Un microscope Raman multimodal à grande transformée de Fourier

Résumé

Un microscope à transformée de Fourier à large champ, basé sur un interféromètre biréfringent compact et ultra-stable, permet l’acquisition parallèle des spectres pour tous les pixels d’un détecteur 2D. L’approche dans le domaine temporel permet de démêler la photoluminescence et les signaux Raman, et permet un cartographie Raman rapide (~5 ms/pixel) avec une résolution spatiale de ~1 μm et une résolution spectrale de 23 ^cm-1 .

Résumé

La microscopie Raman est une technique puissante permettant de déterminer la composition chimique d’un échantillon. Le principal défi des microscopes Raman spontanés de pointe, basés sur la détection ponctuelle du domaine fréquentiel à balayage, est l’acquisition de cartes Raman de vastes zones en raison de temps de séjour des pixels généralement longs (0,1-1 s). Le microscope à transformée de Fourier (FT) à large champ présenté ici permet la mesure rapide d’échantillons étendus avec une résolution spatiale de ~1 μm et une résolution spectrale de ~23 ^cm-1 . Il est basé sur un interféromètre biréfringent à chemin commun ultra-stable et compact, ajouté le long du trajet de détection d’un microscope commercial, ce qui permet l’acquisition parallèle de spectres pour tous les pixels d’un détecteur 2D, réduisant significativement le temps de mesure (10 à 100 fois plus rapide). L’approche dans le domaine temporel répond efficacement à une autre limitation de la technique du domaine fréquentiel : démêler le signal Raman du fond photoluminescence, dans lequel le signal Raman peut être enfoui. Ce protocole décrit comment effectuer des mesures hyperspectrales avec un microscope commercial amélioré : l’alignement du schéma d’illumination, les critères pour choisir les paramètres de mesure, et l’analyse des données pour récupérer et étudier les spectres.

Introduction

L’imagerie spectrale est une technique qui fournit à la fois des informations spectrales et spatiales et a été appliquée à divers domaines, de la^{microscopie 1} à la^{télédétection 2}. L’imagerie multispectrale et hyperspectrale est distinguée selon que quelques bandes spectrales distinctes ou un spectre continu sont enregistrées pour chaque pixel d’un capteur 2D. L’imagerie Raman est une implémentation particulière de l’imagerie spectrale.

La microscopie à diffusion Raman est une technique puissante permettant de mesurer les fréquences vibratoires ν_R d’un système. Les modes vibrationnels sont associés aux liaisons chimiques, et la spectroscopie^{Raman 3} permet donc d’étudier la composition chimique des échantillons en^{biologie 4} et en sciences des^{matériaux 5}. En spectroscopie Raman spontanée, l’échantillon est illuminé par un rayonnement monochromatique à la fréquence _ν0, appelé pompe. Une fraction de la lumière de la pompe, interagissant avec les modes vibrationnels, peut subir une diffusion inélastique, entraînant des photons à des fréquences ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R, où ν_R est la fréquence vibratoire moléculaire à l’intérieur de l’échantillon. La lumière diffusée à plus faible énergie (ν_S) est appelée rayonnement Stokes, tandis que celui à plus haute énergie (ν_AS) est le rayonnement anti-Stokes. À l’équilibre thermique, la plupart des molécules occupent des états d’énergie plus bas, d’où les composants anti-Stokes nettement plus faibles que ceux de Stokes. Pour cette raison, la microscopie de diffusion Raman détecte généralement les photons de Stokes. Comme les molécules et les solides possèdent plusieurs modes vibratoires, le spectre Raman se caractérise par des bandes distinctes qui forment collectivement une signature chimique unique, permettant l’identification et l’analyse des matériaux. Le principal défi de cette approche est la section efficace extrêmement faible de la diffusion spontanée Raman, avec seulement un photon sur plus de^{10 9-10 12} subissant ce processus.

Dans une configuration standard d’un microscope à diffusion Raman, la lumière d’excitation est étroitement focalisée sur un point de l’échantillon. Après avoir rejeté les photons de pompe diffusés élastiquement (généralement avec des filtres spectraux), la lumière restante est collectée et caractérisée avec un spectromètre en domaine fréquentiel (par exemple, réseau dispersif) ; La résolution spectrale de ces dispositifs peut atteindre ~0,5-1 ^cm-1. La mesure est répétée pour chaque point (x,y) dans le champ de vision (FOV) d’un échantillon à l’aide d’une méthode appelée balayage ponctuel ou ^{raster 6}. Il y a deux problèmes principaux dans cette approche : (1) la faible section efficace de la diffusion Raman spontanée nécessite généralement de longs temps d’intégration (0,1-1 s) pour collecter suffisamment de photons pour chaque pixel du spectromètre, donc la carte Raman d’un échantillon étendu peut nécessiter de longs temps de mesure ; (2) l’excitation par la lumière de la pompe engendre également la photoluminescence (PL), qui chevauche le signal Raman spontané et peut souvent le submerger.

Pour augmenter la vitesse d’acquisition, il est possible d’adopter l’approche du balayage^{de la ligne 7} , dans laquelle la pompe est focalisée le long d’une ligne du champ de vision (par exemple à la coordonnée x) et le signal collecté (diffusion PL ou Raman) est dispersé par un spectromètre équipé d’un capteur 2D, produisant pour la coordonnée donnée x un jeu de données 2D dans lequel un axe correspond au spectre et l’autre à une coordonnée spatiale y. Néanmoins, cette mise en œuvre souffre encore des pertes importantes introduites par la fente d’entrée du spectromètre, dont la largeur étroite offre une meilleure résolution spectrale, mais limite également la quantité de lumière collectée.

Une configuration à champ large peut être plus adaptée pour réduire le temps de mesure : avec cette méthode, une grande zone de l’échantillon est illuminée et le spectre est acquis simultanément pour tous les pixels d’un capteur 2D. Dans ce cas, l’information spectrale peut être collectée en utilisant soit un ensemble de filtres^{passe-bande 8}, soit un filtre spectral^{accordable 9} devant une caméra monochrome. De plus, cette méthode est basée sur une approche dans le domaine fréquentiel et n’acquiert qu’un nombre discret de bandes spectrales.

Une méthode alternative pour mesurer un spectre est l’approche de la transformée de Fourier (FT). Il s’agit d’une technique dans le domaine temporel basée sur le théorème¹⁰ de Wiener-Kintchin, qui affirme que la densité spectrale de puissance d’un signal est la transformée de Fourier de son autocorrélation temporelle. En optique, cela s’obtient en pratique en générant deux répliques différées de la forme d’onde avec un interféromètre. Leur interférence est mesurée par un détecteur en fonction du délai relatif, donnant lieu au soi-disant interférogramme¹¹. L’approche FT est largement utilisée pour mesurer les spectres dans la région spectrale infrarouge, où elle est appelée spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR⁾¹². La FTIR est couramment utilisée pour mesurer le spectre d’absorption des transitions vibrationnelles dans la gamme spectrale du moyen infrarouge (~2,5−25 μm de longueur d’onde).

L’approche de la CF dans le domaine temporel offre certains avantages par rapport aux spectromètres dispersifs conventionnels : elle atteint un débit supérieur grâce à l’absence de fentes (avantage etendue de Jacquinot¹²) ; Il offre une résolution spectrale flexible, qui ne dépend que de la plage de balayage. De plus, elle convient bien aux configurations à grand champ : en fait, lorsqu’on utilise un détecteur 2D, la méthode mesure un interférogramme pour chaque pixel en parallèle, permettant l’enregistrement simultané de spectres continus sur tous les pixels. En revanche, un système d’imagerie FT doit répondre à deux exigences complexes : (1) le délai relatif entre les deux répliques de lumière doit être contrôlé à une petite fraction du cycle optique ; (2) le décalage de phase entre les rayons qui interfèrent dans un seul pixel doit être limité pour garantir une bonne cohérence et donc un contraste élevé. Certaines solutions ont été proposées sur des interféromètres à trajet^{commun de 13, 14}, ou presque¹⁵, mais elles sont plutôt encombrantes ou ont une résolution spectrale supérieure à 100 ^cm-1.

Dans ce travail, un nouveau microscope à champ large est décrit, permettant l’acquisition d’images par photoluminescence et diffusion Raman. Le bloc innovant de ce système est un interféromètre biréfringent à chemin commun compact et ultra-stable, appelé Translating-Wedge-based Identical Pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Il permet des analyses de délai de centaines de cycles optiques avec une précision de phase d’une petite fraction du cycle optique lui-même et une grande stabilité. Les deux répliques de lumière présentent des polarisations orthogonales et voyagent collinairement à travers le même chemin commun, elles ne sont donc pas affectées par les fluctuations de longueur de chemin, typiques d’un interféromètre à double faisceau. Le schéma, montré dans l’insert de la Figure 1, se compose de deux blocs de cristal biréfringent avec des axes optiques orthogonaux : l’un (B₂) de longueur fixe et l’autre (B₁) divisé en deux coins pouvant être déplacés dans la direction commune de l’hypoténise. La lumière incidente est polarisée par_{P 1} à 45° par rapport à l’axe optique du cristal biréfringent, de sorte que la moitié de l’énergie se trouve selon la polarisation ordinaire, et l’autre moitié le long de la polarisation extraordinaire. Lors du déplacement le long des blocs biréfringents, les deux composantes orthogonales accumulent un délai relatif qui est finement ajusté en variant l’épaisseur totale du bloc B₁ en modifiant l’insertion du coin. Le second polariseur P₂ projette les composantes du champ vers une polarisation linéaire commune afin de les interférer. Le délai τ entre les répliques dépend du déplacement du coin x le long de l’hypoténuse commune comme (Équation 1), avec c vitesse de la lumière, α angle d’apex des coins, Δn = n_{e-n o} différence entre les indices de réfraction ordinaire et extraordinaire (biréfringence). Puisque la résolution spectrale Δv est inversement proportionnelle à la plage de balayage T=|T_{2-T 1}|, avec T₁, T₂ comme retard initial et final de l’interférogramme, la haute résolution spectrale requise par la spectroscopie Raman exige une grande biréfringence et des traductions en coin long. Parmi les cristaux biréfringents les plus courants, YVO₄ (orthovanadate d’yttrium) est particulièrement adapté à son Δn élevé et à sa plage de transparence dans l’infrarouge visible-proche. Les coins sont conçus avec un angle d’apex de 10°, ainsi, avec une longueur de balayage de 15,3 mm, l’interféromètre peut infliger un délai de 2500 fs à 600 nm, obtenant une résolution spectrale de 23 ^cm-1, sur toute la plage spectrale d’intérêt (la sensibilité de la caméra en silicium constitue la limite supérieure). Ce travail présentera la stratégie pour un réglage approprié de l’échantillonnage de l’interférogramme (c’est-à-dire la plage d’étapes et de balayage) afin d’atteindre la résolution spectrale souhaitée et de traiter le fond haut débit, en démêlant le signal Raman de la photoluminescence.

Comme décrit par Candeo et ^al.17, ce spectromètre biréfringent peut être couplé à un microscope optique commercial pour effectuer des mesures hyperspectrales. Les exigences sont les suivantes : un corps de microscope optique reconfigurable, un interféromètre biréfringent TWINS, une caméra monochrome à faible bruit (par exemple, CCD ou sCMOS), et une source laser à bande étroite. Pour ce dernier, les longueurs d’onde typiques d’excitation pour Raman et la spectroscopie de fluorescence sont 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm et 785 nm. Bien que les lasers à haute pureté spectrale, comme celui listé dans le Table of Materials, soient le meilleur choix, un laser avec une largeur de raie plus large, par exemple ~0,1 nm, peut également être utilisé, compte tenu de la résolution spectrale limitée de l’instrument. Le microscope est amélioré en plaçant le TWINS sur le chemin de détection, entre la lentille tubulaire et le détecteur monochrome. Cette configuration offre un délai de chemin uniforme à travers le champ de vision et un contraste moyen de 55 %. Le chemin d’excitation est conçu pour obtenir une illumination uniforme de l’échantillon : en pratique, la pointe de sortie d’une fibre multimode à gros noyau est imagée sur le plan de l’échantillon. En utilisant un brouilleur mécanique, les modes sont fortement couplés dans le noyau de la fibre, produisant un profil plat sur le plan échantillon. De plus, une bobine mobile vibrante compense le motif de taches typique du rayonnement monochrome. Une caractérisation de cet enluminement haut-de-forme est présentée dans la Figure supplémentaire 1. Le faisceau est focalisé sur l’échantillon par un objectif corrigé à l’infini, qui collecte également la lumière Raman rétrodiffusée et luminescence vers le chemin de détection. Les filtres nécessaires pour rejeter l’illumination seront détaillés.

Pour montrer comment mesurer les caractéristiques spectrales à large bande et à bande étroite avec ce microscope hyperspectral, la luminescence et la diffusion Raman sont mesurées pour un échantillon test spécifiquement sélectionné à des fins d’illustration. L’échantillon se compose d’un mélange de trois pigments en poudre avec des spectres Raman bien connus : deux polymorphes de blanc de titane (_{TiO 2}), à savoir rutile et anatase, et jaune sulfure de cadmium (CdS). Cependant, la même procédure peut être utilisée pour un éventail plus large d’applications, de la science des matériaux à la biologie.

Le cadre de cet article est d’illustrer les étapes pour effectuer une mesure hyperspectrale, tandis que l’assemblage et l’alignement de l’interféromètre TWINS sont détaillés par Candeo et ^al.17. Par conséquent, un expérimentateur intéressé devrait partir d’un interféromètre préassemblé basé sur cette technologie.

Le protocole commence par la préparation de l’échantillon et la manière de configurer le microscope pour exciter et collecter les photons de diffusion Raman et PL. Ensuite, les paramètres de balayage (longueur du balayage, étape d’échantillonnage) et les paramètres d’acquisition (temps d’exposition, binning matériel) sont définis selon les exigences du signal étudié. Enfin, le pipeline de post-traitement sera présenté, détaillant la procédure pour récupérer le spectre à chaque pixel (hypercube spectral, Figure 2B) à partir du jeu de données temporel acquis (hypercube temporel, Figure 2A), et en détaillant les algorithmes de réduction du bruit et d’analyse spectrale avancée. L’ensemble du flux de travail est montré à la Figure 3.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de l’échantillon

ATTENTION : Portez des gants en latex pendant cette préparation car le pigment CdS est toxique, surtout lorsqu’il est inhalé.

1. Utilisez un grattoir pour déposer 20 mg de chaque poudre de pigment sur une balance de précision, obtenant ainsi un rapport de poids de 1:1:1.
   REMARQUE : Nettoyez soigneusement la pointe du grattoir pour chaque échantillon afin d’éviter toute contamination croisée.
2. Mélangez les poudres avec un mortier pour enlever les grumeaux.
3. Verser le mélange obtenu sur une lame de microscope ; Utilisez la pointe du grattoir pour la presser doucement et obtenir une épaisseur presque uniforme de la couche.
4. Appliquez du vernis à ongles sur les bords d’une housse de microscope. Placez-le sur le mélange, avec le vernis à ongles orienté vers le bas, et appliquez assez de pression pour le sceller. Laissez sécher quelques secondes pour durcir le polis.

2. Installation du microscope

ATTENTION : Portez des lunettes de sécurité lorsque le laser est allumé, car la puissance maximale atteinte sur le plan d’échantillonnage est de 300 mW.

REMARQUE : La performance du laser à pompe reste inchangée par les variations de température, tant qu’elle fonctionne dans la plage de température spécifiée dans la fiche technique (par exemple, 10-40 °C pour le laser indiqué dans le tableau des matériaux).

1. Alignez l’interféromètre TWINS le long du trajet de détection du microscope.
   REMARQUE : Comme détaillé par Candeo et ^al.17, le module interféromètre doit être ajouté entre la lentille du tube et le détecteur, assurant ainsi une distance appropriée entre les deux. Pour le microscope utilisé dans ce travail, cela n’est garanti que lorsque le module de l’oculaire est retiré.
2. Pour adapter le schéma d’illumination de Koehler à une excitation laser, retirez la lampe d’excitation intégrée du microscope et utilisez un objectif de microscope pour collecter la lumière à la sortie d’une fibre multimode à gros noyau.
   REMARQUE : Le grossissement objectif détermine la taille du motif d’illumination lorsque la pointe de la fibre est conjuguée avec le plan échantillon. Un choix possible est un objectif 10x/0,25-0,30.
3. Choisissez la longueur d’onde d’excitation et concentrez le laser d’excitation à l’entrée de la fibre multimode à gros noyau. Allumez l’appareil photo et lancez un logiciel de visualisation.
   1. Fixez une section centrale de la fibre à la membrane vibrante d’une bobine mobile, ce qui enlever la tache. Brouillez mécaniquement la fibre en la pliant fermement pour fusionner tous ses modes spatiaux. Allume le laser.
   2. Préparez un échantillon d’essai pour l’alignement, par exemple des bandes fluorescentes rouges sur une couche de couverture de microscope.
   3. Ajustez la position de la pointe de la fibre par rapport au système optique d’éclairage en déplaçant la fibre avec une étape de translation de précision pour obtenir un point d’intensité uniforme et de bords bien définis sur le plan de l’échantillon.
      REMARQUE : Un laser de 532 nm est utilisé pour toutes les mesures rapportées. Avec une fibre de taille de 400 μm à cœur, le diamètre de la tache couvre 82 % de la largeur du champ de vision de la caméra.
4. Utiliser un ensemble de filtres pour les chemins d’excitation et de détection, en adoptant les critères suivants (Figure supplémentaire 2) :
   1. Utilisez un filtre passe-bande étroit à 532 nm (bande passante de 2,0 nm) pour nettoyer la ligne laser et rejeter toute bande latérale de pompe résultant d’un élargissement non linéaire dû à la propagation dans la fibre.
   2. Utilisez un miroir dichroïque (DM dans la Figure 1) pour réfléchir la lumière laser vers l’échantillon et transmettre le rayonnement rétrodiffusé décalé vers le rouge collecté par l’objectif.
   3. Utilisez un filtre passe-long (LPF dans la Figure 1) à 532 nm pour rejeter la lumière résiduelle d’illumination.
   4. Lors de la mesure de diffusion Raman, utilisez un filtre passe-court (SPF dans la Figure 1) à 600 nm pour supprimer la fluorescence de fond.
5. Mesurez la puissance sur le plan d’échantillonnage avec un photomètre. Atténuer le faisceau de pompe pour obtenir une intensité à l’échantillon qui ne cause pas de dommages (de l’ordre de 2 W/cm², comme indiqué dans le Tableau 1). Utilisez un obturateur pour le laser tout en réglant les autres paramètres de mesure.
   REMARQUE : En raison de la faible section efficace de la diffusion Raman spontanée, une densité de puissance élevée est nécessaire pour améliorer la collecte du signal. Cependant, le seuil de dommage de l’échantillon doit être pris en compte. Contrairement aux systèmes de balayage ponctuel, une configuration à large champ éclaire une grande surface, rendant la dissipation de puissance moins efficace et nécessitant une gestion minutieuse de l’énergie pour éviter les dommages de l’échantillon.
6. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et ajustez la mise au point.
   REMARQUE : Pour trouver facilement la mise au point, il faut d’abord éclairer l’échantillon avec une lampe blanche en transmission ou en réflexion. Dans ce dernier cas, une ampoule placée à côté du microscope pouvait être utilisée. La mise au point de l’échantillon sera ensuite optimisée avec la lumière laser à pompe.

3. Paramètres de mesure

1. Allumez le transducteur du moteur qui effectue la translation en coin. Contrôlez simultanément les composants matériels (caméra et moteur) pour effectuer des mesures hyperspectrales (exemple d’interface utilisateur montré dans la Figure 3 supplémentaire).
2. Réglez les paramètres d’acquisition de la caméra, le temps d’exposition et le binning matériel pour optimiser l’intensité du signal, en suivant les instructions suivantes :
   1. Puisqu’un rapport signal sur bruit (SNR) élevé dans le signal temporel entraîne un SNR élevé dans les spectres récupérés, il privilégie un temps d’exposition long, qui remplit mieux la plage dynamique du capteur.
      REMARQUE : Pour les signaux faibles, comme pour la diffusion Raman, il faut trouver un compromis entre le niveau du signal et le temps total de mesure : le temps d’exposition le plus long peut ne pas être réalisable.
   2. Choisissez le binning matériel pour collecter la charge de plus de pixels avant la lecture.
      REMARQUE : Faire la somme de la charge et effectuer une lecture unique offre une meilleure performance sonore que de lire plusieurs pixels puis de sommer leur signal en post-traitement. Le choix du binning est également déterminé par la réduction acceptable de la résolution spatiale.
3. Choisissez les paramètres de balayage, la longueur totale du balayage et l’étape d’échantillonnage selon les critères suivants :
   1. Pour obtenir une haute résolution spectrale pour les pics Raman, réglez une translation en coin long asymétrique (-2526 fs→ -36 fs). En revanche, effectuer un balayage symétrique autour de la position de retard zéro (-65 fs → 65 fs) pour obtenir davantage de caractéristiques spectrales à large bande du signal PL.
   2. En utilisant l’équation 1 pour le délai τ en fonction de la translation en coin x, choisissez l’étape d’échantillonnage pour remplir la limite de Nyquist pour la bande spectrale d’intérêt.
      REMARQUE : Étant donné la longueur d’onde minimale du spectre λ_min, imposer (Équation 2).
      
      où la biréfringence Δn dépend de la longueur d’onde (voir les équations de Sellemeier).
4. Ouvrez l’obturateur pour diriger le laser sur l’échantillon. Si une diminution de l’intensité du signal est observée, attendez que l’échantillon atteigne une condition immobile (généralement quelques secondes).
   REMARQUE : Pour compenser la diminution de l’intensité du signal, ajustez le binning et le temps d’exposition pour maintenir un bon SNR.
5. Commencez l’acquisition d’une image monochrome pour chaque position de coin, c’est-à-dire le délai temporel entre les répliques depuis chaque point du capteur 2D.
   REMARQUE : Le logiciel d’acquisition devrait sauvegarder deux variables : l’hypercube temporel (ensemble d’images 2D) et le vecteur des positions des moteurs enregistré par l’encodeur lors du scan.
6. Une fois la mesure terminée, éteignez le laser et poursuivez l’analyse des données.

4. Traitement du datacube acquis

1. Générez l’hypercube spectral à partir du jeu de données acquis, en suivant ces instructions :
   1. Chargez le fichier de correction des positions des moteurs pour le moteur pas à pas spécifique (voir la discussion).
   2. Chargez le fichier d’étalonnage de fréquence pour l’interféromètre spécifique afin d’associer les fréquences spatiales mesurées (pseudofréquences) aux fréquences optiques réelles (voir la section Discussion).
   3. Choisissez la plage de fréquences pour les spectres qui sera calculée en transformant Fourier les interférogrammes de tous les pixels.
   4. Parmi les fonctions d’apodisation^{disponibles, 12} pour fenêtrer l’interférogramme mesuré, sélectionnez celle qui offre un bon compromis entre l’élargissement spectral et la réduction des artefacts dans les spectres récupérés, comme la fenêtre Happ-Genzel (Hamming).
   5. Générer l’hypercube spectral en transformant Fourier les interférogrammes apodisés pour tous les pixels. Sauvegardez-le dans des valeurs complexes.
      REMARQUE : Le spectre complexe de la FT contient des informations supplémentaires, utiles pour réduire le bruit du jeu de données et extraire la moyenne des spectres d’un ensemble de pixels sélectionnés.
2. Une fois l’hypercube spectral calculé, effectuer diverses investigations, par exemple obtenir le spectre moyen dans certaines zones ; générer une image RGB en fausse couleur ; cartographie des sommets spectraux ; Soustraire le contexte.
3. Pour réduire le bruit spectral, qui peut submerger des pics importants, notamment dans les spectres Raman, implémentez la décomposition à valeurs singulières (SVD)¹⁸ en suivant ces étapes :
   1. Remodelez l’hypercube temporel en une matrice A avec des interférogrammes le long de ses rangées.
   2. Effectuer le SVD de la matrice, obtenant les matrices U, S et V telles que A = USV^T.
      REMARQUE : Les colonnes U sont les distributions spatiales des vecteurs propres de V (colonnes), tandis que S est une matrice diagonale avec des valeurs singulières (SV) dans l’ordre décroissant.
   3. Remodelez chaque colonne de U en une matrice de pixels et effectuez sa 2D TF pour obtenir ses fréquences spatiales.
   4. Puisque les hautes fréquences sont associées à des changements très brusques dans la carte, considérons-les comme du bruit ; définir une région carrée centrée dans l’espace de Fourier calculé qui sépare les fréquences basses (principalement signalales) et hautes fréquences (principalement le bruit).
      REMARQUE : Un choix possible pour cette zone est d’avoir un côté de 1/4 par rapport à la taille de l’espace de Fourier.
   5. Calculez le rapport du signal spatial (SSR) pour chaque SV en divisant la somme des intensités de pixels (module complexe) à l’intérieur de la frontière par la somme des intensités en dehors de la frontière. Tracez le SSR en fonction du numéro SV.
   6. Définir un seuil pour les SSR, c’est-à-dire le nombre de SV significatifs à conserver afin de réduire la contribution au bruit dans l’ensemble de données, en évitant les artefacts.
      REMARQUE : La SSR présente généralement une tendance à la baisse qui se stabilise jusqu’à un plateau à mesure que le nombre de valeurs singulières augmente. Une règle générale consiste à conserver les valeurs singulières jusqu’au point où le plateau commence.
   7. Régler tous les SV inférieurs à zéro dans la matrice diagonale S, obtenir_{S sans bruit,} et calculer un hypercube temporel dénosourisé comme V^T _dénoïsé aux États-Unis.
      REMARQUE : SVD est une factorisation matricielle qui peut également être appliquée à l’hypercube spectral remodelé (avec des lignes contenant des spectres plutôt que des interférogrammes).
4. Répétez les étapes 4.1-4.2 avec l’hypercube temporel dénudé pour récupérer les spectres.
5. Téléchargez le programme depuis le lien dans la référence¹⁹ pour effectuer une analyse plus approfondie de l’ensemble de données avec l’algorithme Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   REMARQUE : Les développeurs de logiciels fournissent une description détaillée de^{l’algorithme 20}. Il s’agit d’une méthode itérative pour résoudre le problème d’analyse du mélange : chaque spectre s’exprime comme la combinaison linéaire de profils spectraux purs. Avec une représentation matricielle : B = C R^T+E, où B est le jeu de données, C contient les concentrations pour chaque spectre, les colonnes de R sont les spectres de référence des constituants, et E exprime l’erreur.
   1. Remodeler l’hypercube spectral en_{une matrice} de fréquences N_pix x N, avec N_pixels en nombre total de pixels et N longueurs de vecteurs_{de fréquence}.
   2. Sélectionnez le nombre d’espèces attendues dans l’échantillon et chargez leur spectre de référence.
      REMARQUE : Les spectres de référence peuvent être mesurés séparément pour chaque pigment. Sinon, le programme créera un SVD de l’ensemble de données et utilisera autant de composants principaux que les constituants sélectionnés pour les premières suppositions.
   3. Sélectionnez des contraintes : les profils spectraux récupérés doivent être non négatifs et aussi similaires que possible aux spectres de référence.
   4. Tracez la carte de concentration (colonnes remodelées de C) et les spectres (colonnes de R) pour chaque espèce.
   5. Exportez ces cartes et utilisez-les pour produire une image en fausse couleur (Figure 4A), concluant ainsi l’analyse.
      REMARQUE : Les programmes utilisés pour obtenir les résultats présentés ici ne sont pas accessibles au public, mais peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande.

Résultats

La figure 4A montre la carte Raman pour une région sélectionnée du mélange en poudre. Il s’agit d’une représentation en fausse couleur des cartes d’abondance récupérées avec MCR-ALS, comme décrit à l’étape 4.5. Il fournit des informations sur la composition de l’échantillon, puisque les trois espèces peuvent être clairement distinguées dans le champ de vision (FOV). La figure 4B montre les spectres moyens dans les régions sélect...

Discussion

Un microscope multimodal à large champ a été introduit pour l’acquisition d’images de diffusion Raman spontanées et de luminescence, et il est applicable à la science des matériaux. L’applicabilité aux échantillons biologiques est démontrée par Candeo et ^al.17, qui présentent une image de fluorescence hyperspectrale de cellules humaines colorées. Le principal défi pour les mesures de diffusion Raman dans ce domaine est d’éviter les photodommages résultant d’une di...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anatase	Kronos	1200	Polymorphie du pigment blanc TiO2
Poudre de sulfure de cadmium	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Jaune cadmium, indice de couleur foncé/PY35
Caméra	Andor	Luca R	Caméra CCD à multiplication d’électrons avec 1004x1002 pixels de 8µ ; m x 8µ ; m
Filtre de nettoyage	Semrock	LL01-532-12.5	& Oslash ; 1/2" 2,0 nm - Filtre à ligne laser FWHM à 532 nm
Couvertures	BRAND GmbH & Co	4700 55	Cache-toiles de microscope en verre borosilicate 22x22x0,15 mm
Miroir dichroïque	Semrock	Di02-R532-25x36	Séparateur laser dichroïque à bord unique de 25,2x35,6 mm à 532 nm
Fibre	Thorlabs	M74L05	400 & micro ; Taille m-core, fibre multimode NA 0,39
Laser	Photonique Hubner	Cobolt Samba 1000	Laser pompé par diode CW à 532 nm, puissance maximale 1000 mW
Filtre passe-long	Semrock	LP03-532RU-25	Filtre à bord passe-long ultra raide à 532 nm
Microscope	Leica	DMRBE  ;   ;	Microscope de recherche trinoculaire   ;
Objectif	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Objectif d’excitation et de collecte avec un grossissement de 10x, 0,3 NA
Objectif	Newport	M-10X	Objectif dans le trajet d’éclairage, avec un grossissement 10x, 0,25 NA
Rutile	Kronos	2900	Polymorphie du pigment blanc TiO2
Filtre passe-court	Thorlabs	FESH600	& Oslash ; Filtre passe-court de 25,0 mm avec longueur d’onde de coupure 600
Diapositives	Marienfeld	1000612	Lames de microscope 76x26x1 mm