Method Article

Imagerie 3D haute résolution sans marquage et analyse par apprentissage automatique d’organoïdes intestinaux par holotomographie à faible cohérence

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution, sans marquage et des organoïdes à l’aide de l’holotomographie à faible cohérence. Ce protocole détaille la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse d’images informatiques, permettant de visualiser en temps réel la dynamique structurelle et les réponses aux médicaments dans les organoïdes vivants.

Abstract

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Une imagerie précise et sans marquage des organoïdes intestinaux est cruciale pour étudier leur morphologie, leur dynamique de croissance et leurs réponses aux stimuli environnementaux. L’holotomographie (HT) fournit une visualisation tridimensionnelle (3D) haute résolution d’organoïdes vivants sans avoir besoin de marqueurs fluorescents, minimisant ainsi la phototoxicité et préservant l’intégrité de l’échantillon. L’imagerie en temps réel basée sur la phase permet un suivi continu et sans étiquette des modifications structurelles et fonctionnelles. En utilisant l’indice de réfraction comme contraste d’imagerie intrinsèque, cette méthode permet de quantifier les propriétés biophysiques telles que le volume, la densité protéique et la teneur en protéines. Les données d’imagerie sont ensuite traitées par segmentation et extraction de caractéristiques basées sur l’apprentissage automatique pour prendre en charge une analyse cohérente et à haut débit. Ce protocole détaille le flux de travail expérimental complet pour l’utilisation de la HT à faible cohérence dans la recherche sur les organoïdes, couvrant la préparation des organoïdes, l’acquisition d’images et l’analyse de données basée sur l’apprentissage automatique. En intégrant la segmentation computationnelle et les évaluations quantitatives, cette approche permet une évaluation impartiale des principales propriétés des organoïdes, notamment la viabilité, l’organisation structurelle et la réponse aux médicaments. La capacité de capturer les changements morphologiques en temps réel à la résolution subcellulaire rend ce protocole très applicable aux études basées sur les organoïdes en médecine régénérative, en modélisation des maladies et en criblage pharmaceutique. La méthodologie étape par étape décrite ici facilite la reproductibilité et l’adaptation à grande échelle entre différents systèmes organoïdes.

Introduction

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Les organoïdes sont des versions miniaturisées tridimensionnelles (3D) d’organes cultivés à partir de cellules souches, capables de récapituler les principales caractéristiques structurelles et fonctionnelles d’organes réels in vitro1. Les chercheurs ont mis au point des systèmes organoïdes pour un large éventail de tissus, notamment l’intestin, le cerveau, les poumons, le foie et les reins, chacun démontrant l’architecture auto-organisée et la diversité des types cellulaires rappelant son homologue in vivo . En reflétant l’architecture des organes natifs et la complexité multicellulaire, les organoïdes servent de puissants systèmes modèles pour l’étude du développement humain, de la régénération des tissus et des mécanismes de la maladie1. Ils sont devenus des outils essentiels pour la modélisation des maladies et la découverte de médicaments, permettant aux chercheurs d’explorer les voies de la maladie et de tester de nouveaux traitements sur des tissus 3D spécifiques au patient en laboratoire2. Notamment, les organoïdes sont également prometteurs en médecine régénérative3 : les tissus dérivés d’organoïdes peuvent être greffés in vivo pour réparer les dommages, comme démontré avec les organoïdes intestinaux et hépatiques, soulignant leur potentiel de restauration de la fonction des organes4. Cette polyvalence rend les organoïdes indispensables dans la recherche biomédicale moderne et la médecine personnalisée.

Compte tenu de leur composition multicellulaire et de leur complexité structurelle 3D, la capture et l’analyse de la dynamique des organoïdes sont cruciales. Cependant, les techniques d’imagerie conventionnelles sont confrontées à des limites importantes dans la résolution des structures et de la dynamique des organoïdes, produisant souvent des instantanés 2D qui ne parviennent pas à représenter leur état physiologique complet5.

La microscopie à fond clair est une méthode non invasive largement utilisée pour capturer des organoïdes. Il surveille de manière pratique la croissance et la morphologie, mais offre un contraste limité dans les échantillons 3D non colorés. De plus, il manque de sectionnement optique, ce qui entraîne une mauvaise résolution des structures internes. Les organoïdes semblent largement transparents, ce qui empêche la détection des caractéristiques fines sous la surface6. Le contraste de phase améliore la visibilité en convertissant les déphasages en différences d’intensité, révélant ainsi l’architecture générale (par exemple, une lumière centrale) sans coloration. Malgré son utilité pour l’observation en temps réel, le contraste de phase souffre d’artefacts de halo, d’une faible résolution et d’une profondeur de pénétration limitée, ce qui le rend moins efficace pour les organoïdes plus épais7.

La coupe en série suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et d’une immunocoloration à base d’anticorps est largement utilisée pour analyser la microstructure organoïde et la composition cellulaire8. Des techniques améliorées de traitement des tissus, telles que l’incorporation de paraffine fixée au formol (FFPE) et la cryosection, améliorent la préservation de la morphologie, la FFPE offrant des résultats supérieurs9. L’intégration d’organoïdes dans des hydrogels tels que l’agarose et la centrifugation aligne plusieurs échantillons dans une seule section, améliorant ainsi l’efficacité de l’analyse. Les coupes colorées H&E des organoïdes tumoraux dérivés de patients reflètent l’histologie tumorale d’origine, tandis que la coloration par immunofluorescence met en évidence des marqueurs tels que CK8 pour l’identification cellulaire10. Cependant, ces techniques ne permettent pas de surveiller les organoïdes vivants et peuvent introduire des artefacts tels que des plis ou des déformations tissulaires pendant la section.

La microscopie confocale à fluorescence est largement utilisée pour l’imagerie des organoïdes, produisant des coupes optiques à haute résolution (submicrométriques) qui permettent une visualisation détaillée de l’architecture des organoïdes et de la composition cellulaire11,12. Cependant, l’imagerie confocale des organoïdes 3D est généralement limitée aux couches superficielles (jusqu’à 100 μm de profondeur) et peut prendre du temps et être phototoxique en raison de l’éclairage laser à balayage ponctuel13. La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) surmonte certaines de ces limitations en n’éclairant que le plan d’imagerie, ce qui permet d’obtenir une imagerie volumétrique rapide d’organoïdes entiers avec un photoblanchiment et une phototoxicité minimaux14,15 ; Cependant, cette technique nécessite souvent un nettoyage tissulaire pour une imagerie optimale des échantillons épais. De plus, la profondeur d’imagerie LSFM est limitée par la diffusion de la lumière et les désadaptations de l’indice de réfraction (IR), qui peuvent être atténuées par l’optique adaptative, l’imagerie multi-vues et les longueurs d’onde d’excitation optimisées16. Le montage d’échantillons introduit également des déformations structurelles, tandis que les grands ensembles de données 3D posent des défis de calcul en matière de stockage et d’analyse. Les progrès récents, notamment l’amélioration des techniques de marquage génétique, les nouveaux réactifs de clarification, l’optique adaptative et l’analyse d’images pilotée par l’IA, remédient à ces limitations, rendant la LSFM de plus en plus réalisable pour la recherche sur les organoïdes7.

Malgré ces avancées, les techniques d’imagerie par fluorescence 3D posent plusieurs défis pour le suivi à long terme des organoïdes vivants. Tout d’abord, l’utilisation du marquage fluorescent introduit des effets phototoxiques et perturbe les processus biologiques, ce qui pose des défis pour les études d’imagerie en direct prolongées17. Deuxièmement, le marquage basé sur les anticorps souffre d’une pénétration limitée en raison des barrières de diffusion au sein des structures organoïdes denses, nécessitant des méthodes avancées de perméabilisation et de nettoyage des tissus, qui prennent plus de 10 jours d’incubation pour l’utilisation des anticorps primaires et secondaires18. Troisièmement, la transfection et l’expression stable des protéines fluorescentes dans les organoïdes restent inefficaces, car les approches conventionnelles d’administration de gènes ont du mal à s’adapter aux environnements 3D19. Quatrièmement, les techniques de clarification optique, essentielles pour l’imagerie profonde, entraînent souvent une perte de signal de fluorescence et une distorsion tissulaire, ce qui nécessite des protocoles de clarification optimisés qui équilibrent la transparence et la préservation de la fluorescence20.

Pour remédier à ces limitations, l’holotomographie (HT) a été introduite comme technique d’imagerie d’organoïdes vivants non marqués avec une haute résolution dans le temps. Également connue sous le nom d’imagerie de phase quantitative 3D, la HT est une modalité haute résolution sans marquage qui permet une visualisation quantitative en temps réel des organoïdes tout en préservant leur état physiologique natif. Le principe de l’HT est analogue à celui de la tomographie par rayons X ; en capturant plusieurs images de champ optique 2D dans diverses conditions d’éclairage, la distribution RI 3D d’un échantillon non étiqueté est reconstruite par équation d’onde inverse résolvant 21,22,23. L’HT a été largement appliquée dans divers domaines biologiques, notamment l’hématologie24,25, la condensation de phase en biologie cellulaire26, la microbiologie27 et l’histopathologie28. Plus récemment, sa capacité d’imagerie 3D haute résolution et sans marquage a été de plus en plus utilisée pour la recherche sur les organoïdes 21,22,23,29, offrant une approche non invasive pour étudier leur dynamique structurelle et fonctionnelle.

Dans cette étude, nous présentons un protocole détaillé pour l’utilisation de HT à faible cohérence dans la surveillance à long terme et sans marquage des organoïdes de l’intestin grêle (sIO) de souris. Cette méthode permet de visualiser en temps réel la croissance des organoïdes et les réponses aux médicaments sur 24 heures tout en fournissant des mesures quantitatives du volume des organoïdes, de la densité des protéines et de la teneur en protéines, facilitant ainsi une analyse rigoureuse et basée sur les données du comportement des organoïdes. Pour étudier les altérations morphologiques des organoïdes, nous avons traité les échantillons avec du cisplatine, un agent chimiothérapeutique à base de platine connu pour induire l’apoptose en formant des réticulations de l’ADN et en inhibant la réplication cellulaire30. Alors que l’imagerie IR 3D capture les détails structurels, l’analyse systématique est essentielle pour quantifier la dynamique des organoïdes. Pour y parvenir, nous intégrons ilastik, une boîte à outils de segmentation basée sur l’apprentissage automatique31 pour différencier les régions organoïdes de l’arrière-plan. Ce protocole décrit l’ensemble du flux de travail, y compris la préparation de la culture d’organoïdes, l’acquisition 3D HT, la segmentation basée sur l’apprentissage automatique et l’analyse quantitative à partir de tomogrammes IR. En offrant un cadre d’imagerie évolutif, reproductible et non invasif, cette approche établit une nouvelle norme pour la recherche sur les organoïdes avec de larges applications dans la modélisation des maladies, la médecine régénérative et le criblage de médicaments.

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Protocol

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REMARQUE : Les détails relatifs à tous les matériaux, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole sont fournis dans la table des matériaux. Des produits équivalents de différents fabricants peuvent être utilisés comme alternatives. Un processus schématique de l’ensemble du protocole est présenté à la figure 1.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Préparation du milieu de culture sIO
    1. Préparez le milieu de culture disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. Stérilisez le milieu de culture en le filtrant à travers une unité de filtration de 0,22 μm.
      REMARQUE : Si le milieu est préparé entièrement dans des conditions stériles dans une hotte de culture cellulaire et que tous les composants sont pré-stérilisés (par exemple, fournis dans des flacons et des flacons stériles), la filtration à travers un filtre de 0,22 μm peut ne pas être strictement nécessaire.
    2. Aliquote 15 mL de milieu préparé dans des tubes de stockage stériles. Réchauffer le milieu aliquote à température ambiante (15 - 25 °C) avant de l’utiliser en culture d’organoïdes.
  2. Décongélation du stock sIO
    1. Décongeler rapidement le bouillon organoïde congelé en 2 minutes à l’aide d’un bain-marie à 37 °C. Transférez la suspension d’organoïdes décongelée dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 150 x g pendant 3 min pour granuler les organoïdes.
    2. Retirez soigneusement le surnageant pour éliminer le DMSO, minimisant ainsi les effets cytotoxiques potentiels.
    3. Ajoutez le milieu et la matrice extracellulaire fraîche (ECM) dans un rapport de 1:4 et pipetez doucement pour assurer une remise en suspension uniforme de la pastille. Distribuer 15 μL par dôme dans chaque puits d’une plaque de 48 puits. Gardez l’ECM sur la glace pour éviter une polymérisation prématurée.
    4. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO2 pendant 1 h pour permettre la polymérisation ECM. Après la polymérisation, ajoutez soigneusement 200 μL de milieu frais dans chaque puits.
      REMARQUE : Ce protocole est compatible avec diverses boîtes d’imagerie commerciales et plaques de puits. Ajustez le volume du support en fonction du type de puits pour vous assurer que le dôme ECM est complètement immergé.
  3. Passage des sIO
    REMARQUE : Les organoïdes ont tendance à adhérer aux pointes de pipette. Pour minimiser l’adhérence, pré-humidifiez les pointes de pipette avec le fluide.
    1. Aspirer le milieu usé. Ajouter 200 μL de solution de récupération cellulaire dans chaque puits et incuber à 4 °C pendant 30 min pour faciliter la dégradation de l’ECM et la récupération des organoïdes.
    2. Prélevez la suspension organoïde par pipetage doux et transférez-la dans un tube de microcentrifugation. Centrifugez à 150 x g pendant 3 min, puis retirez délicatement le surnageant.
    3. (Facultatif) Pour passer en cellules uniques, effectuez l’une des méthodes de dissociation suivantes :
      1. Méthode enzymatique : Ajouter 100 μL de solution de dissociation unicellulaire à la pastille et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 incubateur pendant 1 à 2 min. Ajouter 150 μL de fluide à neutraliser. Effectuez un pipetage ou un tapotement doux. Centrifuger à 150 x g pendant 3 min et retirer le surnageant, en ne laissant que la pastille.
        REMARQUE : Évitez de trop incuber, car une exposition prolongée peut être très préjudiciable aux cellules.
      2. Dissociation mécanique : Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de milieu de culture. À l’aide d’une pipette P200, pipetez de haut en bas de 20 à 30 fois pour dissocier mécaniquement les organoïdes en fragments plus petits ou en cellules uniques. Centrifuger à 150 x g pendant 3 min, puis aspirer le surnageant et retenir la pastille.
    4. Ajoutez le milieu et l’ECM frais dans un rapport de 1:4 et pipetez doucement pour assurer une remise en suspension uniforme de la pastille. Distribuer 15 μL par dôme dans chaque puits d’une plaque de 48 puits.
    5. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 h pour permettre à l’ECM de polymériser.
    6. Après la polymérisation, ajoutez 200 μL de milieu de culture frais dans chaque puits et remplissez les puits extérieurs vides avec du PBS pour éviter l’évaporation. Remplacez le milieu de culture tous les 2-3 jours et passez les organoïdes chaque semaine. Ajustez l’intervalle de passage en fonction de la taille d’organoïde souhaitée.
  4. Traitement médicamenteux
    1. Préparez une solution mère de 10 mM de cisplatine en dissolvant 3,00 mg de poudre de cisplatine (MW ≈ 300,05 g/mol) dans 1 mL de DMSO. Vortex brièvement et protégez la solution de la lumière à l’aide de tubes ambrés ou en les enveloppant de papier d’aluminium.
    2. Pour préparer le milieu de traitement, diluer la matrice de 10 mM de cisplatine 1:1 000 dans un milieu de culture sIO complet pour obtenir une concentration finale de 10 μM de cisplatine et 0,1 % de DMSO.
    3. Pour le contrôle du véhicule, préparer 0,1 % de DMSO dans un milieu de culture pour correspondre à la concentration finale de DMSO sans cisplatine.
    4. Retirez le milieu épuisé des cultures sIO et remplacez-le délicatement par un milieu contenant du cisplatine 10 μM ou un milieu témoin DMSO uniquement.
    5. Après le traitement, transférez les échantillons dans l’incubateur du système d’imagerie.

2. Imagerie holotomographie à faible cohérence à l’aide d’un logiciel d’exploitation

  1. Préparation d’échantillons pour l’imagerie
    1. Distribuer 15 μL de dôme organoïde-ECM sur une boîte d’imagerie à fond de lamelle #1.5 en suivant la procédure décrite aux étapes 1.3.1-1.3.4. Placez chaque dôme dans la parabole aussi près que possible du centre pour une imagerie optimale.
    2. Avant la polymérisation, incuber à température ambiante pendant 1 min pour permettre aux organoïdes de se déposer vers le bas.
    3. Placez la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 h pour polymériser l’ECM. Ensuite, ajoutez doucement suffisamment de milieu de culture pour immerger complètement les organoïdes.
      REMARQUE : Ajustez le volume moyen pour vous assurer que les organoïdes sont complètement immergés en fonction de la taille de la boîte d’imagerie à fond de lamelle.
    4. 5 jours après le passage, laver l’échantillon 2x-3x avec du PBS immédiatement avant l’imagerie pour éliminer les débris et réduire les artefacts optiques.
  2. Configuration de l’imagerie
    1. Allumez le contrôleur environnemental pour maintenir la viabilité de l’échantillon. Le régulateur de chambre ajuste automatiquement la température à 37 °C et la concentration de CO2 à 5 %.
    2. Appuyez sur le bouton de porte situé à l’avant de l’instrument pour ouvrir la porte. Ajoutez de l’eau pour former une fine couche à l’intérieur de la chambre afin d’éviter que le milieu de culture ne se dessèche.
    3. Placez la parabole d’imagerie dans un support de récipient approprié, insérez-la dans la chambre d’imagerie et fixez-la à l’aide d’une goupille pour éviter tout mouvement. Assurez-vous que le plat est fermement fixé au support du récipient sans l’incliner.
    4. Fermez la porte de l’instrument à l’aide du bouton Door pour bloquer les interférences lumineuses externes.
    5. Lancez le logiciel TomoStudio X et connectez-vous. Cliquez sur Démarrer pour ouvrir la fenêtre principale.
    6. Cliquez sur Ajouter un projet dans le coin supérieur gauche et attribuez des paramètres expérimentaux (par exemple, le nom du projet, le type de support, le type d’échantillon, etc.). Le panneau d’échantillons sera créé automatiquement. Assurez-vous que le type de milieu approprié est attribué pour l’utilisation de l’IR approprié dans l’expérience.
    7. Cliquez sur le puits souhaité dans le panneau et cliquez sur Créer en haut pour enregistrer les puits en tant que spécimens.
    8. Cliquez sur Configuration du retour sur investissement dans le coin supérieur droit pour définir la région d’intérêt (ROI) dans l’antenne. Une fois tous les paramètres définis, cliquez sur Exécuter l’expérience dans le coin inférieur droit pour ouvrir la fenêtre d’acquisition d’images.
    9. Cliquez sur Charger le navire dans le coin supérieur droit. Une image en fond clair apparaîtra. Ajustez la position Z à l’aide des boutons +Z et -Z pour faire la mise au point.
    10. Dans l’onglet Imagerie unique, ajustez la taille de la zone d’intérêt. Capturez des organoïdes dans un champ de vision de 160 μm x 160 μm et acquérez des empilements axiaux jusqu’à 140 μm de profondeur. Pour les organoïdes plus grands, acquérez plusieurs tomogrammes RI et assemblez des images en cochant la case Imagerie en mosaïque en bas.
    11. Accédez à l’onglet Time Lapse Imaging pour configurer l’imagerie à long terme. Définissez la durée et l’intervalle de temps selon vos besoins. Dans cette expérience, l’imagerie en accéléré a été réalisée à des intervalles de 10 minutes sur une période de 24 heures, et l’analyse a été effectuée à des intervalles de 2 heures pendant la même durée.
    12. Cliquez sur l’icône Scanner pour capturer l’emplacement actuel du retour sur investissement. Centrez manuellement le dôme ECM à l’aide de l’imagerie en fond clair. Cliquez sur le bouton BF pour régler l’intensité et les valeurs d’exposition de l’imagerie en fond clair.
    13. Sélectionnez ROI en déplaçant la zone ROI qui s’affiche dans le panneau Aperçu. Une fois le retour sur investissement souhaité trouvé, cliquez sur Ajouter un point en bas. La liste des points d’imagerie s’affiche.
    14. Cliquez sur Acquérir pour démarrer l’imagerie. Les données d’image brutes seront acquises.
  3. Acquisition d’images
    REMARQUE : Ce processus génère un fichier commun Tomocube (TCF) à partir de données d’image brutes. Les données d’image brutes doivent être traitées dans un fichier TCF, qui contient plusieurs types d’images, tels qu’un tomogramme RI et une projection d’intensité maximale. Le tomogramme RI représente la distribution RI 3D de l’échantillon, et la projection d’intensité maximale montre la valeur RI la plus élevée pour chaque position latérale dans le plan XY.
    1. Faites glisser et déposez des fichiers d’image brute sur le serveur de traitement HTX. Cliquez sur Traiter pour générer un fichier TCF à partir du fichier d’image brute.
    2. Pour afficher les tomogrammes IR générés dans le fichier TCF, utilisez TomoAnalysis Viewer, MATLAB ou Python. Pour afficher un fichier TCF dans MATLAB, utilisez des fonctions telles que h5info et h5read. De même, en Python, utilisez le package h5py pour lire les fichiers H5.

3. Analyse d’images

  1. Segmentation d’images basée sur l’apprentissage automatique
    1. Exportez le fichier image TCF au format HDF5 (Supplementary Coding File 1) pour vous assurer que les données sont dans un format multidimensionnel compatible avec ilastik.
    2. Ouvrez ilastik et accédez à Classer > nouveau projet. Sélectionnez Classification des pixels dans la section Workflows de segmentation. Enregistrez le fichier de projet dans un répertoire désigné.
    3. Chargez le fichier HDF5 en accédant à 1. Onglet Données d’entrée. Cliquez sur Ajouter un nouveau fichier, sélectionnez le jeu de données H5 approprié et assurez-vous que les canaux d’image corrects sont attribués.
    4. Naviguez jusqu’à 2. Onglet Sélection de fonctionnalités pour sélectionner les caractéristiques pertinentes (Couleur/Intensité, Bord, Texture) pour optimiser la segmentation.
      REMARQUE : La sélection des fonctionnalités peut varier en fonction de l’ensemble de données et des caractéristiques de l’image. Pour l’analyse actuelle, les caractéristiques sélectionnées comprenaient : Couleur/Intensité (σ = 1,60), Bord (σ = 3,50) et Texture (σ = 1,60). Une optimisation basée sur une approche heuristique peut être nécessaire en fonction de la complexité de l’image. Alternativement, la fonction Suggérer des fonctionnalités > Exécuter la sélection de fonctionnalités dans ilastik peut être utilisée pour identifier un ensemble optimal de paramètres.
    5. En 3. Onglet d’entraînement, étiquetez les régions organoïdes et non organoïdes en appliquant des coups de pinceau de couleurs distinctes. Pour améliorer la fidélité de la segmentation, annotez soigneusement les régions autour des limites.
    6. Cliquez sur Mise à jour en direct pour prévisualiser les résultats de la segmentation et apporter des améliorations si nécessaire.
    7. Naviguez jusqu’à 4. Exportation de prédiction. Dans la sélection de la source, choisissez Segmentation simple pour exporter les prédictions étiquetées. Cliquez sur Exporter tout, en vous assurant que le format de sortie est défini sur .h5 ou .tiff, en fonction des exigences d’analyse en aval.
  2. Analyse quantitative des caractéristiques
    REMARQUE : cette étape de protocole est exécutée dans MATLAB, chaque procédure étant détaillée dans le Supplementary Coding File 2.
    1. En combinant le tomogramme RI avec l’image du masque, créez une image RI masquée qui inclut uniquement la région organoïde.
    2. À l’aide de l’image RI masquée, calculez des paramètres quantitatifs tels que le volume des organoïdes, la densité des protéines et la teneur en protéines.
      1. Volume : calculez le volume total de l’organoïde en multipliant le nombre de pixels dans le masque segmenté par la résolution de pixel pour X, Y et Z. Calculez le nombre de pixels en comptant toutes les valeurs de voxel dans le tableau de masques étiquetés par organoïde, à l’aide de la fonction MATLAB intégrée Sum.
        REMARQUE : La résolution en pixels est déterminée par le système d’imagerie et se trouve sous Données > groupe d’attributs 3D au sein de la structure HDF5.
      2. Densité protéique : Calculez la densité protéique en soustrayant la valeur moyenne de l’AR de l’organoïde moyen et en la divisant par l’incrément de l’indice de réfraction des protéines.
        1. Indice de résistance du milieu : Mesurer l’indice de résistance du milieu environnant à l’aide d’un réfractomètre avant l’analyse.
        2. Valeur moyenne de l’IR : Déterminez l’IR moyen de l’organoïde en faisant la moyenne des valeurs de l’IR des voxels situés dans le masque d’organoïde.
        3. Augmentation de l’indice de réfraction des protéines (α) : Utilisez une constante empirique précédemment rapportée dérivée d’études d’augmentation de l’indice de réfraction.
      3. Teneur en protéines : Calculer la teneur totale en protéines en multipliant le volume déterminé à l’étape 3.2.2.1 par la densité protéique obtenue à l’étape 3.2.2.2.

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Results

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La figure 1 illustre le flux de travail schématique pour l’imagerie 4D et l’analyse quantitative des sIO. Ce protocole permet une imagerie en direct continue et une évaluation complète des sIO par le biais d’un processus en quatre étapes : culture, imagerie 4D, traitement d’images et analyse quantitative (Figure 1D).

Après une période d’incubation de 5 jours, les sIO matures ont été transférés dans des boîtes d’imagerie à fond de lame...

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Discussion

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L’holotomographie représente une approche puissante pour l’imagerie haute résolution sans marquage d’organoïdes vivants, surmontant de nombreux défis associés aux techniques d’imagerie conventionnelles. Dans ce protocole, nous décrivons une méthodologie complète pour appliquer la HT à faible cohérence à la recherche sIO, permettant une visualisation quantitative en temps réel de la morphologie des organoïdes, de la dynamique de croissance et des réponses au traitement médicamenteux. L’in...

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Disclosures

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M.J.L., J.H.L., S.M.L. et Y.K.P. ont des intérêts financiers dans Tomocube Inc., une société qui commercialise des instruments d’holotomographie et d’imagerie de phase quantitative.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée financée par le gouvernement coréen (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), l’Institut coréen pour l’avancement de la technologie (KIAT) par le biais du programme international de R&D coopérative (P0028463), et la subvention du Fonds coréen pour la médecine régénérative (KFRM) financée par le gouvernement coréen (le ministère des Sciences et des TIC et le ministère de la Santé et du Bien-être) (21A0101L1-12). L’acquisition des données a été effectuée par M.J.L. et J.H.L., J.H.L. étant responsable du traitement des données et J.M.C. de l’analyse des données. Tous les auteurs ont contribué à la rédaction du manuscrit. Nous remercions ChulMin Oh et Chungha Lee pour leurs précieuses discussions techniques et leur aide à la préparation des figures.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plaque à 48 puits  ;Corning3548Plat de culture
Solution de récupération cellulaire  ;Corning354253Dégradation du matrigel  ;
CisplatineSupelcoPHR1624N/A
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650Véhicule
Tube EppendorfCorningMCT-175-C-SN/A
Serveur de traitement HTXTomocube Inc., CoréeN/AServeur de traitement des données
HT-X1Tomocube Inc., CoréeN/ALogiciel d’exploitation
IlastikN/AN/ABoîte à outils de segmentation basée sur l’apprentissage automatique
Support de récipient de parabole d’imagerie  ;Tomocube Inc., CoréeN/APorte-parabole d’imagerie
Milieu de croissance organoïde IntestiCult (souris)STEMCELL Technologies#06005Milieu de culture préfabriqué disponible dans le commerce  ;
MatlabMathWorksMatlab 2024aLogiciel de traitement d’images
MatrigelCorning356231ECM pour organoïdes 3D
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Organoïdes intestinaux de sourisSTEMCELL Technologies#70931N/A
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TomoStudio XTomocube Inc., CoréeN/ALogiciel d’imagerie
TrypLEGibco12604Dissociation unicellulaire

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