une identification correcte pendant le séquençage. Chaque séquence d’indices est constituée d’une étiquette de 8 pb incorporée dans les amorces utilisées pour l’amplification des bibliothèques de pré-capture.
   1. Récupérez le tampon d’ADN polymérase haute fidélité avec dNTPs (5x) à partir d’un stockage à -20 °C et décongelez-le sur de la glace. Récupérez les amorces de séquençage indexées sélectionnées dans un stockage à -20 °C et conservez-les sur la glace.
      REMARQUE : Assurez-vous d’enregistrer le code-barres spécifique attribué à chaque échantillon pour une identification et une traçabilité précises tout au long du processus de séquençage.
   2. Programmez le thermocycleur conformément au tableau 7. Démarrez le programme et mettez-le immédiatement en pause.
      REMARQUE : Le fabricant recommande d’effectuer 8 à 14 cycles de PCR de pré-capture en fonction de la qualité et de la quantité d’ADN d’entrée. Dans ce protocole, 11 cycles ont été mis en œuvre selon les recommandations du fabricant, ce qui a permis d’obtenir des données de séquençage de haute qualité^10,12.
   3. Récupérez l’enzyme de fusion haute-fidélité pour l’amplification PCR à partir d’un stockage à -20 °C. Pipetez l’enzyme de haut en bas pour mélanger tout en évitant une agitation excessive, et vortex le tampon d’ADN polymérase haute fidélité pour assurer l’homogénéité. Préparez le mélange réactionnel PCR avant la capture (comme décrit dans le tableau 8). Vortex le mélange final et tournez brièvement vers le bas, gardez sur la glace.
   4. Distribuer 11 μL du mélange réactionnel de pré-capture PCR (préparé comme décrit dans le tableau 8) dans chaque puits d’échantillon contenant la banque d’ADN purifié. Ajoutez 5 μL de la paire d’amorces d’index sélectionnée à chaque réaction. Scellez la bande de tube PCR et le vortex pendant 5 s, puis tournez rapidement vers le bas.
   5. Reprenez le programme du thermocycleur comme indiqué dans le Tableau 7. Une fois que la température atteint 98 °C, placez la bande de tube PCR dans le thermocycleur et fermez bien le couvercle.
6. Nettoyage de la bibliothèque
   1. Laissez les billes magnétiques s’équilibrer à la température ambiante pendant au moins 30 minutes avant de les utiliser. Préparez 4 ml d’éthanol à 70 % en utilisant de l’eau sans nucléases. Conserver à température ambiante.
   2. Vortex complètement la suspension de la perle magnétique jusqu’à ce que le mélange soit uniforme et que la couleur apparaisse cohérente.
   3. Lorsque le programme du Tableau 7 atteint l’étape de maintien de 4 °C, transférez la bande de tube PCR du thermocycleur à la température ambiante. Ajouter 50 μL de suspension de billes à chaque échantillon. Scellez la bande de tube PCR et le vortex pendant 5 à 10 s, tournez brièvement (sans granuler les billes magnétiques).
   4. Incuber les suspensions de billes pendant 5 min à température ambiante. Transférez la bande de tube PCR sur un support magnétique et attendez 5 à 10 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire.
   5. Tout en gardant la bande de tube PCR dans le support magnétique, retirez et jetez soigneusement la solution claire de chaque puits. Évitez de toucher les billes pendant que vous retirez la solution.
   6. Avec la bande de tube PCR dans le support magnétique, effectuez deux lavages avec de l’éthanol à 70 % de la manière suivante. Ajouter 200 μL d’éthanol à 70 % à chaque échantillon. Attendez 1 min et retirez 70 % d’éthanol. Évitez de toucher les billes pendant que vous retirez la solution.
   7. Après le deuxième lavage, scellez la bande de tube PCR et essorez-la brièvement pour recueillir l’éthanol résiduel. Placez la bande de tube PCR dans le support magnétique pendant 30 s. Retirez l’éthanol résiduel en évitant de toucher les billes.
   8. Pour éliminer l’éthanol résiduel, retirez la bande de tube PCR du support magnétique et conservez-la descellée (idéalement dans une hotte) jusqu’à 5 min. Assurez-vous que les billes sont complètement sèches, mais qu’elles ne sont pas fissurées, car cela réduirait l’efficacité du processus d’élution.
   9. Éluer l’ADN de la banque en ajoutant 15 μL d’eau exempte de nucléases dans chaque tube d’échantillon. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 10x-15x, scellez la bande de tube PCR et vortex pendant 5-10 s. Confirmez l’absence de touffes visibles. S’il y en a, vortex jusqu’à dissolution.
   10. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min. Placez la bandelette de tube PCR dans un support magnétique et attendez environ 5 min jusqu’à ce que la solution se dissipe.
   11. Retirer soigneusement le surnageant éliminé (~15 μL) de chaque puits et transférer dans un puits correspondant dans une nouvelle bandelette de tube PCR. Conservez les échantillons sur de la glace et jetez les billes.
7. Contrôle qualité
   1. Mesurez la concentration d’ADN de la banque d’ADN purifiée. En raison de la sensibilité plus élevée, utilisez une méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN dans 1 μL.

Tableau 3 : Préparation du mélange maître de ligature. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Programme du thermocycleur pour la réparation finale/dA-tailing. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Préparation du mélange maître de réparation d’extrémité/dA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 Programme du thermocycleur pour la ligature. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7 : Programme de thermocycleur PCR avant la capture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 8 : Préparation du mélange réactionnel PCR avant la capture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Hybridation/capture de l’échantillon

1. Bibliothèques d’hybridation à sonder
   1. Programmez le thermocycleur conformément au tableau 9. Démarrez le programme et mettez-le immédiatement en pause.
      REMARQUE : Le fabricant recommande une température d’hybridation de 65°C. Cette température a été réduite à 62,5 °C, ce qui a permis d’obtenir de meilleurs résultats.
   2. Récupérer le tampon d’hybridation d’un stockage à -20 °C, le décongeler sur de la glace et le conserver à température ambiante jusqu’à utilisation. Récupérer le mélange d’inhibiteurs de la RNase et d’oligonucléotides dans un stockage à -20 °C et les décongeler sur de la glace. Conservez ces flacons sur de la glace jusqu’à utilisation.
   3. Calculer le volume requis pour que chaque échantillon contienne de 500 à 1000 ng de banque d’ADN, en fonction de la concentration d’ADN mesurée à l’étape 2.7. Transférez le volume calculé dans une nouvelle bandelette de tube PCR et ajustez le volume total à 12 μL avec de l’eau sans nucléases.
   4. Vortex et essorez rapidement le mélange de bloqueurs d’oligonucléotides. Ajouter 5 μL dans chaque tube d’échantillon. Scellez la bande de tube PCR et transférez-la dans le thermocycleur. Reprendre le programme de cyclage thermique décrit au tableau 9 et l’exécuter jusqu’à l’étape 3, où des réactifs supplémentaires doivent être ajoutés directement aux puits d’échantillonnage dans le thermocycleur.
   5. Préparez la solution de bloc de RNase à 25 % conformément au tableau 10. Scellez le tube et le vortex à grande vitesse pendant 10 à 20 s, tournez brièvement et maintenez sur la glace jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Évitez l’exposition prolongée de solutions contenant des sondes à la température ambiante. Conserver à température ambiante uniquement pendant les étapes de préparation.
   6. Récupérez le flacon de sonde d’un stockage à -80 °C et conservez-le dans une grille de refroidissement lorsqu’il n’est pas utilisé. Transférer dans de la glace pour la décongélation. Il est recommandé d’utiliser les sondes telles qu’elles sont fournies, mais elles peuvent être diluées si elles sont testées^10,13.
   7. Une fois que tous les réactifs énumérés au tableau 11 ont atteint la température ambiante, combiner pour préparer le mélange d’hybridation de la sonde. Mélangez la solution en tourbillonnant à grande vitesse pendant 5 s, tournez brièvement vers le bas et passez immédiatement à l’étape suivante.
   8. Lorsque le thermocycleur atteint l’étape 3 du programme décrit dans le tableau 9, ajoutez 13 μL du mélange d’hybridation de sonde à température ambiante dans chaque puits d’échantillon, en maintenant les tubes dans le thermocycleur tout au long du processus. Mélangez soigneusement en pipetant lentement de haut en bas 8x-10x.
   9. Fermez solidement la bande de tubes PCR, faites un bref vortex et faites tourner les tubes. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles, puis retournez rapidement les tubes à bande dans le thermocycleur. Vérifiez que les tubes sont correctement scellés.
   10. Reprendre le programme de cyclage thermique afin d’effectuer l’hybridation des échantillons d’ADN de la banque préparés avec les sondes. L’hybridation se poursuit du jour au lendemain
       REMARQUE : Pour un protocole de 2 jours, cela marque la fin du jour 1. Pour un protocole de 3 jours, cela marque la fin du jour 2.
2. Préparation des billes de streptavidine
   1. Récupérez les billes magnétiques enrobées de streptavidine (billes de streptavidine) d’un stockage à 4 °C. Agitez soigneusement le flacon pour vous assurer que les billes sont complètement remises en suspension. La suspension doit être homogène.
   2. Pour chaque échantillon d’hybridation, transférez 50 μL des billes entièrement remises en suspension dans des tubes individuels d’une nouvelle bande de tubes PCR.
   3. Lavez les billes de streptavidine de la manière suivante : ajoutez 200 μL de tampon de liaison dans chaque tube, mélangez en pipetant de haut en bas. Scellez les tubes, faites un tourbillon à grande vitesse pendant 5 à 10 s et tournez brièvement vers le bas. Placez la bande de tube PCR dans un support magnétique. Laissez la solution s’éclaircir pendant 5 min, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant. Répétez les étapes 2 fois, pour un total de trois lavages.
   4. Remettre les billes en suspension dans 200 μL de tampon de liaison.
3. Captation de bibliothèques hybridées
   1. Une fois que le programme de cycle thermique d’hybridation indiqué au tableau 9 a terminé sa dernière étape, transférez la bande de tube PCR à température ambiante.
   2. Transférez tout le volume (~30 μL) de chaque tube dans les tubes correspondants contenant 200 μL de billes de streptavidine prélavées. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 5x-8x, puis fermez solidement le tube de bandelette.
   3. Placez le tube à bande sur un mélangeur à plaques de 96 puits et mélangez vigoureusement à 1800 tr/min pendant 30 min à température ambiante. Assurez-vous que le liquide est bien mélangé dans les puits.
      REMARQUE : Si un mélangeur à plaques à 96 puits n’est pas disponible ou si les échantillons ne se mélangent pas efficacement, envisagez d’autres méthodes telles que la fixation horizontale des tubes à bande sur la surface supérieure du mélangeur ou l’utilisation d’un agitateur à température contrôlée (avec option de chauffage désactivée) pour assurer une agitation complète de l’échantillon.
   4. Pendant cette période d’incubation, préparer six aliquotes de 200 μL de tampon de lavage à haute température pour chaque échantillon (c.-à-d. dans ce cas, 6 x 8 tubes à bandelettes de 200 μL chacun). Scellez les tubes et incubez dans le thermocycleur maintenu à 70 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
   5. Une fois l’incubation de capture de 30 minutes terminée, faites tourner brièvement la bande de tube PCR pour recueillir le liquide. Placez la bande de tube PCR dans un support magnétique pour recueillir les billes. Attendez que la solution devienne claire (environ 2 min), puis retirez et jetez soigneusement le surnageant tout en évitant de toucher les billes.
   6. Après avoir retiré la bande de tube PCR du support magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de lavage à température ambiante. Pipeter de haut en bas jusqu’à ce que les billes de streptavidine soient complètement remises en suspension (15x-20x).
   7. Placez la bande de tube PCR dans le support magnétique et attendez que la suspension se dégage (environ 1 min). Ensuite, retirez et jetez le surnageant.
      REMARQUE : Pour garantir la spécificité de la capture, il est crucial de maintenir la suspension du cordon à 70 °C tout au long de la procédure de lavage décrite ci-dessous. Par conséquent, vérifiez que le tampon de lavage à haute température est préchauffé à 70 °C avant utilisation.
   8. Lavez les billes de streptavidine 6 fois avec un tampon de lavage à haute température aliquote et préchauffé à 70 °C comme décrit ci-dessous.
      1. Retirez le tube de la bande PCR contenant les billes du support magnétique. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage à haute température préchauffé à 70 °C dans chaque tube contenant les billes. Pipeter de haut en bas jusqu’à ce que les billes soient complètement remises en suspension (15x-20x). Scellez soigneusement la bande de tube PCR, faites un tourbillon à grande vitesse pendant 8 s et essorez rapidement sans granuler les billes.
      2. Placez le tube de la bande d’échantillon contenant les billes en suspension dans le bloc du thermocycleur à 70 °C pendant 5 min. Transférez le tube de bande du thermocycleur vers le support magnétique à température ambiante.
      3. Attendez 1 min que la solution disparaisse. Ensuite, retirez et jetez le surnageant. Répétez 5 fois pour un total de six lavages.
   9. Assurez-vous que tout le tampon de lavage a été complètement éliminé, puis ajoutez 25 μL d’eau sans nucléase dans chaque tube d’échantillon. Remettez lentement les billes en suspension en pipetant de haut en bas 8x, en essayant d’éviter la formation de bulles.
   10. Conservez la bandelette PCR contenant les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée dans les réactions PCR décrites ci-dessous.
4. Bibliothèques enrichies par amplification
   1. Programmez le thermocycleur conformément au tableau 12. Démarrez le programme et mettez-le immédiatement en pause.
      REMARQUE : Le fabricant recommande d’effectuer 10 à 16 cycles de PCR post-capture en fonction de la taille de la conception de la sonde. Dans ce protocole, 22 cycles ont été mis en œuvre, ce qui a permis de récupérer avec succès le génome des agents pathogènes^10,12.
   2. Récupérez à la fois le tampon d’ADN polymérase haute fidélité avec dNTPs (5x) et le mélange d’amorces post-capture (voir le tableau des matériaux) à partir d’un stockage, d’une décongélation et d’une conservation sur glace à -20 °C. Vortex à grande vitesse et tourne rapidement vers le bas avant utilisation.
   3. Récupérez l’enzyme de fusion haute-fidélité pour l’amplification PCR (voir Tableau des matériaux) à partir d’un stockage à -20 °C. Pour bien mélanger la solution enzymatique, pipetez le liquide de haut en bas pour éviter une agitation excessive. Ensuite, préparez le mélange réactionnel PCR post-capture en combinant tous les réactifs conformément au tableau 13. Vortex le mélange final et tournez brièvement vers le bas, gardez sur la glace.
   4. Ajouter 25 μL du mélange réactionnel PCR post-capture dans chaque tube d’échantillon (chacun contenant 25 μL d’ADN enrichi ciblé lié aux billes). Pipetez de haut en bas pour mélanger les réactions jusqu’à ce que la suspension de la bille soit uniforme. Fermez solidement la bande de tube PCR. Ne faites pas tourner la bande de tube PCR à ce stade.
   5. Placez la bande de tube PCR dans le thermocycleur et reprenez le programme du thermocycleur comme spécifié dans le tableau 12. Une fois que le programme a atteint sa dernière étape, faites tourner brièvement la bande de tube PCR. Placez la bande de tube PCR dans le support magnétique, attendez environ 2 min que la solution se dissipe.
   6. Transférez environ 50 μL de surnageant de chaque bandelette de tube PCR dans le puits correspondant d’une nouvelle bandelette de tube PCR. Le tube de bande contenant les billes de streptavidine peut être jeté.
5. Nettoyage des bibliothèques finales
   1. Laissez les billes magnétiques s’équilibrer à la température ambiante pendant au moins 30 minutes avant de les utiliser. Préparez 4 ml d’éthanol à 70 % en utilisant de l’eau sans nucléases. Conserver à température ambiante.
   2. Vortex complètement la suspension de la perle magnétique jusqu’à ce que le mélange soit uniforme et que la couleur apparaisse cohérente.
   3. Ajouter 50 μL de suspension de billes dans chaque tube d’échantillon. Scellez les tubes et le vortex pendant 5 à 10 s, faites tourner brièvement (sans granuler les billes magnétiques).
   4. Incuber les suspensions de billes pendant 5 min à température ambiante. Transférez la bande de tube PCR sur un support magnétique et attendez 5 à 10 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire.
   5. Tout en gardant la bande de tube PCR dans le support magnétique, retirez et jetez soigneusement la solution claire de chaque puits. Évitez de toucher les billes pendant que vous retirez la solution.
      1. Avec la bande tubulaire PCR dans le support magnétique, effectuez deux lavages avec de l’éthanol à 70 % de la manière suivante : ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % à chaque échantillon. Attendez 1 min pour permettre aux billes perturbées de se déposer et retirez l’éthanol à 70 %. Évitez de toucher les billes pendant que vous retirez la solution.
   6. Après le deuxième lavage, scellez les tubes et essorez brièvement la bande de tube PCR pour recueillir l’éthanol résiduel. Placez la bande de tube PCR sur le support magnétique pendant 30 s.
   7. Pour éliminer l’éthanol résiduel, retirez la bande de tube PCR du support magnétique et conservez-la descellée (idéalement dans une hotte) pendant un maximum de 5 min. Assurez-vous que les billes sont complètement sèches mais qu’elles ne sont pas fissurées, ce qui réduirait l’efficacité du processus d’élution.
   8. Éluer l’ADN de la banque en ajoutant 25 μL d’eau sans nucléase dans chaque tube d’échantillon. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 10x-15x, scellez la bande de tube PCR et vortex pendant 5-10 s. Confirmez l’absence de touffes visibles.
   9. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min. Placez la bandelette de tube PCR dans un support magnétique et attendez environ 5 min jusqu’à ce que la solution se dissipe.
   10. Retirer avec précaution le surnageant éliminé (environ 25 μL) de chaque puits et le transférer dans un puits correspondant dans une bandelette de tube PCR fraîche. Conservez les échantillons sur de la glace et jetez les billes.
6. Contrôle qualité
   1. Mesurez la concentration d’ADN de la banque d’ADN purifiée. Pour obtenir une meilleure sensibilité, utilisez une méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN dans 1 μL.
7. Séquençage de nouvelle génération
   REMARQUE : En fonction de la capacité de la plateforme utilisée et de la quantité de données de séquençage requise par échantillon, les banques indexées de plusieurs lots peuvent être multiplexées en une seule séquence de séquençage.
   1. Avant de regrouper les échantillons, ajustez la concentration d’ADN de chaque échantillon à 5 ng/μL. Regroupez les banques en quantités équimolaires pour maintenir une représentation équilibrée.
   2. Séquencez les bibliothèques préparées à l’aide d’un système de séquençage à lecture courte à haut débit avec, par exemple, une configuration de lecture appariée de 150 pb (voir la Table des matériaux).

Tableau 9 : Programme d’hybridation des thermocycleurs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 10 : Préparation de la solution de bloc de RNase. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 11 : Préparation du mélange d’hybridation de la sonde. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 12 : Programme de thermocycleur PCR post-capture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 13 : Préparation du mélange réactionnel PCR post-capture. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Résultats

Une étude sur l’épidémie de LGV de C. trachomatis à Buenos Aires, en Argentine, a montré de nouvelles caractéristiques dans les échantillons, à savoir, 10 substitutions de nucléotides dans le gène ompA par rapport au génotype L1 ompA, et une séquence inhabituelle de typage MLST (Multi-Locus Sequence Typage) de type 2 17,18,19. Notre objectif était d’étudier les génomes de ces échantillons cliniques, en les plaçant dans le contexte de données mondiales. Pour y parvenir, nous avons comparé les performances d’une approche d’enrichissement cible avec le séquençage métagénomique direct pour le séquençage génomique du séquençage génomique des IST bactériennes à partir d’échantillons cliniques, dans le but de surmonter les défis posés par de faibles charges bactériennes et une abondance d’ADN humain et microbien.

L’ADN utilisé provenait soit d’échantillons d’écouvillonnage rectal prélevés entre 2017 et 2023 à Buenos Aires, en Argentine, placés dans un milieu 2-SP (milieu saccharose-phosphate) complété par 2 % de sérum de veau fœtal (SCF) et d’antibiotiques (gentamicine 25 μg/mL, vancomycine 0,5 mg/mL et amphotéricine B 2,5 μg/mL) et stocké à −80 °C, soit dans un ensemble urétral, anorectal, et des écouvillons pharyngés prélevés à l’Hôpital universitaire de Zurich (USZ) dans un tampon TAAN (Nucleic Acid Amplification Tests). L’ADN des échantillons de Buenos Aires a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction manuelle à base de silice, tandis que l’ADN des échantillons de l’USZ a été extrait à l’aide d’un système automatisé à base de billes magnétiques.

Tous les échantillons cliniques inclus dans cette étude ont été confirmés positifs par un test PCR multiplex en temps réel développé en interne (voir la table des matériaux) avec des valeurs seuils de cycle (Ct) qPCR allant comme suit : C. trachomatis : 17-34, N. gonorrhoeae :  24-31, T. pallidum : 27-36 et M. genitalium :  30-37. La concentration d’ADN a été quantifiée à l’aide d’un test fluorométrique à haute sensibilité avant le séquençage afin de caractériser le matériau d’entrée des échantillons cliniques (voir le tableau des matériaux).

Pour comparer le séquençage métagénomique direct à l’enrichissement ciblé, nous avons utilisé 32 échantillons, dont 29 étaient positifs pour C. trachomatis, neuf pour N. gonorrhoeae, cinq pour T. pallidum et trois pour M. genitalium. Le séquençage métagénomique direct n’a pas abouti à des génomes complets et a en effet à peine atteint des données cibles supérieures à la ligne de base observées dans les échantillons négatifs. L’enrichissement de la cible avec hybridation à 65 °C a donné des résultats nettement meilleurs pour chaque agent pathogène, et des génomes positifs ont été obtenus dans de nombreux cas à partir de cette méthode (Figure 1).

Afin d’évaluer la sélection optimale d’échantillons pour l’enrichissement de la cible, nous avons évalué la relation entre les valeurs diagnostiques de la qPCR Ct et l’efficacité de la récupération du génome, mesurée par le pourcentage de lectures sur la cible ( %OTR). Cette mesure reflète la proportion de lectures de séquençage qui correspondent au génome de l’organisme cible et est couramment utilisée pour évaluer les performances d’enrichissement. Une corrélation significative a été observée entre la charge pathogène et le succès du séquençage pour C. trachomatis, avec un seuil Ct pour le succès autour de Ct30. Bien que les données sur les autres agents pathogènes cibles soient limitées, une tendance similaire a été observée, où le succès du séquençage du génome s’est produit principalement dans des échantillons dont la charge pathogène était inférieure à Ct30 (figure 2).

Cette expérience avec une température d’hybridation de 65 °C a donné des taux de réussite du séquençage du génome avec un enrichissement cible de 75 % à 80 % pour C. trachomatis, N. gonorrhoeae et T. pallidum, sur la base d’échantillons avec des valeurs Ct inférieures à 30. Les trois échantillons positifs à M. genitalium avaient des valeurs Ct de 30 à 37 et ont atteint une couverture génomique et une profondeur de lecture moyennes plus faibles. Afin d’améliorer ces résultats, nous avons expérimenté la réduction de la température d’hybridation, ce qui améliore l’hybridation en raison de la faible teneur en %G+C dans le génome de M. genitalium . En utilisant des températures d’hybridation plus basses, telles que la température maintenant recommandée de 62,5 °C, nous pouvons améliorer la récupération des génomes de M. genitalium sans compromettre la récupération d’autres génomes (Figure 3). Ces résultats démontrent que l’enrichissement des cibles est une approche efficace pour obtenir des informations génomiques précieuses à partir d’échantillons cliniques et peut être adapté à un large éventail de génomes, également dans le cadre d’une conception basée sur un panel.

L’analyse phylogénétique des génomes de C. trachomatis enrichis avec succès a montré que la majorité des échantillons de Buenos Aires se regroupent dans le clade du génotype L2b de l’ompA, suggérant une lignée réussie avec une circulation mondiale. L’analyse a également révélé la présence d’une nouvelle lignée distincte en Argentine, à l’origine de la LGV. Les échantillons de ce clade diffèrent d’environ 600 SNP des autres lignées LGV, et cette lignée est proposée comme génotype ompA L4 (Figure 4). Le tableau supplémentaire 1, 2 et 4 fournit une description détaillée des échantillons utilisés.

Ces résultats soulignent la valeur de l’enrichissement des cibles dans l’étude de la diversité des agents pathogènes et démontrent un haut degré de succès du séquençage du génome à partir d’échantillons cliniques.

Figure 1 : Enrichissement des génomes par enrichissement cible par rapport au séquençage métagénomique direct. Le pourcentage de lectures sur la cible ( %OTR), défini comme le pourcentage de lectures de séquençage correspondant au génome de l’organisme cible, indique le degré d’enrichissement atteint avec l’enrichissement de la cible. La ligne représente la médiane de tous les points de données, et la case indique l’écart interquartile (IQR) de 50 %. Les couleurs des points de données correspondent à la source de l’échantillon : bleu pâle pour l’Argentine et rouge pour la Suisse. Le succès du séquençage du génome, défini comme une couverture >95 % et une profondeur de lecture moyenne >10, est représenté par de grands points, tandis que l’échec est indiqué par de petits points. Notez les différentes échelles sur l’axe des y. Abréviations : CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Cette figure a été modifiée au lieu de¹⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Corrélation du %OTR de l’enrichissement de la cible avec les valeurs diagnostiques de qPCR Ct. Les couleurs des points de données représentent la source de l’échantillon : bleu pâle pour l’Argentine et rouge pour la Suisse. Le succès du séquençage du génome, défini comme une couverture de >95 % et une profondeur de lecture moyenne de >10, est indiqué par de grands points, tandis que l’échec est représenté par de petits points. Notez les différentes échelles sur l’axe des y. Abréviations : CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Cette figure a été modifiée au lieu de¹⁰. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de la température d’hybridation sur la récupération de génomes complets chez tous les pathogènes bactériens IST dans dix échantillons. L’ADN humain dans la gamme de ceux des échantillons cliniques a été enrichi avec des concentrations connues d’ADN bactérien cible séparément (unique) et également complètement pour représenter un échantillon avec plusieurs infections (regroupé). Deux expériences, chacune avec les cinq agents pathogènes/combinaisons, ont été réalisées : 0,01 % et 0,03 % pour représenter le pourcentage approximatif d’ADN de chaque micro-organisme par rapport à l’ADN total dans l’échantillon (l’ADN restant correspond à l’ADN humain). La récupération de M. genitalium est améliorée à des températures plus basses. C. trachomatis L’ADN a été enrichi à une faible concentration ; d’autres expériences montrent que les températures n’ont pas affecté la récupération des génomes de C. trachomatis (données non présentées). Abréviations : CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Phylogénie ajustée à la recombinaison des souches LGV d’Argentine. L’analyse comprend tous les génomes LGV disponibles avec des données publiées. Les métadonnées affichées à droite de la phylogénie comprennent des échantillons de patients en double, l’analyse bayésienne de la structure de la population (BAPS ; cluster = clade, le cluster polyphylétique BAPS 6 représentant la diversité génétique de la population), la méthode de séquençage du génome (données de cette étude), le génotype ompA, le pays et l’année, comme indiqué dans la légende en haut à gauche. Les données manquantes sont indiquées en blanc. Les noms des génomes de cette étude sont surlignés en bleu clair pour l’Argentine et en bleu foncé pour la Finlande (non obtenus par enrichissement de la cible). Ces couleurs sont utilisées uniquement pour distinguer les génomes générés dans cette étude. Les valeurs d’amorçage de 1000 amorçages ultrarapides sont affichées en pourcentage sur les principales branches. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Description des matériaux, des réactifs, des instruments et de l’équipement utilisés dans l’étude. Le tableau comprend des renseignements détaillés sur le nom commercial, le fabricant et le numéro de catalogue des composants utilisés pour l’extraction de l’ADN, la préparation de banques, l’enrichissement de cibles et le séquençage. Il comprend également des articles utilisés pour les tests qPCR internes et les procédures générales de biologie moléculaire. Des alternatives équivalentes peuvent être utilisées pour les articles marqués d’un astérisque (*). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La génération de données complètes sur le génome bactérien à partir d’échantillons cliniques est particulièrement difficile. Pourtant, nous avons besoin de ces données pour obtenir des informations sur les clones en circulation et pour étudier les profils de résistance aux antimicrobiens, en particulier chez les bactéries exigeantes et difficiles à cultiver. En utilisant des méthodes alternatives telles que le séquençage profond ou le séquençage adaptatif avec Oxford Nanopore Technologies, il est impossible d’obtenir suffisamment de données pour l’analyse du séquençage du génome entier. Dans des cas tels que les échantillons d’IST, l’enrichissement de la cible est la technique optimale pour accéder au génome complet, et cette méthode peut être utilisée sur un panel d’agents pathogènes bactériens des IST. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une procédure bon marché, les résultats qu’elle peut offrir ne peuvent être obtenus d’une autre manière¹⁰.

Les échantillons appropriés doivent être soigneusement sélectionnés, idéalement pour répondre à des questions pertinentes et importantes dans le diagnostic et la recherche. Le support utilisé pour la collecte ne joue pas nécessairement un rôle critique, avec des séquences réussies obtenues à partir de milieux 2-SP et TAAN. Le stockage des échantillons est important, dans le but de maintenir l’intégrité de l’ADN. Le facteur le plus important s’est avéré être la charge diagnostique, visant des valeurs Ct approximatives inférieures à Ct30. Pour les échantillons dont les valeurs Ct sont supérieures à 30, le succès du séquençage complet du génome est moins probable, mais des données partielles peuvent fournir des informations pertinentes dans certains cas.

La procédure n’est pas anodine, elle implique de nombreuses étapes, notamment des cycles de PCR, l’hybridation et de nombreux lavages de billes. Une attention particulière à la procédure est nécessaire pour des résultats optimaux. Les étapes critiques du protocole - fragmentation de l’ADN, hybridation avec des sondes de capture et capture à base de billes magnétiques avec lavage - nécessitent une exécution minutieuse et une manipulation appropriée. Le protocole peut être appris par les chercheurs et les techniciens après quelques tentatives. Dans les premiers tours, tout en apprenant, le protocole de 3 jours peut être un avantage ; Avec des utilisateurs plus expérimentés, le protocole de 2 jours peut accélérer les résultats. Comme les réactifs sont chers, il peut être utile d’effectuer un test sans les composants coûteux, par exemple les sondes. Pour d’autres ensembles d’appâts, la température d’hybridation peut être ajustée, ce qui peut améliorer la sensibilité ou la spécificité de l’enrichissement. Si suffisamment de données sont générées et qu’une proportion considérable de doublons de PCR est observée, le nombre de cycles de PCR avant et après la capture peut également être ajusté.

Les données obtenues à partir de ces expériences peuvent être utilisées pour le typage, avec l’extraction du MLST et d’autres cibles pertinentes. Il peut être analysé dans un contexte épidémiologique, à l’échelle mondiale ou locale, par rapport aux génomes pertinents pour obtenir des informations contemporaines. L’analyse de la recombinaison et des éléments mobiles à travers le génome déduit également des changements au fil du temps et sous la pression sélective, ainsi que des co-infections possibles. Avec suffisamment de données et de métadonnées associées, des calculs temporels peuvent être effectués, et l’inférence des ancêtres de caractéristiques et de lignées spécifiques, ainsi que des voies et mécanismes de transmission possibles. Toutes ces avancées dans notre connaissance d’un groupe important d’agents pathogènes peuvent éclairer les stratégies de santé publique. Notre protocole et nos résultats représentatifs montrent l’utilisation d’ensembles de sondes cibles de panel syndromique, qui sont efficaces dans les échantillons d’IST bactériennes et pourraient être étendus à d’autres types d’échantillons.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette 8 canaux 0,5-10 & micro ; L	Eppendorf	3125000010	Eppendorf Research  ; Plus, 8 canaux, 0,5-10 et micro ; L, gris moyen, volume variable.
Pipette 8 canaux 10-100 & micro ; L	Eppendorf	3125000036	Eppendorf Research  ; Plus, 8 canaux, 10-100 et micro ; L, jaune, volume variable.
Adaptateur Oligo Mix pour les bibliothèques étiquetées MBC	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Système automatisé d’extraction d’acides nucléiques à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN viral/pathogène	Qiagen	937036 (Kit) / 9001297 (Instrument)	Instrument QIAsymphony SP/AS utilisé avec le kit QIAamp DSP Virus/Pathogen pour l’extraction automatisée de l’ADN.
Tampon de liaison	Agilent Technologies	5190-9687	Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post-PCR).
Kit d’extraction d’ADN et instrument automatisé	Société de recherche Zymo	D3024/D3025	Kit Quick-DNA Miniprep utilisé pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’échantillons cliniques. Compatible avec les flux de travail manuels ou automatisés.
Réparation d’extrémité - Un mélange d’enzymes de résidus	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Tampon de résidus de réparation d’extrémité	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Éthanol	VWR Chemicals BDH	20816.298	Éthanol absolu &ge ; 99,5 % Ph. Eur., USP
Fluorimètre avec dosage de l’ADNdb à haute sensibilité / Méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	Q33238, Q33231	Fluorimètre Qubit 4 avec kit de dosage haute sensibilité (HS) 1X dsDNA.
Tampon de fragmentation	Agilent Technologies	5191-4080	Fait partie du kit de fragmentation enzymatique SureSelect avec le nom ''5X Fragmentation Buffer''.
Fragmentation Enzyme	Agilent Technologies	5191-4080	Fait partie du kit de fragmentation enzymatique SureSelect.
Tampon d’ADN polymérase haute fidélité	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (Pre PCR) avec le nom ''Herculase II Buffer''.
Tampon d’ADN polymérase haute fidélité avec dNTP (5X)	Agilent Technologies	5190-9687	Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Herculase II Buffer''.
Enzyme de fusion haute-fidélité pour l’amplification par PCR	Agilent Technologies	5191-5688	Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Herculase II''.
Tampon de lavage à haute température	Agilent Technologies	5190-9687	Fait partie du kit d’enrichissement cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Wash buffer 2''.
Tampon d’hybridation  ;	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Amorces de séquençage indexées	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie des paires d’amorces d’indice SureSelect XT HS2 1-96 pour ILM (pré PCR).
Test PCR multiplex en temps réel en interne	Tib Molbiol	N/A	Test développé et accrédité en interne basé sur les kits Lightmix pour la détection des IST
Tampon de ligature	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Perles magnétiques pour le nettoyage	Agilent Technologies	5191-5740	Perles SureSelect DNA AMPure XP.
Support magnétique	Matériel de laboratoire Permagen	MSRLV08	0.2mL PCR 8 Strip Séparateur Magnétique 5 µ ; L ~ 0,2 ml de volume.
Séquençage de nouvelle génération (NGS) : système de séquençage à lecture courte à haut débit	Illumina, Inc.	N/A	Séquençage apparié de 150 pb (PE150) effectué sur les plates-formes Illumina NextSeq1000 et MiSeq.
Eau sans nucléases	BioConcept	3-07F04-H	Eau pour la biologie moléculaire, sans ADN/DNAse/RNase, stérile, sans inhibiteur de PCR.
Mélange de bloqueurs d’oligonucléotides  ;	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Bande de tube PCR	avantor, livré par VWR  ;   ;	732-3608	Bandelettes de tubes PCR avec capuchons plats attachés.
Mélange d’apprêt post-capture	Agilent Technologies	5190-9687	Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post-PCR).
Sonde d’ARN	Agilent Technologies	5191-6916  ;	Sonde SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, par exemple Design ID S3465164).
Bloqueur de RNase	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).
Tampon de lavage à température ambiante	Agilent Technologies	5190-9687	Kit d’enrichissement cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Wash buffer 1''.
Perles de streptavidine	Agilent Technologies	5191-5742	Perles de streptavidine SureSelect.
T4 ADN ligase	Agilent Technologies	5500-0147	Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré PCR) .
Méthode d’enrichissement de la cible / méthode de capture d’ADN	Agilent Technologies	Référence G9983-90000	Kit d’ADN SureSelect XT HS2 avec préparation de bibliothèque, enrichissement rapide de la cible et flux de travail de regroupement post-capture. Version du protocole F0, mai 2023. Pour la plate-forme NGS d’Illumina
Sonde d’enrichissement de la cible pour C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum et M. genitalium	Agilent Technologies / Laboratoire d’Enrichissement en Microbiologie (IMM, UZH)	Design ID S3465164	Kit de sondes conçu sur mesure (~242 000 sondes) pour la capture multiplex de quatre agents pathogènes IST. Conception basée sur plusieurs génomes de référence.
Thermocycleur	Thermofischer	4375305	Thermocycleur Veriti à 96 puits.