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Germination asymbiotique et régénération par explant foliaire de l’orchidée médicinale en voie de disparition Hemipilia cucullata à partir de graines matures

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DOI :

10.3791/68541

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19 septembre 2025

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1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour optimiser la germination asymbiotique des graines, le développement des plantules et l’élongation des pousses chez Hemipilia cucullata. Le protocole permet également l’induction de corps ressemblant à des protocormes à partir d’explants de feuilles stériles, facilitant ainsi une multiplication in vitro efficace pour la conservation et l’utilisation durable de cette orchidée médicinale en voie de disparition.

Résumé

Hemipilia cucullata (Orchidaceae) est une orchidée terrestre largement appréciée pour ses propriétés médicinales et son attrait ornemental, mais ses populations sauvages sont menacées en raison de la dégradation de l’habitat, de la faible viabilité des graines et du succès limité de la pollinisation. Pour soutenir sa conservation et son utilisation durable, cette étude a développé un protocole optimisé pour la germination asymbiotique des graines matures, le développement du protocorme, l’élongation des pousses et l’induction du corps de type protocorme (PLB) à partir d’explants de feuilles stériles. Les graines cultivées dans un milieu liquide 1/2 MS complété par 0,5 mg/L d’ANA ont montré un taux de germination de 72 ± 6 %, significativement plus élevé que le milieu témoin (46 %) et solide (31 %), la germination commençant environ 21 jours plus tôt en culture liquide. Les protobulbes ont été sous-cultivés sur un milieu B5 contenant 0,5 mg/L d’AB, 0,2 mg/L d’ANA et 100 mL/L d’eau de coco, ce qui a permis une prolifération efficace. Après 5 à 6 semaines, les plantules ont été transférées dans un milieu d’élongation des pousses (B5 complété par 0,5 mg/L de BA et 1 mg/L d’ANA), où elles ont présenté une élongation robuste des pousses et une formation de feuilles saines. Pour l’induction par PLB, le taux d’induction le plus élevé (44,3 ± 5,1 %) a été atteint sur un milieu MS contenant de l’AB (3 mg/L) et de l’ANA (0,2 mg/L). Ce protocole complet et reproductible peut constituer une plate-forme efficace pour la propagation à grande échelle et la conservation ex situ de H. cucullata, offrant un soutien précieux aux efforts de rétablissement de cette orchidée en voie de disparition.

Introduction

Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng & T.Yukawa, communément appelée orchidée néottianlée, est une orchidée terrestre sauvage originaire de l’Eurasie tempérée et est largement répandue de la Pologne au Japon1. Initialement classée dans le genre Neottianthe, cette espèce a récemment été réaffectée au genre Hemipilia, section Neottianthe, sur la base de preuves moléculaires2. La plante pousse à partir de tubercules souterrains et atteint jusqu’à 30 cm de hauteur, produisant des fleurs rosâtres ou rouge pourpre disposées en un épi unilatéral. En raison de la forme élégante et de la coloration attrayante de ses fleurs, il possède une valeur ornementale importante. De plus, la plante entière est reconnue comme une plante médicinale dans plusieurs pays, où elle est largement utilisée à diverses fins thérapeutiques, notamment le traitement des affections cardiaques, l’amélioration de la circulation sanguine, le soulagement des ecchymoses et la promotion de la guérison des fractures 3,4. Des études phytochimiques récentes ont identifié plusieurs anthocyanes chez cette espèce, telles que la cyanidine 3-oxalylglucoside, la chrysanthémine et la cyanine, qui possèdent des propriétés antioxydantes et vasoprotectrices et peuvent contribuer à ses effets médicinaux 5,6.

À l’heure actuelle, les populations sauvages de H. cucullata sont menacées par la perte d’habitat et les perturbations environnementales, ce qui entraîne de graves déclins de la population et, dans certaines régions, rapproche l’espèce de l’extinction 3,7,8. Cependant, la conservation de cette espèce est particulièrement difficile en raison des difficultés de sa propagation naturelle. Dans la nature, H. cucullata se reproduit à la fois par clonage et par voie sexuée, mais les deux modes sont inefficaces. La multiplication clonale naturelle est lente et peu fréquente, tandis que la reproduction sexuée est limitée par un faible succès de pollinisation et une faible viabilité des graines 9,10. De plus, les enquêtes sur le terrain ont révélé une structure d’âge nettement déséquilibrée, avec une rareté des individus juvéniles et un recrutement naturel limité, en particulier dans des conditions de stress anthropique ou pyrogène 7,8,11. Les graines de H. cucullata, comme de nombreuses orchidées, sont minuscules, dépourvues d’endosperme et nécessitent des partenaires fongiques spécifiques pour la germination, ce qui complique encore la régénération naturelle. Par conséquent, malgré sa large répartition géographique, la taille de la population et la structure d’âge des populations sauvages sont en déclin, et les risques d’extinction locale augmentent7. Par conséquent, la mise en place d’une méthode efficace de propagation artificielle rapide est essentielle à la fois pour la conservation des ressources en matériel génétique et pour l’utilisation durable de cette espèce d’orchidée.

Parmi les techniques de propagation disponibles, la germination symbiotique - reposant sur l’association avec des champignons mycorhiziens d’orchidées - peut simuler étroitement les processus naturels, mais est souvent difficile à normaliser en raison de sa dépendance à l’égard de partenaires fongiques spécifiques à l’espèce. En revanche, la germination asymbiotique offre une alternative plus simple et plus reproductible qui est largement utilisée dans les systèmes de culture tissulaire d’orchidées15. Bien que des protocoles de germination asymbiotique et de propagation rapide aient été développés pour plusieurs orchidées médicinales telles que Bletilla, Dendrobium et Cypripedium 16,17,18,19, l’optimisation spécifique à l’espèce des milieux de culture et des conditions de culture tissulaire pour H. cucullata est encore nécessaire.

Dans cette étude, nous avons utilisé des graines matures de H. cucullata obtenues par pollinisation croisée manuelle d’individus sauvages (Figure 1A) au mont Tianmu dans l’est de la Chine (30°20′ N, 119°22′ E) afin d’établir et d’optimiser un protocole efficace pour la germination asymbiotique des graines, le développement des semis et l’élongation des pousses. De plus, nous avons développé un système de régénération à partir d’explants de feuilles via l’induction de PLB, contribuant ainsi à la conservation et à la culture de cette orchidée médicinale en voie de disparition.

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Protocole

REMARQUE : Avant de commencer l’expérience, portez un équipement de protection individuelle, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Effectuer toutes les procédures sous une hotte à flux laminaire pour la stérilité. Manipulez l’éthanol et l’hypochlorite de sodium avec prudence et éliminez les déchets conformément aux règlements de sécurité du laboratoire.

1. Stérilisation des gélules et extraction des graines

  1. Placez la capsule dans un bécher. Ajoutez 1 à 2 gouttes de détergent et rincez abondamment à l’eau du robinet pour éliminer les contaminants de surface.
  2. Lavez la capsule à l’eau courante pendant 5 min. Absorbez l’eau de surface avec du papier absorbant stérile.
  3. Transférez la capsule sur un établi stérile pour une désinfection supplémentaire.
  4. Plongez la capsule dans de l’éthanol à 75 % (v/v) pendant 30 s.
  5. Stérilisez la capsule en l’immergeant dans 50 mL d’une solution d’hypochlorite de sodium à 20 % (v/v) (diluée à partir d’un agent de blanchiment commercial contenant ~5 % de chlore disponible), avec l’ajout de 2 gouttes de détergent à vaisselle domestique non dilué pendant 10 à 12 min.
  6. Rincez la capsule cinq fois avec de l’eau distillée stérile pour éliminer le désinfectant résiduel.
  7. À l’aide d’un scalpel stérile, prélever environ 1 mm de l’apex et de la base (extrémité du pédicelle) de la capsule.
  8. Faites une petite incision à l’extrémité supérieure de la capsule pour exposer les graines. Placez la capsule dans une boîte de Pétri stérile pour l’extraction des graines.

2. Préparation du milieu de culture

  1. Préparer 1/2 milieu liquide MS : Utiliser la moitié des concentrations en macronutriments du milieu MS standard, conserver tous les autres composants comme dans le milieu MS, ajouter 20 g/L de saccharose et d’acide α-naphtalèneacétique (NAA, 0,5 mg/L) et ajuster le pH à 5,8.
  2. Après ébullition, versez immédiatement le milieu dans des flacons de culture de 500 mL (le nombre de flacons peut être ajusté en fonction de l’échelle de propagation souhaitée).
  3. Placez le milieu distribué dans un autoclave et stérilisez à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, retirez le milieu de l’autoclave et laissez-le refroidir à température ambiante avant de l’utiliser.

3. Germination des graines

  1. À l’aide d’une pince stérile, dispersez uniformément environ 500 à 600 graines dans chaque bouteille de milieu (préparée à l’étape 2.3). Laissez les graines absorber l’eau et se déposer au fond du milieu liquide.
  2. Maintenir les cultures à 25 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une intensité lumineuse de 36 μmol·m-2·s-1.
  3. Observez la germination des graines chaque semaine, notez les changements morphologiques et prenez des photos pour documenter.
  4. Après environ 12 semaines, lorsque la plupart des graines ont germé, comptez le nombre de graines germées et calculez le taux de germination. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélevez au hasard une boucle de milieu liquide contenant des graines. Transférez les graines échantillonnées dans une boîte de Pétri ou une lame de verre et observez au stéréomicroscope.
  5. Comptez le nombre de graines qui ont formé des protobulbes au fur et à mesure de la germination. Calculez le taux de germination à l’aide de la formule suivante :
    Taux de germination ( %) = (Nombre de graines germées/Nombre total de graines dans l’échantillon) × 100.

4. Sous-culture et prolifération du protocorme

  1. Préparez le milieu de prolifération en complétant le milieu B5 (3,21 g/L) avec de l’eau de coco (100 mL/L), de la 6-benzylaminopurine (BA, 0,5 mg/L) et de l’ANA (0,2 mg/L). Ajoutez 20 g/L de saccharose et 7,3 g/L de gélose et ajustez le pH à 5,8.
  2. Après ébullition, versez immédiatement le milieu dans des bouteilles de culture de 150 ml (le nombre de bouteilles peut être ajusté en fonction de l’échelle de propagation souhaitée).
  3. Placez le milieu distribué dans un autoclave et stérilisez à 121 °C pendant 15 min. Laissez le fluide refroidir à température ambiante avant de l’utiliser.
  4. Transvaser de manière aseptique 10 à 15 protobulbes germés (de 0,3 à 1 cm) par bouteille sur le milieu de culture préparé à l’étape 4.3.
  5. Après une période de culture de 5 semaines, évaluez l’état de prolifération et notez le nombre de protobulbes nouvellement formés par bouteille.
  6. Poursuivre l’élevage des protobulbes proliférés pendant 4 à 6 semaines supplémentaires pour permettre le développement en plantules avec un apex de pousse visible et des structures semblables à des rhizoïdes avant le transfert pour l’élongation des pousses.
    REMARQUE : Maintenir les cultures à 25 °C, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une intensité lumineuse de 36 μmol·m-2·s-1.

5. Allongement de la pousse

  1. Préparez le milieu pour l’élongation des pousses en complétant le milieu B5 (3,21 g/L) avec de l’AB (0,5 mg/L) et de l’ANA (1 mg/L). Ajoutez 20 g/L de saccharose et 7,3 g/L de gélose et ajustez le pH à 5,8.
  2. Après ébullition, répartissez le milieu dans des flacons de culture de 150 mL (le nombre de flacons peut être ajusté en fonction de l’échelle de propagation souhaitée).
  3. Choisir des plantules saines (de 1 à 2 cm, sans noircissement évident ni jaunissement complet) pour l’élongation des pousses. À l’aide d’une pince stérilisée et refroidie, transvaser de manière aseptique de 8 à 12 plantules dans chaque bouteille de culture de 150 mL contenant du milieu frais préparé à l’étape 5.1. Assurez-vous que les plantules sont uniformément réparties dans chaque bouteille.
  4. Après une période d’élongation des pousses de 5 semaines, sélectionnez les plantules avec des pousses complètement développées et des feuilles saines pour l’échantillonnage des explants de feuilles.
    REMARQUE : Maintenir les cultures à 25 °C, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une intensité lumineuse de 36 μmol·m-2·s-1.

6. Induction de PLB à partir d’explants de feuilles

  1. Préparez le milieu d’induction des PLB en complétant le milieu de base MS (4,43 g/L) avec du BA (3 mg/L) et du NAA (0,2 mg/L). Ajoutez 20 g/L de saccharose et 7,3 g/L de gélose et ajustez le pH à 5,8.
  2. Après ébullition, répartissez le milieu dans des flacons de culture de 150 mL (le nombre de flacons peut être ajusté en fonction de l’échelle de propagation souhaitée).
  3. Sélectionner des plantules saines après 5 semaines d’élongation des pousses (étape 5.4). Exciser les feuilles stériles complètement expansées, enlever la région apicale et les marges, et couper chaque feuille en segments d’environ 0,5 cm × 0,5 cm à l’aide d’un scalpel stérile dans des conditions aseptiques.
  4. Placez les 10 segments de feuilles sur le milieu d’induction PLB avec la surface adaxiale vers le haut, en assurant un contact ferme avec la surface du support.
  5. Après 5 semaines de culture, évaluer le nombre de PLB induites avec succès et calculer le taux d’induction ( %). De plus, notez la hauteur moyenne des bourgeons (cm) et le nombre de bourgeons formés par explantation.
    REMARQUE : Maintenir les cultures à 25 °C, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une intensité lumineuse de 36 μmol·m-2·s-1.

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Résultats

Les étapes du protocole présentées dans cette étude représentent la méthodologie optimisée développée par une série d’expériences comparatives visant à améliorer la germination asymbiotique des graines, la prolifération des protocormes, l’élongation des pousses et l’induction de la PLB chez H. cucullata. Par exemple, dans la sélection des régulateurs de croissance pour favoriser la germination des graines, l’ANA améliore le développement de l’embryon et l’absorption d’eau, tandis que l’AB favorise la différencia...

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Discussion

Les capsules d’orchidées contiennent généralement de nombreuses graines, dépassant souvent dix mille, mais leur germination naturelle est extrêmement limitée en raison de l’absence d’endosperme et de leur forte dépendance aux associations fongiques symbiotiques et aux signaux environnementaux spécifiques20. Des protocoles de germination asymbiotiques ont donc été largement adoptés pour contourner ces limitations et permettre une propagation efficace des semis dans...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1/2 MS Sels de base avec vitaminesCoolaberRéf. PM1061
6-BenzylaminopurineShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.1214-39-7
Puissance de l’agarBeijing Chembase Technology Co., Ltd.1400
Banc propreSuzhou Purification Equipemnt Co., Ltd.SW-CJ-2G
Eau de cocoBON AGRICULTEURhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
DétergentLiby Science et technologie6920174756784
Gamborg B5 MediumLaboratoires PhytoTechnologyG398
Bouteille en verreMorebetter Biotechnology Co., Ltd.MBT-BL-240
Murashige & Sels de base SkoogLaboratoires PhytoTechnologyM519
PipetteEppendorf3123000268
Balance de précisionMETTLER TOLEDO30834109
SPSSInternational Business Machines CorporationLogiciel utilisé pour les tests de signification statistique
SaccharoseSinopharm chemical Reagent Co., Ltd.20210802
ThidiazuronShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.51707-55-2
Acide &alpha ;-naphtalèneacétiqueShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.86-87-3

Références

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Mots-clés

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