Cette étude se concentre sur l’induction sous-cutanée in vivo de cellules cancéreuses colorectales luminescentes dans un modèle murin et la mesure ultérieure de la luminescence à l’aide d’un système d’imagerie. La procédure vise à établir un modèle reproductible de croissance tumorale pour le suivi en temps réel et l’évaluation thérapeutique.
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Article de méthode
Injection sous-cutanée de cellules cancéreuses colorectales humaines chez des souris nues athymiques pour évaluer l’efficacité antitumorale
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer colorectal (CCR) est l’une des principales causes de décès liés au cancer dans le monde, ce qui souligne le besoin urgent d’améliorer les modèles précliniques pour évaluer les thérapies potentielles. Les modèles animaux sont essentiels pour élucider la biologie tumorale et évaluer de nouvelles interventions thérapeutiques. Les modèles murins offrent des avantages clés par rapport aux modèles existants, notamment la manipulabilité génétique, la reproduction rapide, la rentabilité et la disponibilité de souches immunocompétentes et immunodéficientes, permettant une modélisation précise des cancers humains.
Ce protocole se concentre sur l’induction sous-cutanée de la lignée cellulaire bioluminescente du cancer colorectal HCT-116 dans un modèle murin immunodéficient, suivie d’une imagerie par bioluminescence non invasive à l’aide du système IVIS et du pied à coulisse pour surveiller la progression et la croissance tumorales. L’utilisation de cellules luminescentes fournit une approche quantifiable en temps réel pour suivre le développement de la tumeur et la réponse aux interventions thérapeutiques, réduisant ainsi le besoin de procédures invasives. Une cohorte de souris (n = 12) est nécessaire pour l’implantation de cellules tumorales, et l’intensité de la luminescence est mesurée pour établir un modèle standardisé pour les tests thérapeutiques. Le volume tumoral est généralement calculé en utilisant uniquement les mesures de longueur et de largeur ou de largeur.
La méthodologie actuelle garantit un établissement tumoral cohérent tout en minimisant la variabilité, améliorant ainsi la fiabilité de l’évaluation préclinique. Les résultats de cette étude contribueront à affiner les modèles tumoraux pour les tests de médicaments et à améliorer le potentiel translationnel de la recherche préclinique dans les applications cliniques. En utilisant des techniques d’imagerie avancées et un plan expérimental reproductible, cette étude vise à améliorer la précision et l’efficacité de l’évaluation in vivo des médicaments pour le traitement du cancer colorectal.
Introduction
Le cancer colorectal (CCR) est un fardeau majeur pour la santé mondiale, se classant parmi les tumeurs malignes les plus répandues et les plus mortelles1. Le développement de modèles précliniques fiables est essentiel pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques, car les tests in vitro traditionnels ne parviennent pas à capturer pleinement la complexité de la croissance tumorale et de la réponse aux médicaments dans un système vivant. Des modèles in vivo , en particulier des modèles murins, ont été utilisés pour fournir des informations précieuses sur la biologie des tumeurs, permettant aux chercheurs d’évaluer l’efficacité de traitements potentiels dans un environnement contrôlé.
L’utilisation de cellules CRC luminescentes dans des modèles murins représente une avancée significative dans la recherche préclinique, permettant une surveillance non invasive en temps réel de la progression tumorale2. Cette étude vise à établir un protocole standardisé pour l’induction tumorale sous-cutanée et l’imagerie IVIS afin de suivre la croissance tumorale de manière dynamique. Un modèle d’injection sous-cutanée a été sélectionné en raison de sa simplicité technique, de sa reproductibilité et de sa facilité de surveillance longitudinale des tumeurs. En exploitant l’imagerie par bioluminescence, les chercheurs peuvent obtenir des données précises et quantifiables sur le développement des tumeurs et les réponses thérapeutiques sans avoir besoin d’euthanasier les animaux à plusieurs moments3.
Le système d’imagerie IVIS est un outil puissant pour évaluer la charge tumorale avec une sensibilité et une spécificité élevées, améliorant ainsi la reproductibilité et la précision des études in vivo . Cette étude servira de base pour de futures évaluations thérapeutiques, fournissant une approche standardisée et efficace des tests précliniques de médicaments pour le traitement du cancer colorectal. En affinant les méthodes d’induction tumorale et en mettant en œuvre des techniques d’imagerie avancées, ces recherches contribuent à combler le fossé entre les applications précliniques et cliniques en oncologie4.
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Protocole
Les animaux ont été maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes selon les directives établies par le comité d’éthique (n° A13240502 de l’Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Murcie). Des inspections hebdomadaires ont été effectuées par du personnel qualifié conformément au R. D. 1201/2005.
1. Animaux
REMARQUE : Tous les animaux doivent être attachés de manière sûre avant l’injection. Si l’on travaille avec des souris immunodéficientes (c’est-à-dire des souris athymiques nues telles que Crl : NU(NCr)-Foxn1nu), il est essentiel de maintenir la stérilité. L’étude actuelle a utilisé 12 souris nues athymiques, âgées de 5 semaines (20-22 g pour les femelles et 22-26 g pour les mâles) au début de l’expérience (50 % de mâles). Toutes les procédures d’anesthésie et expérimentales ont été réalisées dans la Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación du centre, avec l’approbation du comité d’éthique de l’établissement (Protocole n° A13240502) et conformément à la législation espagnole (R.D. 1201/2005).
- Avant de commencer le test, acclimatez les souris, âgées de 4 semaines, au centre animalier pendant environ 1 semaine. Par la suite, effectuez les procédures suivantes.
2. Préparation du stock de D-luciférine
- Préparez une solution de travail de 15 mg/mL de sel de potassium de D-luciférine substrat bioluminescent dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée dans un tube conique à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique. Retournez le tube plusieurs fois pour bien homogénéiser la solution.
- Transférez la solution à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour la stérilisation.
- Aliquote la solution stérilisée dans des microtubes opaques de 1 mL et conserver à -20 °C.
REMARQUE : La luciférine est sensible à la lumière.
3. Préparation de la matrice extracellulaire
- Décongeler de l’hydrogel commercial à matrice extracellulaire (MEC) sans rouge de phénol pendant la nuit sur de la glace à l’intérieur d’un réfrigérateur entre 2 °C et 8 °C5.
- Le jour de l’injection, conservez l’ECM sur de la glace et, à l’aide d’une micropipette P1000 pré-refroidie, aliquote 200 μL d’ECM dans des tubes stériles.
REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des microtubes à alésage large. Minimisez les changements de température et évitez les cycles répétés de gel-dégel. - Prérefroidissez les seringues et les aiguilles sur de la glace avant de préparer les injections afin d’éviter les changements brusques de température de l’ECM.
4. Détachement et comptage des cellules
- Plaquez les cellules bioluminescentes HCT-116 (lignée cellulaire ATCC CCL-247-LUC2) dans des flacons T75 quelques jours avant l’induction de la tumeur pour assurer un nombre suffisant de cellules. Maintenir la culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO2, et remplacer le milieu si nécessaire6.
- Le jour de l’expérience, aspirez soigneusement le milieu de culture pour éviter de déranger les cellules adhérentes.
- Laver les cellules avec 8 mL de PBS stérile (préchauffé à 30 °C dans un bain-marie) pour éliminer les résidus de sérum.
- Ajouter 2 ml par fiole de trypsine-EDTA tiède (0,05 %) et incuber à 37 °C pendant 4 à 5 minutes. Surveiller le décollement des cellules à l’aide d’un microscope inversé. Si les cellules restent attachées, tapotez doucement le côté de la fiole pour faciliter le détachement.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 mL de milieu de croissance complet contenant du sérum fœtal bovin (FBS).
- Transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Rincer les flacons avec 2 ml supplémentaires de milieu frais pour recueillir les cellules restantes et ajouter les lavages dans le tube de 15 ml.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 5 min à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
- Remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans 3 mL de substrat de semis pour obtenir une suspension homogène.
- Comptez les cellules dans une chambre Neubauer ou un compteur automatique de cellules. Déterminez la viabilité cellulaire en mélangeant 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de Trypan et comptez les cellules viables au microscope inversé.
REMARQUE : Préparez un nombre suffisant de cellules pour l’étude : au moins 3 × 106 cellules viables par souris. - Remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile (préchauffé à 30 °C dans un bain d’eau) et modifier la concentration des cellules viables jusqu’à une concentration finale de 2 × 107 cellules/mL avec du PBS. Préparez des aliquotes de 200 μL.
5. Installez les équipements et anesthésiez les animaux.
- Mettez le système d’imagerie sous tension au moins 4 h avant l’imagerie.
REMARQUE : Suivez les instructions du système pour permettre l’étape d’initialisation, y compris le réglage des paramètres d’intensité lumineuse et de temps d’exposition de la caméra en fonction du rapport signal/bruit. Ce paramètre doit être réglé manuellement en fonction des conditions expérimentales. - Peser les animaux et calculer le volume de D-luciférine à administrer (200 μL d’une solution à 15 mg/mL pour 20 g de l’animal).
- Nettoyez et désinfectez les chambres d’imagerie et l’armoire.
- Identifiez et immobilisez en toute sécurité chaque souris pour l’anesthésie.
REMARQUE : Portez deux paires de gants pour protéger les mains contre les piqûres accidentelles d’aiguille lors de l’injection sous-cutanée. - Anesthésier les souris avec 2 % d’isoflurane dans de l’oxygène à un débit de 1,8 à 2,0 L/min. Allumez la pompe d’aspiration en même temps que la pompe d’anesthésie.
6. Préparation des cellules pour l’injection
- Mélanger 200 μL de 2 × 10 7 cellules CRC bioluminescentes/mL avec 200 μL d’ECM dans un cryoflacon à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Pipeter doucement avec une pipette P1000 pour éviter la formation de bulles d’air et la dissociation.
- Transférez le mélange de 400 μL dans une seringue de 1 mL, retirez les bulles d’air et procédez immédiatement à l’injection.
- Débouchez l’aiguille en toute sécurité, en maintenant toujours la stérilité de l’aiguille.
REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des aiguilles individuelles pour chaque animal afin de minimiser la contamination. Une nouvelle aiguille est utilisée pour chaque souris afin d’éviter l’infection croisée entre souris. - Fixez une aiguille de 25 G et ajustez le contenu de la seringue à 200 μL, en éliminant toutes les bulles d’air.
REMARQUE : Les injections sont généralement faites avec 200 μL, conduisant à 2 × 106 cellules par injection. - Glissez l’aiguille dans le capuchon sans serrer sans manipuler le capuchon ou l’aiguille pendant que l’animal est retenu.
7. Induction d’une tumeur sous-cutanée
- Retirez la souris de la chambre une fois qu’elle est anesthésiée et placez le museau de l’animal dans une sortie fournissant le même anesthésique.
REMARQUE : Dans notre cas, la buse a été fabriquée à l’aide d’un gant. - Placez l’animal sur son côté droit sur une surface plane. À l’aide du bout des doigts de la main non dominante, pincez doucement et soulevez la peau de l’animal dans le quadrant inférieur gauche.
- Avant l’injection, aspirez d’abord pour vous assurer que l’aiguille est bien placée. Insérez l’aiguille biseautée avec la main dominante, aux deux tiers dans la peau soulevée, parallèlement au corps, en faisant très attention de ne pas piquer les doigts ou de percer les gants doubles.
REMARQUE : Un placement correct doit produire une pression négative et aucune aspiration dans le moyeu de l’aiguille. - Injectez le contenu de la seringue (200 μL) dans la peau soulevée, juste entre les deux doigts. Maintenez brièvement la position avant de retirer lentement l’aiguille. Retirez l’aiguille après l’injection sous-cutanée et jetez-la en toute sécurité dans un récipient pour objets tranchants.
8. Injection intrapéritonéale de D-luciférine
- Avant de remettre l’animal dans la chambre d’anesthésie, administrer la D-luciférine par voie intrapéritonéale (IP) à une concentration de 150 mg/kg de poids corporel avec la solution mère à 15 mg/mL dans une seringue à insuline de 30 g (200 μL pour 20 g de l’animal).
REMARQUE : Une injection allant jusqu’à 0,5 mL est bien tolérée. - Contention manuelle, décubitus dorsal (abdomen vers le haut), avec l’extrémité crânienne (tête) de l’animal pointée vers le bas. Laissez le contenu intestinal se déplacer vers le bas.
- En gardant l’aiguille biseautée vers le haut et légèrement inclinée à 15-20°, enfoncez l’aiguille dans la cavité abdominale de sorte que la pointe de l’aiguille pénètre à peine la paroi abdominale du quadrant abdominal inférieur gauche de l’animal.
- Injectez lentement la D-luciférine dans la cavité intrapéritonéale, retirez l’aiguille et jetez-la en toute sécurité.
- Placez la souris dans la chambre d’anesthésie et laissez-la se stabiliser pendant environ 5 min. Après 15 min, procédez à l’imagerie in vivo .
REMARQUE : Construisez une courbe cinétique D-luciférine pour chaque nouveau modèle animal afin de déterminer le temps de crête du signal. Dans notre cas, l’émission de lumière a culminé à environ 15 min en imagerie in vivo .
9. Analyse d’imagerie in vivo
- Placez l’animal entièrement anesthésié dans la chambre du système d’imagerie, sur le flanc droit. Assurez-vous que l’animal est correctement aligné avec la caméra et la source lumineuse pour capturer la zone de la tumeur.
- Ouvrez le logiciel lié. Choisissez le mode d’imagerie visuelle ou photographique pour confirmer la position de l’animal. Enregistrez les données et modifiez le nom du dossier.
- Choisissez le mode d’imagerie par bioluminescence et réglez-le sur automatique. Capturez des images de bioluminescence et surveillez la lumière de la tumeur sur l’écran de l’ordinateur.
- Une fois l’imagerie terminée, remettez l’animal dans sa cage et observez toute complication.
- Effectuez un post-traitement, mettez d’abord à l’échelle la lumière bioluminescente afin que toutes les tumeurs de souris présentent la même échelle, généralement entre 1e6 et 1e8.
- Configurez une région d’intérêt (ROI) autour de la tumeur pour l’analyse et copiez-la pour des analyses plus approfondies. Mesurez la lumière du retour sur investissement et exportez ces résultats pour une analyse plus approfondie. Collez le retour sur investissement précédemment créé et copié de la même taille pour les tumeurs suivantes.
- Arrêtez le système conformément aux instructions du fabricant et nettoyez la chambre d’imagerie. Éteignez les pompes d’extraction et d’anesthésie, ainsi que le débit d’oxygène.
10. Mesure du volume tumoral
- Anesthésier les animaux avec de l’isoflurane pour la mesure des tumeurs. Placez l’animal dans une position stable et couvrez-lui la tête. Immobilisez rapidement l’animal.
- Mesurez la longueur, la largeur et la profondeur de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse numérique calibré.
REMARQUE : Effectuez les mesures rapidement, car l’animal commencera à se réveiller environ 1 minute après l’avoir retiré de la chambre d’anesthésie. - Répétez les mesures et calculez une moyenne.
- Calculez le volume selon la formule pour les tumeurs sphériques ou elliptiques :
Pour les tumeurs sphériques 7
(1)
Pour les tumeurs ellipsoïdes 8
(2)
REMARQUE : Pour minimiser le biais de mesure, toutes les mesures tumorales de l’étude doivent être effectuées par le même opérateur. De plus, il convient de noter que le jour de l’induction de la tumeur, une mesure précise est souvent difficile car la masse tumorale n’est pas encore complètement solidifiée.
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Résultats
Ce protocole permet d’introduire des cellules humaines dans un modèle murin immunodéficient, permettant la croissance de ces cellules tumorales in vivo, ce qui est toujours plus pertinent physiologiquement qu’in vitro. Il est crucial de s’assurer que les conditions expérimentales sont aussi reproductibles que possible, que les tumeurs contiennent un nombre similaire de cellules viables et qu’elles sont implantées dans un endroit comparable et toujours accessible.
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Discussion
Le protocole d’induction sous-cutanée de cellules cancéreuses colorectales luminescentes dans un modèle de souris nue athymique présente une approche standardisée et reproductible pour la formation de tumeurs et le suivi en temps réel. Tout d’abord, il est important de noter que ces études sont généralement menées sur une période de 28 jours, avec des mesures de luminescence effectuées le jour de l’induction de la tumeur et par la suite toutes les semaines. À l’inverse, les mesures du vo...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui pourraient influencer les travaux rapportés dans cette étude.
Remerciements
L’ACS et le CNN appartiennent au « Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spain » et détiennent des bourses de doctorat de l’UCAM. Les auteurs sont reconnaissants envers les plateformes de l’animalerie de l’IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcie), où le test préclinique a été mené.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes à microtubes opaques de 1 mL | Eppendorf | 30125215 | Stockage de la D-luciférine |
| Tube conique de 15 mL | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Matériel de culture cellulaire |
| Dulbecco avancé » s Eagle Moyen Modifié (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Réactif de culture cellulaire |
| Souris nue athymique | Rivière Charles | Crl :NU(NCr)-Foxn1nu | Souris nue immunodéficiente |
| Cellules bioluminescentes du cancer du côlon humain HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 est idéal pour la bioluminescence in vivo |
| D-luciferine Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Pour la mesure de la bioluminescence |
| Matrice extracellulaire (ECM) | Corning | 356231 | Matrice Matrigel pour l’invasion cellulaire ; |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Réactif de culture cellulaire |
| Embouts de pipette filtrante | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Pour éviter la formation de bulles d’air |
| Seringue à insuline 25 G 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Pour l’implantation de lignées cellulaires par HCT-116 |
| Seringue à insuline 30 G 0,5 mL | DH Material medico | 9.41652E+15 | Pour l’administration de la D-luciférine |
| Système d’image IVIS avec logiciel Living Image | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Scanner d’imagerie bioluminescence et fluorescente |
| Héparine stérique à aiguille | VWR | 612-0153 10 | Administration de D-luciferine et implantation de HCT-116 |
| Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) | VWR | 392-0042P | Solution de suspension cellulaire pour le décollement et l’implantation de HCT-116 |
| Trypsine-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Réactif de culture cellulaire |
| Flasque T-75, traitée par TC | STARLAB | CC7682-41 | Matériel de culture cellulaire |
Références
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Réimpressions et autorisations
